Evolution of Influenza A(H3N2) virus from 2007 to 2012

Full Text

В отличие от вирусов гриппа типа В и С вирусы гриппа типа А способны инфицировать широкий круг хозяев, а также более подвержены эволюционной изменчивости, что является причиной ежегодных эпидемий (антигенный дрейф) и крайне редко пандемии (антигенный шифт) [6]. Причина тому - наличие 16 вариантов гемагглютинина (НА) и 9 вариантов нейраминидазы (NA), определяющих разделение вируса гриппа А на подтипы. Сочетание HA и NA на поверхности вириона теоретически предполагает 144 подтипа, однако на сегодняшний день известны 103, и только три из них - A(H1N1), A(H2N2) и A(H3N2) - способны инфицировать человека; именно эти штаммы были причиной пандемий ХХ-го века - «испанки», «азиатского» и «гонконгского» гриппа соответственно [13, 14]. Появившись в 1968 г., вирус гриппа A(H3N2) стал доминирующим в этиологии большинства эпидемий; исключение составил сезон 2009-2010 гг., когда в популяцию циркулирующих штаммов внедрился новый пандемический вирус гриппа свиней A(H1N1)pdm09 [1, 3, 5]. Интересным оказался и факт вытеснения из активной циркуляции пандемическим штаммом сезонного вируса A(H1N1),с сохранением в последующие два сезона циркуляции штаммов вируса гриппа В и A(H3N2) с доминированием последнего в эпидемии 2011-2012 гг. [1, 9]. Контактная информация: Силуянова Элина Владимировна, e-mail: sil-elia@rambler.ru Развитие и внедрение молекулярно-генетических методов изучения структуры и свойств белков вирусов гриппа в последние годы способствуют более полному пониманию механизмов их эволюционной изменчивости и позволяет в определенной степени предупредить возможный ущерб, а также оценить эффективность вак-цинопрофилактики и лечения с помощью этиотропных препаратов [2]. Настоящая статья посвящена результатам изучения свойств штаммов вируса гриппа A(H3N2), циркулировавших в России в эпидемические сезоны 2007-2009 гг. и период развития пандемии «свиного» гриппа, охватившей сезоны 2009-2012 гг. Материалы и методы Изоляцию эпидемических штаммов вируса гриппа A(H3N2) проводили заражением носоглоточными смывами, взятыми от пациентов с гриппозной инфекцией, монослоя клеток культуры ткани MDCK по методу H. Davies c соавт. [8]. Штаммы были выделены в Центре экологии и эпидемиологии гриппа (ЦЭЭГ) ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздрава России, а также переданы из ФГУЗ Центров гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора ряда городов РФ. Рекультивирование эталонных штаммов проводили в полости развивающихся куриных эмбрионов по ранее описанной методике [10]. Антигенные свойства выделенных изолятов изучали в реакции торможения гемагглютинации, согласно рекомендациям ВОЗ, с использованием эталонных штаммов вируса гриппа A(H3N2) и специфических сывороток против них, полученных в ЦЭЭГ при иммунизации крыс: A/ Рис. 1. Филогенетическое сравнение генов гемагглютинина вируса гриппа A(H3N2). Здесь и на рис. 2: * - исследуемые штаммы. Wisconsin/67/05, A/Brisbane/10/07 и A/Perth/16/2009. Эталоны получены из справочных центров ВОЗ по гриппу. Вирусную РНК выделяли из штаммов вируса гриппа A(H3N2) с помощью набора Zymo Reseach Viral RNA Kit, согласно инструкции производителя. Детекцию РНК вируса гриппа А(И3№) проводили с помощью тест-системы «АмплиСенс® Influenza virus A-тип-РЬ» по инструкции. Обратную транскрипцию проводили в объеме 20 мкл: 4 мкл 5х буффер (Promega,США), 0,5 мкл dNTPs, 1 мкл праймера 5’Uni (AGCRAAAGCAGG), 4 мкл H2O, 0,5 мкл обратной транскриптазы (MMLV) и 10 мкл вирусной РНК. Реакцию проводили 30 мин при 42°C. Амплификацию проводили на приборе BIO-RAD С 1000 Thermo Cycler с режимом 94°C - 30 с, денатурация 94°C - 10 с, отжиг праймеров 55°C - 10 с и элонгация при 72°C - 40 с; 35 циклов. ПЦР проводили в объеме 25 мкл: 12,5 мкл GoMM (Go Master Mix), 9 мкл H2O, по 1 мкл 10 нмоль специфических праймеров: R1024 (5’-AGAAACA-AGGTAGTTTTTTACTCCA-3’) для M-белка, R800 (5’-CGTCTCCCG-GTTTTACTATTGTCCA3’), R738 (5’TAATGCACTCAAATGCAAAT-GTT-3’), R1205 (5’-TTGGTTG-ATTGCTGCTTGAGTGCT-3’) для HA, R1296 (5’-TTTTCTTCCCCTAATCAACTCCAC-3’), R823 (5’-GCT-GAGCACTTCCTGACAAT-3’), R1423 (5’-TTGCGAA-AGCTTATATAGGCAT-3’) для NA и прямых праймеров F541 (5’-AATCAGRCATGAGAACAGRA-TGGT-3’) для М-белка, F(-24) (5’-AAGCAGGG-GAGAATTCTATTAACC-3’), F565 (5’RYTGAACG-TGACTATGCCAAA-3’), F1031 (5’-AGGGATGCGRA-ATGTACCAGAGAA-3’), F667 (5’-CCCAGGAGTC-AAGAATGCGTTG-3’), 5NTR (5’-AGCAAAAGCAG-GAGTAAAGATGA-3’), F846 (5’-TCCTCGATAT-CC-TGGTGTCAGATG-3’) и 2,5 кДНК. Электрофорез ставили в 1% агарозном геле с 100 bp ДНК-маркером (лаборатория Медиген). Положительные по результатам электрофореза пробы очищали набором DNA gel extraction Clean Up (AxyGen). Секвенирование фрагментов проводили с использованием реагентов BigDye Terminator V 3.1 Cycle Sequencing RR-100 и автоматического анализатора ABT 3130(США) методом Сенгера, согласно рекомендациям производителя. Для анализа нуклеотидных и соответствующих им аминокислотных последовательностей использовали пакет прикладных программ Lasergene (DNASTAR Inc., США). Построение филогенетических дендрограмм осуществляли на основе алгоритма «ближайшего соседа» в рамках 2-параметрической модели М. Кимуры с последующим 1000-кратным ресэмплингом (MegAlign) [4]. Антигенный и молекулярно-генетический анализ штаммов вируса гриппа A(H3N2) (2007-2012 гг.) Сезон Штамм Титр с эталонной Аминокислотные замены в белках штаммов вируса гриппа A(H3N2) сывороткой в РТГА до * HA NA А/Якутия /83/2008 1 Q57H, V182I, R361I D151G, D339N А/Якутия /85/2008 1 Q57H, V182I, R361I D339N А/Астрахань /48/2008 1 R361I н/в ** А/Владивосток/4/2008 1 T361, N290K D151G 2007-08 Л/Пенза/55/2008 1 R361I А/Владивосток/19/2008 1 R361T I30V, T32V, L35Q, N147D А/Екатеринбург/4/2008 1 Q57H, V182I, R361I D339N А/Якутия /83/2008 1 Q57H, V182I, R361I D151G, D339N А/Москва/24/09 1/4 н/в н/в А/Липецк/321/09 1/4 T10M н/в А/Москва /26/09 1 н/в T19A, P386H А/Москва/21/09 1/8 н/в I30V ** 2008-09 А/Липецк/303/09 1/16 T10M P154S, H336N, D339N А/Москва/30/09 1/2 н/в н/в А/Липецк/225/09 1/4 T10M T32I, P154S, H336N, D339N А/Липецк/346/09 1/4 н/в P386H А/Владивосток/2/2010 1 V43I, E50K D127N, I307M, R430S А/ Владивосток/3/2010 1 V43I, E50K D127N, I307M, R430S *** А/Владивосток/4/2010 1 V43I, E50K, D375N D127N, I307M 2010-11 А/Владивосток/10/2010 1/4 S114T D127N, I307M А/Владивосток/11/2010 1/8 N122S D127N, I307M А/Владивосток/1/2010 1 н/в D127N, I307M А/Владивосток/10/2011 1/8 н/в D127N, I307M А/Владивосток /4/2011 1/4 н/в D127N, I307M А/Москва/02/12 1 н/в R428G А/Москва/03/12 1 S114A R428G, T434N А/Оренбург/50/2012 1/4 S114A н/в А/Оренбург/46/2012 1/4 S114A н/в А/Оренбург/39/2012 1/4 S114A н/в *** 2011-12 А/Липецк/117/2012 1 I25M, Q33R, S45N, T48I, N278K н/в А/Чебоксары/40/2012 1/4 I25M, Q33R, S45N, T48I, N278K T434N А/Владивосток/3/2012 1/4 N278K T434N А/Ярославль/81/2012 н/д I25M, Q33R, S45N, T48I, N278K T434N A/Томск/1/2012 1/4 н/в н/в Примечание. * - титр взаимодействия штамма с эталонной сывороткой в РТГА до ... титра; ** - титр взаимодействия штамма с сывороткой к эталону A/Brisbane/10/2007 по сравнению с гомологичным; *** - титр взаимодействия штамма с сывороткой к эталону A/ Perth/16/2009 по сравнению с гомологичным. Н/д - не диагностировали. Н/в - не выявили. Результаты и обсуждение 2011-2012 гг. (68%). В эпидемическом сезоне 2007-2008 гг. долевое участие штаммов гриппа этого подтипа составляло 14%; в 2009-2010 гг. штаммы не детектировали; в 2010-2011 гг. были изолированы только от спорадических случаев заболевания (5%). В рассматриваемый период антигенные свойства большинства циркулировавших штаммов вируса гриппа A(H3N2) имели близкое родство с эталонными вирусами, рекомендованными в качестве вакцинных в соответствующие сезоны - A/Brisbane/10/2007 (2007-2009 гг.) и A/Perth/16/2009 (2010-2012 гг.). При этом популяция штаммов, выделенных в 2008-2009 гг., была гетерогенной по антигенным свойствам, так как часть из них имела большее сродство к последнему из эталонов (по данным ЦЭЭГ, их количество составило 40%), что и определило начало дрейфовой изменчивости этого вируса и замену вакцинного штамма. В исследования по изучению молекулярно-генетических свойств выделенных штаммов были отобраны представители 5 сезонов, подобных или отличных по антигенным свойствам по отношению к эталонным вирусам, а также выделенные на разных территориях РФ; в целом количество изученных штаммов составило 34, среди которых 7 штаммов были изолированы в сезоне 2007-2008 гг., 8 - в 2008-2009 гг., 8 - в 2010-2011 гг. и 11 - в 2011-2012 гг. (см. таблицу). Результаты молекулярно-генетических исследований трех белков (HA, NA и М) изученных вирусов гриппа А(Н3№) показали, что в период с 2007 по 2012 г. в строении HA и NA происходили ежегодные изменения, и аминокислотные замены регистрировали в 4 сайтах связывания АТ молекулы HA (A, B, D, E) и NA. При этом для всех из них была характерна мутация S31N в М-белке, определившая резистентность к препаратам адамантанового ряда. Обнаруженные специфические мутации в молекуле HA штаммов A(H3N2) имели временные и географические особенности: штаммы 2007-2008 гг. содержали общую для всех замену Q173K. Часть штаммов несли мутацию L157S (сайт В). Все штаммы 2010-2011 гг. (выделены только в г. Владивостоке) несли общие для всех замены I260M, P162S и R261Q. Интересно отметить, что такие же замены встречались у вирусов, циркулировавших в 2010-2011 гг. преимущественно в восточных странах, в частности Японии и Китае [11]. Также зафиксированы мутации E62K (сайт Е), N189K (сайт В) и N144K (сайт А). Штаммы 2011-2012 гг. несли мутации A198S (сайт В2), N189K (сайт В), I202T (сайте D) I212T, N145S, V223I, D487N, при этом часть штаммов также имела замену, N144D (сайт А), другие штаммы - N278K (сайт С). По данным ЦЭЭГ, в анализируемый период доминирующая роль штаммов вируса гриппа A(H3N2) как этиологического фактора эпидемических подъемов была отмечена в 2 из 5 сезонов - 2008-2009 гг. (51%) и В последовательности NA штаммов сезона 2007-2008 гг. обнаружили аминокислотные замены V215I; 2010-2011 гг. - L338F, N342D, N402D; 2011-2012 гг. - L81P, D93G, S367N, K369T, N402D. Следует отметить, что в последовательностях NA всех исследуемых вирусов гриппа А (H3N2) 2007-2012 гг. мутаций, отвечающих за устойчивость к озельтамиви-ру (E119V, R292K и N294S) и занамивиру (Q136K), не выявили. Рис. 2. Филогенетическое сравнение генов нейраминидазы вируса гриппа A(H3N2). Полученные результаты позволили отнести штаммы к клайдам и генетическим группам: в сезоне 2007-2008 гг. штаммы имели замены в HA и NA, характерные для клайда A/Brisbane/10/2007 [7]; штаммы эпидемического сезона 2010-2011 гг., циркулировавшие на востоке страны, относились к клайду A/Perth/16/200, генетической группе A/Victoria/210/2009; сезона 2011-2012 гг. - к клайду A/Victoria/208, при этом штаммы, имевшие замены N145S, N144D, V223l, D487N относятся к генетической группе 3А - A/Stockholm/18/2011; другие штаммы с характерными заменами N145S, T48l, S45N,278K, N189K и A198S относятся к генетической группе 3С (A/Hong Kong/3969/2011). Все эти замены характерны для клайда A/Victoria/208/09 и встречались у большинства вирусов, циркулирующих во всём мире [12]. На рис. 1 и 2 представлены дендрограммы, построенные на основе сравнения аминокислотных последовательностей HA и NA. Результаты исследований показали, что все изученные штаммы вируса гриппа A(H3N2) имели высокую гомологию как с другими российскими штаммами (данные ФГБУ «НИИ гриппа» Минздрава России), так и со штаммами, циркулировавшими в разных странах мира. У штаммов 2011-2012 гг., изученных в ЦЭЭГ, отметили значимые замены в последовательностях HA и NA, связанные с возникновением или потерей сайта гликозилирования (в HA - S45N и N144D, в NA - S367N/K369T и N402D соответственно). Кроме того, при анализе антигенных и молекулярно-генетических свойств штаммов установили, что наличие или отсутствие тех или иных мутаций не влияло на родство к эталонным вирусам в пределах одного клайда и генетической группы, в то же время при замене эталонных штаммов всегда определяли мутации, характерные для другого клайда и генетической группы. Таким образом, в период 20072012 гг. эволюция вирусов гриппа A(H3N2), выделенных и изученных в ЦЭЭГ, шла в направлении A/Brisbane/10/2007(2007-2008)-A/ Perth/16/2009(2009-2010)-A/ Victoria/208/2009(2011-2012), при этом штаммы принадлежали к разным клайдам и генетическим группам, что коррелирует с результатами, полученными другими исследователями как в нашей стране, так и за рубежом [11, 12]. Вместе с тем, несмотря на высокий уровень гомологии российский изолятов, среди них есть вирусы, несущие специфические замены в последовательности HA (T10M, Q57H, S114A, V182I) NA (P154S, T434N), которые не встречаются у вирусов, циркулирующих в других странах мира. Отсутствие зависимости между антигенными и генетическими свойствами штаммов указывает на важность проведения молекулярно-генетического анализа для более детального изучения свойств вируса гриппа A(H3N2) и понимания направления его эволюционной изменчивости. Кроме того, полученные результаты показали близкое родство циркулировавших штаммов с A(H3N2) - компонентом гриппозных вакцин, а также их высокую чувствительность к препаратам с антинейра-минидазной активностью (озельтамивир и занамивир) и резистентность к препаратам адамантанового ряда (ремантадин и амантадин). Нуклеотидные последовательности штаммов были депонированы в базу GenBank (JQ988024-JQ988050).

References

Supplementary files