Taxonomy of the Sokuluk virus (SOKV) (Flaviviridae, Flavivirus, Entebbe bat virus group) isolated from bats (Vespertilio pipistrellus Schreber, 1774), ticks (Argasidae Koch, 1844), and birds in Kyrgyzstan


Cite item

Full Text

Abstract

Complete genome sequencing of the Sokuluk virus (SOKV) isolated in Kyrgyzstan from bats Vespertilio pipistrellus and their obligatory parasites - Argasidae Koch, 1844, ticks was carried out. SOKV was classified as attributed to the Flaviviridae family, Flavivirus genus. The maximum homology (71% for nucleotide and 79% for amino acid sequences) was detected with respect to the Entebbe bat virus (ENTV). ENTV and SOKV form a group joining to the yellow fever virus (YFV) within the limits of the mosquito flavivirus branch. Close relation of SOKV with bat covers and human housings permits to assume SOKV potentially patogenic to human health.

Full Text

Прототипный штамм вируса Сокулук (SOKV - Sokuluk virus) LEIV-400K был изолирован при интрацеребраль-ном заражении мышей-сосунков из смешанного пула внутренних органов (мозг, печень, селезенка, почка) нетопыря-карлика Vespertilio pipistrellus Schreber, 1774 (Chiroptera), добытого в 1970 г. на чердаке жилого дома в Сокулукском районе Киргизии (42°30' с.ш., 74°30' в.д.) [1-4]. Позднее, в 1971-1973 гг., SOKV был выделен от аргасовых и иксодовых клещей и птиц в Приферганье и Чуйской долине Киргизии (см. таблицу), однако основным природным резервуаром этого вируса являются летучие мыши и их облигатные паразиты аргасовые клещи (Argasidae Koch, 1844). Результаты серологических исследований с помощью РТГА показали принадлежность SOKV к флавивирусам, а наличие односторонних антигенных связей по данным РСК (но не в РН) позволило отнести SOKV к комплексу летучих мышей Энтеббе (ENTV - Entebbe bat virus) [1-3]. Прототипный штамм этого антигенного комплекса был изолирован от летучей мыши - кенийского складчатогуба (Tadarida lobata Thomas, 1891), отловленного в окрестностях г. Энтеббе (Уганда) в июле 1957 г. [5]. Материалы и методы Прототипный штамм вируса Сокулук LEIV-400R был получен из Государственной коллекции вирусов РФ ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздрава России в виде лиофилизированной мозговой суспензии. Восстановленной суспензией (0,2 мл) проводили интрацеребральное заражение новорожденных беспородных белых мышей. После развития симптомов поражения ЦНС (2-4-е сутки) мышей забивали в соответствии с правилами содержания и использования лабораторных животных, одобренных комиссией Института по этике экспериментов с животными. Выделение РНК. Фрагменты мозга (около 10 мг) помещали в 350 мкл лизирующего буфера RLT (QIAGEN, Германия) и гомогенизировали в гомогенизаторе TyssueLyser LT (QIAGEN, Германия). Далее РНК выделили набором "RNeasy mini kit” (QIAGEN, Германия) на автоматической станции QIAcube (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией. Концентрацию РНК измеряли с использованием флюориметра Qubit ("Invitrogen”, США). Подготовка библиотек и секвенирование. Для депле-ции рибосомальной РНК использовали набор GenRead Контактная информация: Львов Дмитрий Константинович, акад. РАН; e-mail: dk_lvov@mail.ru 30 Изоляция SOKV на территории Киргизии (1971). Источник изоляции Место сбора материала Количество класс семейство вид район биотоп штаммов Млекопитающие Vespertilionidae Gray, 1821 Нетопырь-карлик (Vespertilio pipistrellus Schreber, 1774) Приферганье Чердак жилого дома 2 Птицы Motacillidae Horsfield, 1821 Белая трясогузка (Motacilla alba Linnaeus, 1758) Чуйская долина Населенный пункт 1 Hirundinidae Vigors, 1825 Деревенская ласточка (Hirundo rustica Linnaeus, 1758) Чуйская долина Г нездовая колония в жилом доме 1 Alcedinidae Rafinesque, 1815 Обыкновенный зимородок (Alcedo atthis Linnaeus, 1758) Чуйская долина Природный биоценоз, гнездо на берегу реки 1 Паукообразные Argasidae Koch, 1844 Argas vespertilionis Schreber, 1774 Приферганье Сняты с V. pipistrellus 2 Argas vulgaris Filippova, 1961 Чуйская долина Норовые колонии птиц 2 Ixodidae Koch, 1844 Hyalomma marginatum Koch, 1844 Приферганье Сняты со скота 1 rRNA depletion Kit (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией. Для получения кДНК 50 нг деплецирован-ной РНК фрагментировали в 15 мкл реакционной смеси для обратной транскриптазы с гексапраймером при 85°С в течение 5 мин, после чего помещали в лед. К фрагментированной РНК добавляли 200 ед. фермента Revert Aid Premium ("Thermo Scintific", США) и 20 ед. ингибитора РНаз RNasin ("Promega", США). Инкубировали при 25°С в течение 10 мин, далее при 42°С в течение 60 мин. Реакцию останавливали прогреванием при 70°С в течение 10 мин. Синтез второй цепи кДНК проводили с использованием набора "NEBNext® mRNA Second Strand Synthesis Module" (NEB, США) в соответствии с инструкцией. Полученную дцДНК очищали с использованием набора "MinElute PCR Purification Kit” (QIAGEN, Германия) на автоматической станции QIAcube. Для получения ДНК-библиотек из дцДНК использовали набор "TruSeq DNA Sample Prep Kits v2" ("Illumi-na", США) в соответствии с инструкцией. Полученные библиотеки визуализировали на станции автоматического электрофореза "QIAxcel Advanced System” (QIAGEN, Германия). Молярность полученных библиотек определяли методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (2-кратно SsoFast EvaGreen Supermix ("Bio-Rad", США), прибор Bio-Rad CFX1000) согласно рекомендациям, изложенным в руководстве "Sequencing Library qPCR Quantification Guide" ("Illumina", США). Сиквенирование ДНК-библиотек проводили на приборе MiSeq ("Illumina", США) с использованием набора "MiSeq Reagent Kits v2 (300PE)" в соответствии с инструкцией производителя. Биоинформационный анализ. Обработку данных полногеномного секвенирования, сборку контигов и картирование ридов осуществляли, используя программу "CLC Genomics Workbench 5.5" ("CLC bio", США). Предварительный поиск гомологичных последовательностей проводили с помощью сервиса BLASTX (http://blast.ncbi. nlm.nih.gov). Для подбора праймеров, множественного выравнивания, анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей использовали пакет программ "Lasergene Core Suite" ("DNAstar", США). Выравнивание последовательностей проводили по алгоритму ClustalW. Филогенетический анализ и построение дендрограмм осуществляли, используя программу MEGA5 по методу ближайшего соседа с бутстреп-тестированием 1000. Результаты и обсуждение ДНК-библиотеки, приготовленные на основе суммарной РНК из материала, который содержал SOKV, сек-венировали методом полногеномного секвенирования (next-generation sequencing). При анализе полученных данных (с помощью сервиса BLASTX) среди них обнаружили последовательности, обладающие гомологией с вирусами рода Flavivirus (Flaviviridae). Результаты дальнейшего анализа показали, что мы определили практически полную последовательность генома SOKV, который представлен одноцепочечной РНК позитивной полярности длиной около 10,5 тыс. н.о. и имеет одну открытую рамку считывания, кодирующую полипротеин -предшественник структурных и неструктурных белков. Для проведения молекулярно-генетического и филогенетического анализа полноразмерные нуклеотидные и аминокислотные последовательности геномов флавивирусов, различных экологических групп выровняли по алгоритму ClustalW. На основе выровненных последовательностей рассчитали значения генетической дистанции (p-distance) между флавивирусами основных групп, представленные в табл. 2. Наибольшую гомологию (71% на нуклеотидном и 79% на аминокислотном уровне) SOKV имеет с ENTV. Эти данные подтверждают принадлежность SOKV к антигенному комплексу ENTV. Генетическая дистанция между SOKV и ENTV соответствует видовым различиям между флавивирусами одного антигенного комплекса. Так, например, вирус Западного Нила (WNV - ) имеет 75% гомологии с вирусом Японского энцефалита (JEV - Japanese encephalitis virus). Уровень гомологии SOKV с другими флавивирусами составляет около 45% на нуклеотидном и аминокислотном уровне соответственно. Наиболее близкими к SOKV и ENTV (гомология 50%) являются вирусы комплекса желтой лихорадки (YFV - Yellow fever virus, и вирус Сепик). Наиболее дивергентными флавивирусами для SOKV являются вирусы групп Рио-Браво (RBV - Rio-Bravo virus) и Модок (MODV - Modoc virus), с которыми имеет около 40% гомологии. Результаты филогенетического анализа, проведенного на основе сравнения полноразмерных нуклеотидных последовательностей, представлены на рисунке. Филогенетически флавивирусы позвоночных делятся на три основные ветви - вирусы с преимущественной передачей клещами (tick-borne viruses), комарами (mosquito-borne viruses) и флавивирусы, переносчик которых неизвестен (no known vector (NKV) viruses) (см. рисунок). На представленном рисунке SOKV вместе с ENTV формируют группу, близкую к YFV в составе ветви комариных флавивирусов. От рукокрылых (Chiroptera Blumenbach, 1779) изолировано более 20 вирусов, примерно половина из которых не была выделена из других природных источников [6]. Летучие мыши (Microchiroptera Dobson, 1875) вос- 31 Дендрограмма, построенная на основе сравнения полных нуклеотидных последовательностей геномов флавивирусов. приимчивы к заражению многими флавивирусами: JEV [7]; Дакар-бат (DBV - Dakar bat virus) [8-11]; летучих мышей Букалаза (BBV - Bukalasa bat virus) [12]; ENTV [13]; RBV [14, 15], который имеет близкое родство с вирусом Модок (MODV - Modoc virus), изолированным от оленьих хомячков (Peromyscus maniculatus Wagner, 1845) на севере Калифорнии [16]; лейкоэнцефалита ночниц Монтаны (MMLV - Montana myotis leukoencephalitis virus) [17, 18], выделенным в США и близкородственным BBV; Карей-Айленд (CIV - Carey Island virus) [12]; Пномпень (PPBV - Phnom Penh bat virus) [19]; Юкосе (YOKV - Yokose virus) [20]. Насекомоядные нетопыри-карлики (V. pipistrellus), от которых был изолирован SOKV, относятся к сем. гладконосых летучих мышей (Vespertilionidae Gray, 1821), которые активны в темное время суток. Их дневные убежища чаще всего находятся на чердаках жилых строений. Ареал V. pipistrellus включает Европу, Средиземноморье, Кавказ, Среднюю Азию. Часть популяции в зим ний период может мигрировать в Африку, где возможно заражение местными вирусами (в частности, BBV, DBV. ENTV и т.д.). Тесная связь хозяев SOKV с жилыми постройками, а также наличие среди флавивирусов возбудителей энцефалитов и геморрагических лихорадок позволяют рассматривать SOKV как потенциально опасный вирус, способный при определенных условиях вызывать тяжелую патологию у человека. У людей в Киргизии и Туркмении выявлены компле-ментсвязывающие антитела (АТ) к SOKV (6,2 и 4% соответственно), что свидетельствует о недавних случаях заражения вирусом [1-4, 21-29]. По данным серологического обследования в Киргизии, домашние животные не включаются в циркуляцию SOKV, однако в Туркмении найдены противовирусные АТ у овец и коров. Изоляция вируса от птиц, не контактирующих с облигатными паразитами летучих мышей, и положительные серологические находки у людей и домашних животных позволяют предположить участие комаров в передаче SOKV 32 Между летучими мышами передача вируса осуществляется, вероятно, посредством иксодоидных клещей Argas vespertilionis Schreber, 1774 и Ixodes vespertilionis Koch, 1844 [25-27, 30]. При экспериментальном заражении полевых воробьев (Passer montanus Linnaeus, 1758) SOKV обнаруживали во внутренних органах на 8-е и 25-е сутки после инокуляции (период наблюдения) [31]. Зондирование территории Киргизии и туркмении проводили в рамках Программы по биобезопасности и изучению биоразнообразия в различных экосистемах Северной Евразии [21, 32-35].
×

References

  1. Lvov D.K., Tsyrkin Y.M., Karas F.R., Timopheev E.M., Gromashevski V.L., Veselovskaya O.V et al. Sokuluk virus, a new group B arbovirus isolated from Vespertilio pipistrellus Schreber, 1775, bat in the Kirghiz S.S.R. Arch. Gesamte Virusforsch. 1973; 41 (3): 170-4.
  2. Тимофеев Е.М. Очаги арбовирусов в юго-западной части Ошской области Киргизской ССР: Дис.. канд. мед. наук. М.; 2008.
  3. Lvov D.K. Arboviral zoonoses of Northern Eurasia (Eastern Europe and the Commonwealth of Independent States). In: Beran G.W., ed. Handbook of zoonoses. Section B: Viral. Boca Raton, London, Tokyo: CRC Press; 1994: 237-60.
  4. Варгина С.Г., Стебленко С.К., Карась Ф.Р., Усманов Р.К., Чонтарь И.А., Кенебаева А.М. и др. Исследование вирусов, экологически связанных с птицами Чуйской долины Киргизии. В кн.: Львов Д.К., ред. Экология вирусов. М.: АМН СССР; 1973: 74-80.
  5. Entebbe bat virus. In: Karabatsos N. International Catalogue of arboviruses and some others viruses of vertebrates. San Antonio (Texas): American Society of Tropical Medicine and Hygiene; 1985: 385-6.
  6. Simmonds P., Becher P., Collett M.S., Gould E.A., Heinz F.X., Meyers G. et al. Family Flaviviridae. In: King A.M.Q., Adams M.J., Carstens E.B., Lefkowitz E.J., eds. Virus Taxonomy: Ninth report of the International Committee on taxonomy of viruses. Elsevier Science; 2011: 1003-20.
  7. Sulkin S.E., Allen R. Bats as reservoir hosts for arboviruses. In: Proc-ceedings 8-th International Congress Tropical Medicine Malariology. Teheran; 1968: 694.
  8. Sulkin S.E., Allen R., Miura T., Toyokawa K. Studies of arthropod-borne virus infections in chiroptera. VI. Isolation of Japanese B encephalitis virus from naturally infected bats. Am. J. Trop. Med. Hyg. 1970;19 (1): 77-87.
  9. Bres P., Chambon L. Isolation at Dakar of a strain of arbovirus from the salivary glands of the bat (preliminary note). Ann. Inst. Pasteur (Paris). 1963; 104: 705-12 (in French).
  10. Shepherd R.C., Williams M.C. Studies on viruses in East African bats (Chiroptera). 1. Haemagglutination inhibition and circulation of arboviruses. Zoonoses Res. 1964; 3 (3): 125-39.
  11. Williams M.C., Simpson D.I., Shepherd R.C. Studies on viruses in East African bats. (Chiroptera). 2. Virus isolation. Zoonoses Res. 1964; 3 (3): 141-53.
  12. Varelas-Wesley I., Calisher C.H. Antigenic relationships of flaviviruses with undetermined arthropod-borne status. Am. J. Trop. Med. Hyg. 1982; 31 (6): 1273-84.
  13. Lumsden W.H., Williams M.C., Mason P.J. A virus from insectivorous bats in Uganda. Ann. Trop. Med. Parasitol. 1961; 55: 389-97.
  14. Burns K.F., Fabinacei C.J. Virus of bats antigenically related to St. Louis encephalitis. Science. 1956; 123 (3189): 227.
  15. Johnson H.N. The Rio Bravo virus: virus identified with Group B arthropod-borne viruses by hemagglutination inhibition and complement fixation test. In: Procceedings 9-th Pacific Science Congress. Bangkok, Thailand; 1957; vol. 17: 39.
  16. Johnson H.N. Ecological implications of antigenically related mammalian viruses for which arthropod vectors are unknown and avian associated soft tick viruses. Jap. J. Med. Sci. Biol. 1967; 20: 160-6.
  17. Bell J.F., Thomas L.A. A new virus, «MML», enzootic in bats (Myotis lucifugus) of Montana. Am. J. Trop. Med. Hyg. 1964; 13: 607-12.
  18. Karabatsos N. Characterization of viruses isolated from bats. Am. J. Trop. Med. Hyg. 1969; 18: 803-9.
  19. Salaun J.J., Klein J.M., Hebrard G. A new virus, Phnom-Penh bat virus, isolated in Cambodia from a short-nosed fruit bat, “Cynopterus brachyotis angulatus” Miller, 1898. Ann. Microbiol. (Paris). 1974; 125 (4): 485-95 (in French).
  20. Tajima S., Takasaki T., Matsuno S., Nakayama M., Kurane I. Genetic characterization of Yokose virus, a flavivirus isolated from the bat in Japan. Virology. 2005; 332 (1): 38-44.
  21. Lvov D.K. Ecological sounding of the USSR territory for natural foci of arboviruses. In: Sov. Med. Rev. Ser. E: Virology Reviews. USA: Harwood Ac. Publ. GmbH; 1993; 5: 1-47.
  22. Lvov D.K. Natural foci of arboviruses in the USSR. In: Sov. Med. Rev. Virol. UK: Harwood Ac. Publ. GmbH; 1987; 1: 153-96.
  23. Львов Д.К. Арбовирусные инфекции в субтропиках и на юге умеренного пояса в СССР. В кн.: Львов Д.К., Клименко С.М., Гайдамович С.Я., ред. Арбовирусы и арбовирусные инфекции. М.: Медицина; 1989: 235-49.
  24. Варгина С.Г., Карась Ф.Р., Герштейн В.И., Кучук Л.А. Об экологии вируса Сокулук. В кн.: Гайдамович С.Я., Приймяги Л.С., ред. Арбовирусы. Таллин: 1984; 13-4.
  25. Варгина С.Г., Брейненгер И.Г. Мониторинг природных очагов арбовирусов в Киргизии. В кн.: Успехи науки и техники. Серия: Вирусология. Арбовирусы и арбовирусные инфекции. М.: РАН; 1991; 24: 15-6.
  26. Герштейн В.И., Варгина С.Г., Кучук Л.А., БрейненгерИ.Г. К экологии арбовирусов, связанных убежищными биоценозами. В кн.: Успехи науки и техники. Серия: Вирусология. Арбовирусы и арбовирусные инфекции. М.: РАН; 1991; 24: 39-40.
  27. Варгина С.Г., Кучук Л.А., Брейненгер И.Г. К вопросу о взаимоотношениях между арбовирусами, переносчиками и хозяевами. В кн.: Успехи науки и техники. Серия: Вирусология. Арбовирусы и арбовирусные инфекции. М.: РАН; 1991; 24: 40-1.
  28. Скворцова Т.М., Громашевский В.Л., Сидорова Г.Л., Хуторецкая H.В., Аристова В.А., Кондрашина Н.Г. и др. Результаты вирусологического обследования переносчиков на территории Туркмении. В кн.: Львов Д.К., ред. Экология вирусов. М.: АМН СССР; 1974; вып. 2: 139-44.
  29. Варгина С.Г., Брейненгер И.Г., Герштейн В.И. Динамика циркуляции арбовирусов в Киргизии. В кн.: Успехи науки и техники. Серия: Вирусология. Арбовирусы и арбовирусные инфекции. М.: РАН; 1992; 27: 38-45.
  30. Львов Д.К. Природные очаги связанных с птицами арбовирусов СССР. В кн.: Львов Д.К., Ильичев В.Д. Миграции птиц и перенос возбудителей инфекции. М.: Наука; 1979: 37-101.
  31. Карась Ф.Р., Варгина С.Г., Герштейн В.И., Рисольев С.Г., Кучук Л.А. К вопросу о позвоночных хозяевах арбовирусов в природных очагах Киргизии. В кн.: Материалы 10-й Всесоюзной конференции по природной очаговости болезней. Душанбе; 1979: 97-9.
  32. Львов Д.К., Дерябин П.Г., Аристова В.А., Бутенко А.М., Галкина И.В., Громашевский В.Л. и др. Атлас распространения возбудителей природно-очаговых вирусных инфекций на территории Российской Федерации. М.: МЗ РФ; 2001.
  33. Щелканов М.Ю., Громашевский В.Л., Львов Д.К. Роль экологовирусологического районирования в прогнозировании влияния климатических изменений на ареалы арбовирусов. Вестник РАМН. 2006; (2): 22-5.
  34. Львов Д.К., ред. Организация эколого-эпидемиологического мониторинга территории Российской Федерации с целью противоэпидемической защиты населения и войск: Методические рекомендации. М.: МЗ РФ, Федеральное управление медикобиологических и экстремальных проблем, НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН; 1993.
  35. Львов Д.К. Экология вирусов. В кн.: Львов Д.К., ред. Руководство по вирусологии. Вирусы и вирусные инфекции. М.: МИА; 2013: 68-86.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download

Copyright (c) 2014 Lvov D.K., Alkhovsky S.V., Shchelkanov M.Y., Shchetinin A.M., Deryabin P.G., Gitelman A.K., Samokhvalov E.I., Botikov A.G.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС77-77676 от 29.01.2020.


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies