Таксономия вируса Сокулук (SOKV - Sokuluk virus) (Flaviviridae, Flavivirus, антигенный комплекс летучих мышей Энтеббе), изолированного в Киргизии от летучих мышей нетопырей-карликов (Vespertilio pipistrellus Schreber, 1774), аргасовых клещей (Argasidae Koch, 1844) и птиц

Полный текст

Прототипный штамм вируса Сокулук (SOKV - Sokuluk virus) LEIV-400K был изолирован при интрацеребраль-ном заражении мышей-сосунков из смешанного пула внутренних органов (мозг, печень, селезенка, почка) нетопыря-карлика Vespertilio pipistrellus Schreber, 1774 (Chiroptera), добытого в 1970 г. на чердаке жилого дома в Сокулукском районе Киргизии (42°30' с.ш., 74°30' в.д.) [1-4]. Позднее, в 1971-1973 гг., SOKV был выделен от аргасовых и иксодовых клещей и птиц в Приферганье и Чуйской долине Киргизии (см. таблицу), однако основным природным резервуаром этого вируса являются летучие мыши и их облигатные паразиты аргасовые клещи (Argasidae Koch, 1844). Результаты серологических исследований с помощью РТГА показали принадлежность SOKV к флавивирусам, а наличие односторонних антигенных связей по данным РСК (но не в РН) позволило отнести SOKV к комплексу летучих мышей Энтеббе (ENTV - Entebbe bat virus) [1-3]. Прототипный штамм этого антигенного комплекса был изолирован от летучей мыши - кенийского складчатогуба (Tadarida lobata Thomas, 1891), отловленного в окрестностях г. Энтеббе (Уганда) в июле 1957 г. [5]. Материалы и методы Прототипный штамм вируса Сокулук LEIV-400R был получен из Государственной коллекции вирусов РФ ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздрава России в виде лиофилизированной мозговой суспензии. Восстановленной суспензией (0,2 мл) проводили интрацеребральное заражение новорожденных беспородных белых мышей. После развития симптомов поражения ЦНС (2-4-е сутки) мышей забивали в соответствии с правилами содержания и использования лабораторных животных, одобренных комиссией Института по этике экспериментов с животными. Выделение РНК. Фрагменты мозга (около 10 мг) помещали в 350 мкл лизирующего буфера RLT (QIAGEN, Германия) и гомогенизировали в гомогенизаторе TyssueLyser LT (QIAGEN, Германия). Далее РНК выделили набором "RNeasy mini kit” (QIAGEN, Германия) на автоматической станции QIAcube (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией. Концентрацию РНК измеряли с использованием флюориметра Qubit ("Invitrogen”, США). Подготовка библиотек и секвенирование. Для депле-ции рибосомальной РНК использовали набор GenRead Контактная информация: Львов Дмитрий Константинович, акад. РАН; e-mail: dk_lvov@mail.ru 30 Изоляция SOKV на территории Киргизии (1971). Источник изоляции Место сбора материала Количество класс семейство вид район биотоп штаммов Млекопитающие Vespertilionidae Gray, 1821 Нетопырь-карлик (Vespertilio pipistrellus Schreber, 1774) Приферганье Чердак жилого дома 2 Птицы Motacillidae Horsfield, 1821 Белая трясогузка (Motacilla alba Linnaeus, 1758) Чуйская долина Населенный пункт 1 Hirundinidae Vigors, 1825 Деревенская ласточка (Hirundo rustica Linnaeus, 1758) Чуйская долина Г нездовая колония в жилом доме 1 Alcedinidae Rafinesque, 1815 Обыкновенный зимородок (Alcedo atthis Linnaeus, 1758) Чуйская долина Природный биоценоз, гнездо на берегу реки 1 Паукообразные Argasidae Koch, 1844 Argas vespertilionis Schreber, 1774 Приферганье Сняты с V. pipistrellus 2 Argas vulgaris Filippova, 1961 Чуйская долина Норовые колонии птиц 2 Ixodidae Koch, 1844 Hyalomma marginatum Koch, 1844 Приферганье Сняты со скота 1 rRNA depletion Kit (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией. Для получения кДНК 50 нг деплецирован-ной РНК фрагментировали в 15 мкл реакционной смеси для обратной транскриптазы с гексапраймером при 85°С в течение 5 мин, после чего помещали в лед. К фрагментированной РНК добавляли 200 ед. фермента Revert Aid Premium ("Thermo Scintific", США) и 20 ед. ингибитора РНаз RNasin ("Promega", США). Инкубировали при 25°С в течение 10 мин, далее при 42°С в течение 60 мин. Реакцию останавливали прогреванием при 70°С в течение 10 мин. Синтез второй цепи кДНК проводили с использованием набора "NEBNext® mRNA Second Strand Synthesis Module" (NEB, США) в соответствии с инструкцией. Полученную дцДНК очищали с использованием набора "MinElute PCR Purification Kit” (QIAGEN, Германия) на автоматической станции QIAcube. Для получения ДНК-библиотек из дцДНК использовали набор "TruSeq DNA Sample Prep Kits v2" ("Illumi-na", США) в соответствии с инструкцией. Полученные библиотеки визуализировали на станции автоматического электрофореза "QIAxcel Advanced System” (QIAGEN, Германия). Молярность полученных библиотек определяли методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (2-кратно SsoFast EvaGreen Supermix ("Bio-Rad", США), прибор Bio-Rad CFX1000) согласно рекомендациям, изложенным в руководстве "Sequencing Library qPCR Quantification Guide" ("Illumina", США). Сиквенирование ДНК-библиотек проводили на приборе MiSeq ("Illumina", США) с использованием набора "MiSeq Reagent Kits v2 (300PE)" в соответствии с инструкцией производителя. Биоинформационный анализ. Обработку данных полногеномного секвенирования, сборку контигов и картирование ридов осуществляли, используя программу "CLC Genomics Workbench 5.5" ("CLC bio", США). Предварительный поиск гомологичных последовательностей проводили с помощью сервиса BLASTX (http://blast.ncbi. nlm.nih.gov). Для подбора праймеров, множественного выравнивания, анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей использовали пакет программ "Lasergene Core Suite" ("DNAstar", США). Выравнивание последовательностей проводили по алгоритму ClustalW. Филогенетический анализ и построение дендрограмм осуществляли, используя программу MEGA5 по методу ближайшего соседа с бутстреп-тестированием 1000. Результаты и обсуждение ДНК-библиотеки, приготовленные на основе суммарной РНК из материала, который содержал SOKV, сек-венировали методом полногеномного секвенирования (next-generation sequencing). При анализе полученных данных (с помощью сервиса BLASTX) среди них обнаружили последовательности, обладающие гомологией с вирусами рода Flavivirus (Flaviviridae). Результаты дальнейшего анализа показали, что мы определили практически полную последовательность генома SOKV, который представлен одноцепочечной РНК позитивной полярности длиной около 10,5 тыс. н.о. и имеет одну открытую рамку считывания, кодирующую полипротеин -предшественник структурных и неструктурных белков. Для проведения молекулярно-генетического и филогенетического анализа полноразмерные нуклеотидные и аминокислотные последовательности геномов флавивирусов, различных экологических групп выровняли по алгоритму ClustalW. На основе выровненных последовательностей рассчитали значения генетической дистанции (p-distance) между флавивирусами основных групп, представленные в табл. 2. Наибольшую гомологию (71% на нуклеотидном и 79% на аминокислотном уровне) SOKV имеет с ENTV. Эти данные подтверждают принадлежность SOKV к антигенному комплексу ENTV. Генетическая дистанция между SOKV и ENTV соответствует видовым различиям между флавивирусами одного антигенного комплекса. Так, например, вирус Западного Нила (WNV - ) имеет 75% гомологии с вирусом Японского энцефалита (JEV - Japanese encephalitis virus). Уровень гомологии SOKV с другими флавивирусами составляет около 45% на нуклеотидном и аминокислотном уровне соответственно. Наиболее близкими к SOKV и ENTV (гомология 50%) являются вирусы комплекса желтой лихорадки (YFV - Yellow fever virus, и вирус Сепик). Наиболее дивергентными флавивирусами для SOKV являются вирусы групп Рио-Браво (RBV - Rio-Bravo virus) и Модок (MODV - Modoc virus), с которыми имеет около 40% гомологии. Результаты филогенетического анализа, проведенного на основе сравнения полноразмерных нуклеотидных последовательностей, представлены на рисунке. Филогенетически флавивирусы позвоночных делятся на три основные ветви - вирусы с преимущественной передачей клещами (tick-borne viruses), комарами (mosquito-borne viruses) и флавивирусы, переносчик которых неизвестен (no known vector (NKV) viruses) (см. рисунок). На представленном рисунке SOKV вместе с ENTV формируют группу, близкую к YFV в составе ветви комариных флавивирусов. От рукокрылых (Chiroptera Blumenbach, 1779) изолировано более 20 вирусов, примерно половина из которых не была выделена из других природных источников [6]. Летучие мыши (Microchiroptera Dobson, 1875) вос- 31 Дендрограмма, построенная на основе сравнения полных нуклеотидных последовательностей геномов флавивирусов. приимчивы к заражению многими флавивирусами: JEV [7]; Дакар-бат (DBV - Dakar bat virus) [8-11]; летучих мышей Букалаза (BBV - Bukalasa bat virus) [12]; ENTV [13]; RBV [14, 15], который имеет близкое родство с вирусом Модок (MODV - Modoc virus), изолированным от оленьих хомячков (Peromyscus maniculatus Wagner, 1845) на севере Калифорнии [16]; лейкоэнцефалита ночниц Монтаны (MMLV - Montana myotis leukoencephalitis virus) [17, 18], выделенным в США и близкородственным BBV; Карей-Айленд (CIV - Carey Island virus) [12]; Пномпень (PPBV - Phnom Penh bat virus) [19]; Юкосе (YOKV - Yokose virus) [20]. Насекомоядные нетопыри-карлики (V. pipistrellus), от которых был изолирован SOKV, относятся к сем. гладконосых летучих мышей (Vespertilionidae Gray, 1821), которые активны в темное время суток. Их дневные убежища чаще всего находятся на чердаках жилых строений. Ареал V. pipistrellus включает Европу, Средиземноморье, Кавказ, Среднюю Азию. Часть популяции в зим ний период может мигрировать в Африку, где возможно заражение местными вирусами (в частности, BBV, DBV. ENTV и т.д.). Тесная связь хозяев SOKV с жилыми постройками, а также наличие среди флавивирусов возбудителей энцефалитов и геморрагических лихорадок позволяют рассматривать SOKV как потенциально опасный вирус, способный при определенных условиях вызывать тяжелую патологию у человека. У людей в Киргизии и Туркмении выявлены компле-ментсвязывающие антитела (АТ) к SOKV (6,2 и 4% соответственно), что свидетельствует о недавних случаях заражения вирусом [1-4, 21-29]. По данным серологического обследования в Киргизии, домашние животные не включаются в циркуляцию SOKV, однако в Туркмении найдены противовирусные АТ у овец и коров. Изоляция вируса от птиц, не контактирующих с облигатными паразитами летучих мышей, и положительные серологические находки у людей и домашних животных позволяют предположить участие комаров в передаче SOKV 32 Между летучими мышами передача вируса осуществляется, вероятно, посредством иксодоидных клещей Argas vespertilionis Schreber, 1774 и Ixodes vespertilionis Koch, 1844 [25-27, 30]. При экспериментальном заражении полевых воробьев (Passer montanus Linnaeus, 1758) SOKV обнаруживали во внутренних органах на 8-е и 25-е сутки после инокуляции (период наблюдения) [31]. Зондирование территории Киргизии и туркмении проводили в рамках Программы по биобезопасности и изучению биоразнообразия в различных экосистемах Северной Евразии [21, 32-35].

Список литературы

Дополнительные файлы