Genetic characterization of new Komandory virus (KOMV; Bunyaviridae, Phlebovirus) isolated from the ticks Ixodes uriae, collected in guillemot (Uria aalge) nesting sites on Komandorski islands, the Bering sea

Full Text

Введение Командорские острова (54°30' с.ш. 166°20' в.д.) в Беринговом море включили в зондирование территории Дальнего Востока на вирусные природные очаги, исходя из следующих предпосылок: 1) ареал адаптированных к иксодоидным клещам вирусов совпадает с ареалом клещей; 2) на севере умеренного климатического пояса и в Субарктике роль основного резервуара играют облигатные паразиты колониальных чистиковых птиц (Alcidae) клещи Ixodes (Ceratixodes) uriae (в Южном полушарии клещи I. uriae паразитируют в колониях пингвинов (Spheniscidae)); 3) происхождение арбовирусов, связанных с I. uriae, относится к периоду плиоценовой трансгрессии, когда установилась прямая связь Атлантики с Полярным бассейном. Ранее была показана возможность выплеска вирусных популяций в летнее время на материк с включением в циркуляцию вирусов комаров. Это показано и в атлантической (вирус Залив Терпения - ZTV) и тихоокеанской (вирус Тюлений - TUV) частях ареала I. uriae [1-4]. На Командорских островах, расположенных на границе умеренного и субарктического климатических поясов, имеются огромные по численности колонии чистиковых птиц, прежде всего кайр Uria aalge. Здесь из собранных в колониях клещей были изолированы вирусы сем. Bunyaviridae: Сахалин - SAHV, Парамушир - PARV (род Nairovirus), ZTV (род Phlebovirus); сем. Flaviviridae: TUV (род Flavivirus); сем. Reoviridae: Охотский - OHV (род Orbivirus), а также несколько неиден-тифицированных вирусов (табл. 1) [5-13]. В настоящей работе провели частичное секвенирование неидентифи-цированного вируса, получившего название «Командоры» (Komandory - KOMV, от англ. Komandorski islands), изолированного на Командорских островах из клещей I. uriae в 1986 г. На основании молекулярно-генетического и филогенетического анализа последовательностей белков KOMV установили, что KOMV является новым вирусом группы Укуниеми (UUKV) рода Phlebovirus (сем. Binyaviridae). Материалы и методы Использованные вирусы и выделение РНК. Штамм неидентифицированного вируса LEIV-13856 был изолирован в 1986 г. и хранился в коллекции лаборатории экологии вирусов ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздрава РФ в виде лиофилизованной мозговой суспензии. Восстановленной суспензией (0,2 мл) проводили интрацеребральное заражение новорожденных беспородных белых мышей. После развития симптомов поражения ЦНС (2-4-е сутки) мышей забивали в соответствии с правилами содержания и использования лабораторных животных, одобренных комиссией института по этике экспериментов с животными. Фрагменты мозга (около 50 мг) помещали в 350 мкл лизирующего буфера RLT (QIAGEN, Германия) и гомогенизировали в гомогенизаторе TyssueLyser LT (QIAGEN, Германия). Далее РНК выделяли набором «RNeasy mini kit» (QIA-GEN, Германия) на автоматической станции QIAcube (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией. Концентрацию РНК измеряли с использованием флюо-риметра Qubit (Invitrogen, США). Подготовка библиотек и секвенирование. 100 нг тотальной РНК фрагментировали в 15 мкл реакционной смеси для обратной транскриптазы (50 мМ трис-HCl (pH 8,3, температура 25°C), 50 мМ KCl, 4 мМ MgCl2, 10 мМ DTT, dNTP (1 мМ каждого) и гексапраймер (0,2 мкг)) при 85°С в течение 5 мин, после чего помещали в лед. К фрагментированной РНК добавляли 200 ед. фермента RevertAid Premium (Thermo Scintific, США) и 20 ед. ингибитора РНаз RNasin (Promega, США). Инкубировали при 25°С 10 мин, далее при 42°С 60 мин. Реакцию останавливали прогреванием при 70°С 10 мин. Синтез второй цепи кДНК проводили с использованием набора NEBNext® mRNA Second Strand Synthesis Module (NEB, США) в соответствии с инструкцией. Полученную дцДНК очищали, используя набор MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN, Германия), на автоматической станции QIAcube. Для получения ДНК- библиотек из дцДНК использовали набор TruSeq DNA Sample Prep Kits v2 (Illumina, США) в соответствии с инструкцией. Полученные библиотеки визуализировали на станции автоматического электрофореза «QIAxcel Advanced System» (QIAGEN, Германия). Измерение молярности полученных библиотек проводили методом полимеразно-цепной реакции в реальном времени (2х SsoFast EvaGreen Supermix (BioRad, США), прибор Bio-Rad CFX1000) согласно рекомендациям, изложенным в руководстве «Sequencing Library qPCR Quantification Guide» (Illumina, США). Секвенирование ДНК-библиотек осуществляли на приборе MiSeq (Illumina, США) с помощью набора MiS-eq Reagent Kits V2 (300PE) в соответствии с инструкцией производителя. Биоинформационный анализ. Обработку данных полногеномного секвенирования, сборку контигов и картирование ридов проводили, применяя программу cLc Genomics Workbench 5.5 (ClC bio, США). Предварительный поиск гомологичных последовательностей проводили с использованием сервиса BLASTX (http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov). Для подбора праймеров, множественного выравнивания, анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей использовали пакет программ Lasergene Core Suite (DNAstar, США). Выравнивание последовательностей осуществляли по алгоритму ClustalW. Филогенетический анализ и построение дендрограмм проводили с использованием программы MEGA5 [14]. Результаты и обсуждение Секвенирование вирусных геномов de novo стало возможным с развитием технологий следующего поколения (полногеномное секвенирование, next-generation sequencing) [15-17]. Данный подход не требует предварительных данных об исследуемом материале, что позволяет описывать и классифицировать новые или неидентифицированные вирусы. Ранее нами показано, что при достаточном титре вируса в материале секвени-рование вирусного генома можно проводить на матрице суммарной РНК без предварительной очистки и концентрирования вирионов [18, 19]. В полученном массиве геномных данных поиск вирусных последовательностей проводится биоинформационными методами. Геном неидентифицированного вируса KOMV (штамм LEIV-13856) был частично секвенирован в составе ин- Таблица 1 Изоляция вирусов из клещей Ixodes uriae в колонии кайр (Uria aalge) на Командорских островах Вирус Семейство Род Заражен ность клещей Тюлений (TULV) Flaviviridae Flavivirus 1:900 Залив Терпения (ZTV) Phlebovirus 1:900 Сахалин (SAKHV) Парамушир (PARV) Bunyaviridae Nairovirus 1:4700 1:19000 Охотский (OKHV) Reoviridae Orbiviridae 1:63000 19 б Дендрограммы, построенные в результате филогенетического анализа последовательностей белков буньявирусов животных. а - белок нуклеопротеин (N); б - гликопротеин-предшественник оболо-чечных белков (G); в - РНК-зависимая РНК-полимераза (RdRp). а Таблица 2 Уровень (в %) идентичности белка нуклеокапсида у флебовирусов Вирус 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Kommandory (KOMV) 1 65 43 43 43 43 44 29 32 31 41 39 38 35 36 Manawa 2 39 41 41 41 44 27 29 29 41 40 37 38 35 Murre 3 59 63 60 73 30 31 28 38 39 37 34 31 Grand Arbaud 4 72 72 62 26 29 29 37 36 37 36 29 Uukuniemi 5 86 67 26 28 27 41 36 37 35 30 Zaliv Terpenia virus 6 65 25 27 28 40 35 38 36 28 Precarios Point 7 29 30 31 39 41 38 38 31 Bhanja 8 42 37 31 33 33 35 31 SFTSF 9 62 38 34 38 37 32 Heartland 10 32 35 36 34 33 Aguacate 11 57 62 50 47 Candiru 12 58 50 50 Rift Valley Fever 13 53 50 Sandfly Fever Sicilian 14 Toscana 15 Примечание. Серым цветом выделены вирусы группы Укуниеми. дексированной ДНК-библиотеки, полученной из тотальной РНК, которая выделена из тканей мозга зараженных новорожденных мышей. В результате анализа данных полногеномного секвенирования с помощью сервиса BLASTX найдены последовательности, обладающие от 30 до 65% идентичности с последовательностями белков вирусов рода Phlebovirus сем. Bunyaviridae. Геном флебовирусов представлен тремя сегментами (L, M и S) РНК отрицательной полярности, общей длиной 11-19 тыс. н. о. L-сегмент кодирует единственный белок - РНК-зависимую РНК-полимеразу (RdRp). M-сегмент кодирует два оболочечных гликопротеида (Gn и Gc), а также неструктурный белок Nsm (только у москитных флебовирусов). S-сегмент имеет амбиполяр-ную структуру и кодирует 2 белка: белок нуклеокапси-да (N) и неструктурный белок (NSs). Филогенетически флебовирусы делятся на две группы, которые соответствуют особенностям их экологии: передаваемые клещами (tick-borne; группа вируса Укуниеми - UUKV) и передаваемые комарами (mosquito-born; группа вируса москитной лихорадки - SFV). Также клещевые и москитные флебовирусы обладают различной структурой М-сегмента [20, 21]. В результате секвенирования генома KOMV определены частичные последовательности всех трех сегментов. Полностью установлена последовательность белка нуклеокапсида (S-сегмент), а также частичные последовательности полипротеина G (два участка общей длиной 495 а.к.) (М-сегмент) и RdRp (фрагмент длиной 571 а.к.) (L-сегмент), что составляет около 60% генома KOMV. Белок нуклеокапсида KOMV имеет размер, характерный для флебовирусов (257 а.к.). Результаты филогенетического анализа, проведенного на основе сравнения белка N буньявирусов (см. рисунок, а), позволяют отнести KOMV к группе Укуниеми (UUKV). В группу UUKV входит не менее 16 вирусов, которые объединены в пять серотипов (видов) - UUKV, Мюррей (Murre virus - MURV), Манава (Manawa - MWAV), Прекари-ос пойнт (Precarios point virus - PPV) и Гранд Арбод (Grand Arbaud - GAV) [21]. Уровень идентичности последовательности белка N KOMV составляет в среднем 30-40% с москитными флебовирусами и 43% с вирусами группы UUKV (табл. 2). Наиболее высоким уровнем (65%) идентичности белок N KOMV обладает с вирусом MWAV, изолированным из клещей Argas abdussalami в Пакистане [22, 23]. Доступные для анализа последовательности глико-протеина-предшественника (Gn/Gc) KOMV обладают от 45% (MURV) до 59% (MWAV) идентичности с вирусами группы UUKV. C москитными флебовирусами данное значение составляет 19-25%. На дендрограмме, построенной на основе сравнения последовательностей Gn/Gc буньяви-русов, так же, как и при анализе белка N, KOMV группируется с вирусами группы UUKV (см. рисунок, б). Максимальный уровень идентичности частичной последовательности RdRp KOMV составил 74% (MWAV). C другими вирусами группы UUKV данное значение составляет в среднем 63%. C москитными флебовирусами RdRp KOMV обладает 31-38% идентичности. Из дендрограммы, построенной на основе филогенетического анализа RdRp буньявирусов, также следует, что KOMV входит в группу UUKV (см. рисунок, в). Вирусы группы UUKV в целом не играют роли в инфекционной патологии человека, хотя АТ к различным вирусам группы обнаруживали у людей при серологических исследованиях. Вместе с тем клещевые флебовирусы обладают определенным, трудно прогнозируемым патогенным потенциалом. В 2009 г. был выявлен новый флебовирус (SFTSV), ставший причиной крупной вспышки лихорадочного заболевания с синдромом тромбоцитопении с высокой летальностью в Китае [24]. Экологически SFTSV связан с клещами Haemophysalis longicornis [25]. Близкий к SFTSV новый флебовирус Heartland (HRTV) был изолирован от 2 пациентов, заболевших после укуса клещей в США в 2011 г. [26]. На основании результатов проведенного филогенетического анализа можно заключить, что KOMV является новым вирусом группы UUKV, образуя самостоятельную ветвь, ближайшим соседом которой является MWAV, изолированный в 1964 г. из клещей Argas abdussalami в Пакистане. Причем таксономическое положение KOMV, определенное по трем разным сегментам генома, практически совпадает. Это говорит о том, что в эволюции KOMV не было события реассортации с другими флебовирусами. Клещи I. uriae в колониях птиц на Командорских островах, где был изолирован KOMV, имеют высокий уровень (1:900) зараженности ZTV -другим вирусом группы UUKV. Ограниченность реас-сортации у клещевых флебовирусов подтверждается и результатами других исследований [21]. В то же время частое возникновение реассортантов характерно для москитных флебовирусов, а также буньявирусов родов Orthobunyavirus и Hantavirus [27-31]. Молекулярные механизмы, ограничивающие реассортацию клещевых флебовирусов, остаются неизученными.

References

Supplementary files