Taxonomic status of the Tyulek virus (TLKV) (Orthomyxoviridae, Quaranjavirus, Quaranfil group) isolated from the ticks Argas vulgaris Filippova, 1961 (Argasidae) from the birds burrow nest biotopes in the Kyrgyzstan

Full Text

Введение Прототипный штамм LEIV-152Arg вируса Тюлёк (TLKV - Tyulek virus) изолирован из клещей Argas vulgaris Filippova, 1961 (Argasidae), собранных в 1978 г. в норовых биотопах с поливидовыми колониями птиц в пойме реки Ак-Су в окрестностях поселка Тюлёк Московского района, в северной части Чуйской долины в Киргизии (43 с. ш., 74 в. д.) [1-3]. Позднее (в 1981, 1984 и 1986 гг.) было изолировано еще 42 штамма TLKV [4]. По данным предварительного изучения TLKV был отнесен к группе Кваранфил сем. Orthomyxoviridae [5-10]. В 2013 г. группа Кваранфил, включающая вирусы Кваранфил (QRFV - Quaranfil virus), Атолл Джонстон (JAV - Johnston Atoll virus) и Озеро Чад (LCV - Lake Chad virus), выделена в самостоятельный род Quaranjavirus в составе сем. Orthomyxoviridae. QRFV и другие вирусы рода Quaranjavirus изолировали в ЮАР, Нигерии, Египте, Иране, Афганистане и Океании от аргасовых (Argasidae) клещей Argas arboreus Kaiser, Hoog-straal et Kohls, 1964, A. vulgaris Filippova, 1961, A. hermannii Audouin, 1827 - облигатных паразитов птиц [10-13]. Сем. Orthomyxoviridae объединяет оболочечные вирусы (80-120 нм) с сегментированным РНК-геномом отрицательной полярности. В семейство входят пять родов, из которых три представлены вирусами гриппа (Influenza A virus, Influenza B virus, Influenza C virus) и передаются респираторным путем. В род Isavirus входят два вида вируса инфекционной анемии лососей, основной путь передачи которых водный. Вирусы родов Thogotovirus и Quaranjavirus являются арбовирусами, т.е. передаются членистоногими переносчиками, в основном клещами. При этом вирусы рода Thogotovirus преимущественно связаны с иксодовыми (Ixodidae) клещами, а вирусы рода Quaranjavirus, включая TLKV, - с аргасовыми (Argasidae). Геном ортомиксовирусов представлен от шести (Thogotovirus и Quaranjavirus) до восьми (Influenza A virus и Influenza B virus) сегментами РНК отрицательной полярности длиной от 740 до 2400 н.о. [9]. В настоящей работе с использованием технологии полногеномного секвенирования (next-generation sequencing) определена полная последовательность генома TLKV. На основе проведенного молекулярногенетического и филогенетического анализа показано, что TLKV является новым вирусом рода Quaranjavirus сем. Orthomyxoviridae. Материалы и методы Вирусные штаммы. Работы с инфекционным материалом, связанные с получением и накоплением вируса, проводили в боксовых помещениях, оборудованных и сертифицированных для работы с микроорганизмами II группы патогенности. Использованный в работе TLKV (штамм LEIV-152Arg) получен из Государственной коллекции вирусов РФ при ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России в виде лиофилизированной мозговой суспензии. Для накопления вируса лиофилизированную суспензию восстановили в 1 мл культуральной среды ДМЕМ (с добавлением антибиотика) и использовали для интрацеребрального заражения новорожденных беспородных белых мышей. После развития симптомов поражения ЦНС (2-3 сут) мышей забивали в соответствии с правилами содержания и использования лабораторных животных. Выделение РНК. Фрагменты мозга (около 30 мг) помещали в 1 мл реагента TRIzol (Life Technology, США) и гомогенизировали пластиковым пестиком. Далее выделяли РНК согласно прилагаемой инструкции производителя данного реагента. Конечный осадок суммарной РНК растворяли в 100 мкл DEPC-обработанной воды. Для дополнительной очистки, а также для удаления низкомолекулярных фракций рибосомальной (5 S) и транспортной РНК полученный препарат очищали набором «Rneasy mini kit» (QIAGEN, Германия) в режиме clean-up на автоматической станции QIAcube (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией. Концентрацию РНК измеряли с использованием флюориметра Qubit (Invitrogen, США). Для удаления рибосомальной (18 S и 28 S) РНК использовали набор «GenRead rRNA depletion Kit» (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией. Для этого брали не более 3 мкг суммарной РНК. Эффективность деплеции достигала 50-80%, и, таким образом, количество полученной РНК для дальнейшего анализа составило около 300 нг. Подготовка ДНК-библиотек и секвенирование. Для получения кДНК около 100 нг деплецированной РНК фрагментировали в 15 мкл реакционной смеси для обратной транскриптазы с гексапраймером при 85°С в течение 5 мин, после чего помещали в лед. К фрагментированной РНК добавляли 200 ед. фермента RevertAid Premium (Thermo Scintific, США) и 20 ед. ингибитора РНаз RNasin (Promega, США). Инкубировали при 25°С 10 мин, далее при 42°С 60 мин. Реакцию останавливали прогреванием при 70°С 10 мин. Синтез второй цепи кДНК проводили с использованием набора «NEBNext® mRNA Second Strand Synthesis Module» (NEB, США) в соответствии с инструкцией. Полученную дцДНК очищали, используя набор «MinElute PCR Purification Kit» (QIA-GEN, Германия), на автоматической станции QIAcube. Для получения ДНК-библиотек из дцДНК использо 29 Уровень дивергенции между нуклеотидными (верхняя правая часть таблицы) и аминокислотными (нижняя левая часть таблицы) последовательностями белка GP (HA у вирусов гриппа) и PB1 вирусов сем. Orthomyxoviridae GP (HA) уровень дивергенции, % 1 23456789 10 Quaranjavirus Тюлек LEIV-152Arg 1 0,28 0,33 0,67 0,65 0,60 0,74 0,68 0,75 0,71 Кваранфил 2 0,20 0,32 0,67 0,66 0,61 0,75 0,70 0,76 0,69 Атолл Джонстон 3 0,31 0,27 0,65 0,64 0,60 0,75 0,68 0,74 0,72 Thogotovirus Баткен LEIV-306K 4 0,82 0,85 0,82 0,20 0,59 0,71 0,72 0,74 0,74 Дхори 1313/61 5 0,85 0,87 0,85 0,09 0,60 0,73 0,73 0,74 0,73 Тогото 6 0,82 0,81 0,81 0,71 0,71 0,73 0,68 0,71 0,73 Infuenza A virus Вирус гриппа А 7 0,91 0,92 0,95 0,89 0,90 0,90 0,61 0,72 0,71 Infuenza B virus Вирус гриппа В 8 0,94 0,95 0,94 0,93 0,93 0,89 0,79 0,67 0,68 Infuenza C virus Вирус гриппа С 9 0,95 0,95 0,93 0,93 0,93 0,90 0,88 0,89 0,69 Isavirus Вирус инфекционной анемии лососевых 10 0,95 0,92 0,95 0,92 0,92 0,92 0,91 0,90 0,90 PB1 (сегмент 3) Quaranjavirus Тюлёк LEIV-152Arg 1 0,25 0,28 0,60 0,61 0,63 0,64 0,62 0,63 0,65 Кваранфил 2 0,14 0,26 0,60 0,63 0,63 0,64 0,62 0,63 0,65 Атолл Джонстон 3 0,16 0,17 0,61 0,6 20,62 0,65 0,62 0,63 0,64 Thogotovirus Баткен LEIV-306K 4 0,75 0,76 0,76 0,16 0,37 0,57 0,56 0,59 0,64 Дхори 1313/61 5 0,79 0,79 0,79 0,04 0,39 0,59 0,59 0,59 0,65 Тогото 6 0,79 0,78 0,78 0,37 0,39 0,60 0,60 0,59 0,67 Infuenza A virus Вирус гриппа А 7 0,76 0,75 0,76 0,69 0,73 0,74 0,39 0,51 0,65 Infuenza B virus Вирус гриппа В 8 0,75 0,74 0,76 0,70 0,74 0,74 0,39 0,49 0,64 Infuenza C virus Вирус гриппа С 9 0,77 0,78 0,78 0,73 0,75 0,75 0,61 0,60 0,64 Isavirus Вирус инфекционной анемии лососевых 10 0,81 0,81 0,81 0,85 0,85 0,85 0,83 0,83 0,82 вали набор «TruSeq DNA Sample Prep Kits v2» (Illumi-na, США) в соответствии с инструкцией. Для селекции ДНК по размеру использовали реагент «Ampure XP» (Beckman Coulter, США) с расчетом получения ДНК-библиотек длиной более 270 н.о., что соответствует размеру вставки около 150 н.о. Данные требования к размеру ДНК-библиотек связаны с использованием для секвенирования набора, позволяющего секвени-ровать не более 150 н.о. в одну сторону. Полученные библиотеки визуализировали на станции автоматического электрофореза «QIAxcel Advanced System» (QIAGEN, Германия). Молярность полученных библиотек измеряли методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (2х SsoFast EvaGreen Supermix (BioRad, США) на приборе Bio-Rad CFX1000) согласно рекомендациям, изложенным в руководстве «Sequencing Library qPCR Quantification Guide» (Illumina, США). Секвенирование ДНК-библиотек осуществляли на приборе MiSeq (Illumina, США) с помощью набора «MiSeq Reagent Kits V2 (300PE)» в соответствии с инструкцией производителя. Биоинформационный анализ. Обработку данных полногеномного секвенирования, сборку контигов и картирование ридов проводили, используя программу «CLC Genomics Workbench 6.0» (CLC bio, США). Предварительный поиск гомологичных последовательностей проводили с применением сервиса BLASTX (http://blast. ncbi.nlm.nih.gov). Для анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей использовали пакет программ «Lasergene Core Suite» (DNAstar, США). Выравнивание последовательностей проводили по алгоритму ClustalW. Филогенетический анализ и построение дендрограмм осуществляли с помощью программы MEGA5 по методу ближайшего соседа (neighbor-joining) с 500-кратным бутстреп-тестированием. Результаты и обсуждение В результате проведенного полногеномного секве-нирования и анализа полученных данных определили практически полные последовательности генома TLKV. Анализ данных провели с использованием сервиса BlastX с ограничением поиска по таксону viruses (taxid:10239). Геном TLKV так же, как и геном других вирусов рода Quaranjavirus, состоит из шести сегментов. Сегменты 1-3 кодируют белки репликативнополимеразного комплекса (PB2, PA и PB1 соответственно). Гомология TLKV с QRFV и JAV по белку PB1 на аминокислотном уровне составляет 86 и 84% соответственно. Белок PB1 (РНК-зависимая РНК-полимераза, RdRp) является одним из наиболее консервативных белков у РНК-вирусов с сегментированным геномом. Между вирусами разных родов в семействе Orthomyxo-viridae гомология аминокислотных последовательностей PB1 составляет в среднем 25-30% (см. таблицу). При этом уровень гомологии внутри функциональных доменов RdRp (мотивы pre-A, A, B, C, D и E) достигает 40-50%. Результаты филогенетического анализа, проведенного на основе сравнения содержания белка PB1 ортомиксовирусов, представлены на рисунке, а. Другие белки полимеразного комплекса (PB2 и PA) TLKV обладают около 70% гомологии с QRFV. Поверхностный гликопротеид GP (гемагглютинин, сегмент 5) TLKV и QRFV практически не обладает сходством с поверхностным, гомологичным белком (HA) вирусов гриппа (см. таблицу). Однако белок GP вирусов рода Quaranjavirus имеет определенное сходство с поверхност 30 Филогенетический анализ вирусов семейства Orthomyxoviridae на основе белка PB1 (сегмент 3) (а) и оболочечного белка GP (HA у вирусов гриппа) (б). ным гликопротеидом бакуловирусов [9]. С вирусами рода Thogotovirus гомология TLKV и QRFV по белку GP составляет около 20%. Уровень гомологии белка GP между TLKV и QRFV достигает 72 и 80% по нуклеотидной и аминокислотной последовательностям соответственно. Два других сегмента генома (сегменты 4 и 6) TLKV и QRFV кодируют два протеина, функция которых точно не известна. Сегмент 4 TLKV имеет одну открытую рамку считывания и кодирует протеин длиной 524 а. о. Его гомология между TLKV и QRFV составляет 85%. Сегмент 6 кодирует протеин длиной 266 а.о., который также не обладает гомологией ни с одним из белков, депонированных в базу данных GenBank. Гомология данного протеина у TLKV и QRFV достигает 60%. Вероятно, данные протеины являются структурными белками нуклеокапсида (N) и матриксным белком (М) соответственно, однако в настоящее время их функция точно не определена. На рисунке, б представлены результаты филогенетического анализа белковых последовательностей поверхностного гликопротеида (GP и HA) вирусов семейства Orthomyxoviridae. Так же, как и при филогенетическом анализе, проведенном на основе белка PB1K, TLKV группируется с вирусами QRFV и JAV в составе рода Quaranjavirus. Таким образом, согласно результатам проведенного филогенетического анализа TLKV является новым представителем рода Quaranjavirus. Антитела (АТ) к QRFV находили у людей в 2,6%, у верблюдов в 8,8%, у буйволов в 22,2%, у свиней в 12%, у собак в 7%, у ослов в 8%. Описаны случаи лихорадки Кваранфил у людей, сопровождающейся лихорадкой, прострацией с благоприятным исходом. Два штамма QRFV изолированы от детей, покусанных клещами в де ревне Кваранфил в Египте, по имени которой назван вирус [7, 9]. Природные очаги TLKV в Киргизии (43° с. ш.) находятся на северной границе ареала аргасовых клещей, ограниченного изолинией длительности безморозного периода 150-180 дней в году и среднесуточной температурой выше 20°C не менее 90-100 дней в году [14-17]. Адаптация ряда вирусов к аргасо-вым клещам существенно облегчает возможность переживания вирусной популяции в зимнее время и в засушливые периоды. Их способность к длительному голоданию (до 9 лет, срок наблюдения), продолжительность жизненного цикла (до 25-30 лет), полифагия, способность к трансстадийной и трансовариальной передаче, специфика как подстерегающих кровососов обеспечивают стойкость природных очагов [2, 3, 5]. У птиц, обитающих в норах, из которых были добыты зараженные вирусом клещи A. vulgaris, выявлены комплементсвя-зывающие АТ к TLKV. Но TLKV не удалось изолировать от птиц, иксодовых клещей и комаров, что свидетельствует о его высокой сте-нобионтности. Из того же биотопа из клещей A. vulgaris были изолированы также флавивирусы Соку-лук (SOKV - Sokuluk virus) и клещевого энцефалита (TBEV - tick-borne encephalitis virus) [2, 3, 15-17]. Изоляцию TLKV в Киргизии и изучение его экологии проводили в рамках Программы по биобезопасности и выявления биологического разнообразия в различных экосистемах Северной Евразии, а также для пополнения базы данных Государственной коллекции вирусов РФ [18-22].

References

Supplementary files