Таксономический статус вируса Тюлёк (TLKV-Tyulek) (Orthomyxoviridae, Quaranjavirus, группа Кваранфил), изолированного в Киргизии из клещей Argas vulgaris Filippova, 1961 (Argasidae) из норовых биотопов с гнездами птиц

Полный текст

Введение Прототипный штамм LEIV-152Arg вируса Тюлёк (TLKV - Tyulek virus) изолирован из клещей Argas vulgaris Filippova, 1961 (Argasidae), собранных в 1978 г. в норовых биотопах с поливидовыми колониями птиц в пойме реки Ак-Су в окрестностях поселка Тюлёк Московского района, в северной части Чуйской долины в Киргизии (43 с. ш., 74 в. д.) [1-3]. Позднее (в 1981, 1984 и 1986 гг.) было изолировано еще 42 штамма TLKV [4]. По данным предварительного изучения TLKV был отнесен к группе Кваранфил сем. Orthomyxoviridae [5-10]. В 2013 г. группа Кваранфил, включающая вирусы Кваранфил (QRFV - Quaranfil virus), Атолл Джонстон (JAV - Johnston Atoll virus) и Озеро Чад (LCV - Lake Chad virus), выделена в самостоятельный род Quaranjavirus в составе сем. Orthomyxoviridae. QRFV и другие вирусы рода Quaranjavirus изолировали в ЮАР, Нигерии, Египте, Иране, Афганистане и Океании от аргасовых (Argasidae) клещей Argas arboreus Kaiser, Hoog-straal et Kohls, 1964, A. vulgaris Filippova, 1961, A. hermannii Audouin, 1827 - облигатных паразитов птиц [10-13]. Сем. Orthomyxoviridae объединяет оболочечные вирусы (80-120 нм) с сегментированным РНК-геномом отрицательной полярности. В семейство входят пять родов, из которых три представлены вирусами гриппа (Influenza A virus, Influenza B virus, Influenza C virus) и передаются респираторным путем. В род Isavirus входят два вида вируса инфекционной анемии лососей, основной путь передачи которых водный. Вирусы родов Thogotovirus и Quaranjavirus являются арбовирусами, т.е. передаются членистоногими переносчиками, в основном клещами. При этом вирусы рода Thogotovirus преимущественно связаны с иксодовыми (Ixodidae) клещами, а вирусы рода Quaranjavirus, включая TLKV, - с аргасовыми (Argasidae). Геном ортомиксовирусов представлен от шести (Thogotovirus и Quaranjavirus) до восьми (Influenza A virus и Influenza B virus) сегментами РНК отрицательной полярности длиной от 740 до 2400 н.о. [9]. В настоящей работе с использованием технологии полногеномного секвенирования (next-generation sequencing) определена полная последовательность генома TLKV. На основе проведенного молекулярногенетического и филогенетического анализа показано, что TLKV является новым вирусом рода Quaranjavirus сем. Orthomyxoviridae. Материалы и методы Вирусные штаммы. Работы с инфекционным материалом, связанные с получением и накоплением вируса, проводили в боксовых помещениях, оборудованных и сертифицированных для работы с микроорганизмами II группы патогенности. Использованный в работе TLKV (штамм LEIV-152Arg) получен из Государственной коллекции вирусов РФ при ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России в виде лиофилизированной мозговой суспензии. Для накопления вируса лиофилизированную суспензию восстановили в 1 мл культуральной среды ДМЕМ (с добавлением антибиотика) и использовали для интрацеребрального заражения новорожденных беспородных белых мышей. После развития симптомов поражения ЦНС (2-3 сут) мышей забивали в соответствии с правилами содержания и использования лабораторных животных. Выделение РНК. Фрагменты мозга (около 30 мг) помещали в 1 мл реагента TRIzol (Life Technology, США) и гомогенизировали пластиковым пестиком. Далее выделяли РНК согласно прилагаемой инструкции производителя данного реагента. Конечный осадок суммарной РНК растворяли в 100 мкл DEPC-обработанной воды. Для дополнительной очистки, а также для удаления низкомолекулярных фракций рибосомальной (5 S) и транспортной РНК полученный препарат очищали набором «Rneasy mini kit» (QIAGEN, Германия) в режиме clean-up на автоматической станции QIAcube (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией. Концентрацию РНК измеряли с использованием флюориметра Qubit (Invitrogen, США). Для удаления рибосомальной (18 S и 28 S) РНК использовали набор «GenRead rRNA depletion Kit» (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией. Для этого брали не более 3 мкг суммарной РНК. Эффективность деплеции достигала 50-80%, и, таким образом, количество полученной РНК для дальнейшего анализа составило около 300 нг. Подготовка ДНК-библиотек и секвенирование. Для получения кДНК около 100 нг деплецированной РНК фрагментировали в 15 мкл реакционной смеси для обратной транскриптазы с гексапраймером при 85°С в течение 5 мин, после чего помещали в лед. К фрагментированной РНК добавляли 200 ед. фермента RevertAid Premium (Thermo Scintific, США) и 20 ед. ингибитора РНаз RNasin (Promega, США). Инкубировали при 25°С 10 мин, далее при 42°С 60 мин. Реакцию останавливали прогреванием при 70°С 10 мин. Синтез второй цепи кДНК проводили с использованием набора «NEBNext® mRNA Second Strand Synthesis Module» (NEB, США) в соответствии с инструкцией. Полученную дцДНК очищали, используя набор «MinElute PCR Purification Kit» (QIA-GEN, Германия), на автоматической станции QIAcube. Для получения ДНК-библиотек из дцДНК использо 29 Уровень дивергенции между нуклеотидными (верхняя правая часть таблицы) и аминокислотными (нижняя левая часть таблицы) последовательностями белка GP (HA у вирусов гриппа) и PB1 вирусов сем. Orthomyxoviridae GP (HA) уровень дивергенции, % 1 23456789 10 Quaranjavirus Тюлек LEIV-152Arg 1 0,28 0,33 0,67 0,65 0,60 0,74 0,68 0,75 0,71 Кваранфил 2 0,20 0,32 0,67 0,66 0,61 0,75 0,70 0,76 0,69 Атолл Джонстон 3 0,31 0,27 0,65 0,64 0,60 0,75 0,68 0,74 0,72 Thogotovirus Баткен LEIV-306K 4 0,82 0,85 0,82 0,20 0,59 0,71 0,72 0,74 0,74 Дхори 1313/61 5 0,85 0,87 0,85 0,09 0,60 0,73 0,73 0,74 0,73 Тогото 6 0,82 0,81 0,81 0,71 0,71 0,73 0,68 0,71 0,73 Infuenza A virus Вирус гриппа А 7 0,91 0,92 0,95 0,89 0,90 0,90 0,61 0,72 0,71 Infuenza B virus Вирус гриппа В 8 0,94 0,95 0,94 0,93 0,93 0,89 0,79 0,67 0,68 Infuenza C virus Вирус гриппа С 9 0,95 0,95 0,93 0,93 0,93 0,90 0,88 0,89 0,69 Isavirus Вирус инфекционной анемии лососевых 10 0,95 0,92 0,95 0,92 0,92 0,92 0,91 0,90 0,90 PB1 (сегмент 3) Quaranjavirus Тюлёк LEIV-152Arg 1 0,25 0,28 0,60 0,61 0,63 0,64 0,62 0,63 0,65 Кваранфил 2 0,14 0,26 0,60 0,63 0,63 0,64 0,62 0,63 0,65 Атолл Джонстон 3 0,16 0,17 0,61 0,6 20,62 0,65 0,62 0,63 0,64 Thogotovirus Баткен LEIV-306K 4 0,75 0,76 0,76 0,16 0,37 0,57 0,56 0,59 0,64 Дхори 1313/61 5 0,79 0,79 0,79 0,04 0,39 0,59 0,59 0,59 0,65 Тогото 6 0,79 0,78 0,78 0,37 0,39 0,60 0,60 0,59 0,67 Infuenza A virus Вирус гриппа А 7 0,76 0,75 0,76 0,69 0,73 0,74 0,39 0,51 0,65 Infuenza B virus Вирус гриппа В 8 0,75 0,74 0,76 0,70 0,74 0,74 0,39 0,49 0,64 Infuenza C virus Вирус гриппа С 9 0,77 0,78 0,78 0,73 0,75 0,75 0,61 0,60 0,64 Isavirus Вирус инфекционной анемии лососевых 10 0,81 0,81 0,81 0,85 0,85 0,85 0,83 0,83 0,82 вали набор «TruSeq DNA Sample Prep Kits v2» (Illumi-na, США) в соответствии с инструкцией. Для селекции ДНК по размеру использовали реагент «Ampure XP» (Beckman Coulter, США) с расчетом получения ДНК-библиотек длиной более 270 н.о., что соответствует размеру вставки около 150 н.о. Данные требования к размеру ДНК-библиотек связаны с использованием для секвенирования набора, позволяющего секвени-ровать не более 150 н.о. в одну сторону. Полученные библиотеки визуализировали на станции автоматического электрофореза «QIAxcel Advanced System» (QIAGEN, Германия). Молярность полученных библиотек измеряли методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (2х SsoFast EvaGreen Supermix (BioRad, США) на приборе Bio-Rad CFX1000) согласно рекомендациям, изложенным в руководстве «Sequencing Library qPCR Quantification Guide» (Illumina, США). Секвенирование ДНК-библиотек осуществляли на приборе MiSeq (Illumina, США) с помощью набора «MiSeq Reagent Kits V2 (300PE)» в соответствии с инструкцией производителя. Биоинформационный анализ. Обработку данных полногеномного секвенирования, сборку контигов и картирование ридов проводили, используя программу «CLC Genomics Workbench 6.0» (CLC bio, США). Предварительный поиск гомологичных последовательностей проводили с применением сервиса BLASTX (http://blast. ncbi.nlm.nih.gov). Для анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей использовали пакет программ «Lasergene Core Suite» (DNAstar, США). Выравнивание последовательностей проводили по алгоритму ClustalW. Филогенетический анализ и построение дендрограмм осуществляли с помощью программы MEGA5 по методу ближайшего соседа (neighbor-joining) с 500-кратным бутстреп-тестированием. Результаты и обсуждение В результате проведенного полногеномного секве-нирования и анализа полученных данных определили практически полные последовательности генома TLKV. Анализ данных провели с использованием сервиса BlastX с ограничением поиска по таксону viruses (taxid:10239). Геном TLKV так же, как и геном других вирусов рода Quaranjavirus, состоит из шести сегментов. Сегменты 1-3 кодируют белки репликативнополимеразного комплекса (PB2, PA и PB1 соответственно). Гомология TLKV с QRFV и JAV по белку PB1 на аминокислотном уровне составляет 86 и 84% соответственно. Белок PB1 (РНК-зависимая РНК-полимераза, RdRp) является одним из наиболее консервативных белков у РНК-вирусов с сегментированным геномом. Между вирусами разных родов в семействе Orthomyxo-viridae гомология аминокислотных последовательностей PB1 составляет в среднем 25-30% (см. таблицу). При этом уровень гомологии внутри функциональных доменов RdRp (мотивы pre-A, A, B, C, D и E) достигает 40-50%. Результаты филогенетического анализа, проведенного на основе сравнения содержания белка PB1 ортомиксовирусов, представлены на рисунке, а. Другие белки полимеразного комплекса (PB2 и PA) TLKV обладают около 70% гомологии с QRFV. Поверхностный гликопротеид GP (гемагглютинин, сегмент 5) TLKV и QRFV практически не обладает сходством с поверхностным, гомологичным белком (HA) вирусов гриппа (см. таблицу). Однако белок GP вирусов рода Quaranjavirus имеет определенное сходство с поверхност 30 Филогенетический анализ вирусов семейства Orthomyxoviridae на основе белка PB1 (сегмент 3) (а) и оболочечного белка GP (HA у вирусов гриппа) (б). ным гликопротеидом бакуловирусов [9]. С вирусами рода Thogotovirus гомология TLKV и QRFV по белку GP составляет около 20%. Уровень гомологии белка GP между TLKV и QRFV достигает 72 и 80% по нуклеотидной и аминокислотной последовательностям соответственно. Два других сегмента генома (сегменты 4 и 6) TLKV и QRFV кодируют два протеина, функция которых точно не известна. Сегмент 4 TLKV имеет одну открытую рамку считывания и кодирует протеин длиной 524 а. о. Его гомология между TLKV и QRFV составляет 85%. Сегмент 6 кодирует протеин длиной 266 а.о., который также не обладает гомологией ни с одним из белков, депонированных в базу данных GenBank. Гомология данного протеина у TLKV и QRFV достигает 60%. Вероятно, данные протеины являются структурными белками нуклеокапсида (N) и матриксным белком (М) соответственно, однако в настоящее время их функция точно не определена. На рисунке, б представлены результаты филогенетического анализа белковых последовательностей поверхностного гликопротеида (GP и HA) вирусов семейства Orthomyxoviridae. Так же, как и при филогенетическом анализе, проведенном на основе белка PB1K, TLKV группируется с вирусами QRFV и JAV в составе рода Quaranjavirus. Таким образом, согласно результатам проведенного филогенетического анализа TLKV является новым представителем рода Quaranjavirus. Антитела (АТ) к QRFV находили у людей в 2,6%, у верблюдов в 8,8%, у буйволов в 22,2%, у свиней в 12%, у собак в 7%, у ослов в 8%. Описаны случаи лихорадки Кваранфил у людей, сопровождающейся лихорадкой, прострацией с благоприятным исходом. Два штамма QRFV изолированы от детей, покусанных клещами в де ревне Кваранфил в Египте, по имени которой назван вирус [7, 9]. Природные очаги TLKV в Киргизии (43° с. ш.) находятся на северной границе ареала аргасовых клещей, ограниченного изолинией длительности безморозного периода 150-180 дней в году и среднесуточной температурой выше 20°C не менее 90-100 дней в году [14-17]. Адаптация ряда вирусов к аргасо-вым клещам существенно облегчает возможность переживания вирусной популяции в зимнее время и в засушливые периоды. Их способность к длительному голоданию (до 9 лет, срок наблюдения), продолжительность жизненного цикла (до 25-30 лет), полифагия, способность к трансстадийной и трансовариальной передаче, специфика как подстерегающих кровососов обеспечивают стойкость природных очагов [2, 3, 5]. У птиц, обитающих в норах, из которых были добыты зараженные вирусом клещи A. vulgaris, выявлены комплементсвя-зывающие АТ к TLKV. Но TLKV не удалось изолировать от птиц, иксодовых клещей и комаров, что свидетельствует о его высокой сте-нобионтности. Из того же биотопа из клещей A. vulgaris были изолированы также флавивирусы Соку-лук (SOKV - Sokuluk virus) и клещевого энцефалита (TBEV - tick-borne encephalitis virus) [2, 3, 15-17]. Изоляцию TLKV в Киргизии и изучение его экологии проводили в рамках Программы по биобезопасности и выявления биологического разнообразия в различных экосистемах Северной Евразии, а также для пополнения базы данных Государственной коллекции вирусов РФ [18-22].

Список литературы

Дополнительные файлы