Development of Diagnostic Test System Based on Fluorescent Polarization Immunoassay Method for Detection of Antibodies to HCV Nucleocapsid Protein

Full Text

Гепатит С (ГС) является одним из широко распространенных заболеваний печени. Распространенность в мире хронической формы ГС колеблется в пределах от 0,5 до 3%. В России заболеваемость составляет 56,2 на 100 тыс. населения. У каждого пятого больного хроническим ГС развивается цирроз, у каждого двадцатого — рак печени. В связи с тем что вакцины для профилактики ВГС не существует, в настоящее время является актуальной своевременная диагностика этого заболевания. Лабораторная диагностика ГС основана на выявлении в образцах сывороток или плазмы крови человека антител к антигенам ВГС (анти-ВГС) и проводится с помощью твердофазного иммунофермент-ного анализа (ИФА), который имеет ряд ограничений. В последнее время все более актуальной становится разработка экспрессных методов диагностики, среди которых наиболее перспективным является метод поляризационного флюоресцентного иммуноанализа (ПФИА) [14]. ПФИА относится к гомогенным методам анализа и поэтому по сравнению с повсеместно при меняемыми диагностическими ИФА-тест-системами обладает следующими преимуществами: • не требуется разделение свободной и связанной фракций антигена (отсутствуют стадии отмывки); • анализ выполняется одностадийно; • реакция антиген-антитело протекает в растворе, что сокращает время, необходимое для достижения равновесия системы, Таким образом, анализ методом ПФИА занимает несколько минут, не требует дополнительных стадий промывок и инкубаций. В настоящей работе проведен поиск флюоресцент-но-меченных пептидных последовательностей, наиболее полно отражающих антигенную структуру нуклеокапсидного белка ВГС. Отобранные по результатам поиска пептиды использовали в составе ПФИА-тест-системы, основанной на взаимодействии флюоресцентно-меченных, иммунореактивных В-эпитопов нуклеокапсидного белка ВГС со специфическими анти-ВГС. Контактная информация: Шарышев Антон Андреевич, науч. сотр.; e-mail: sharyshev86@mail.ru 43 Материалы и методы Физические основы метода ПФИА. Метод ПФИА широко вошел в современную практику биохимических исследований после выхода работы G. Weber [13] и предложения W. Dandliker и G. Feigen использовать ПФИА в иммунохимических исследованиях [2]. Поляризацию флюоресценции используют для изучения взаимодействия друг с другом сильно различающихся по размерам молекул[12], например антиген-антитело[9]. Явление поляризации флюоресценции обусловлено двумя одновременно протекающими процессами: броуновским движением молекул и поглощением и испусканием ими плоско поляризованного света. Маленькие флюоресцентные молекулы в водной среде вращаются очень быстро и между поглощением и эмиссией равновероятно принимают любую ориентацию в пространстве, что приводит к полной деполяризации испускаемого света. Если такие молекулы ассоциированы в высокомолекулярный комплекс, степень поляризации флюоресценции будет возрастать, так как большие молекулы и при эмиссии частично сохраняют ту же молекулярную ориентацию, которую имели при поглощении плоско поляризованного света, поэтому их флюоресценция поляризована. Эти процессы иллюстрирует рисунок. Если синтетически сконструировать флюоресцент-но-меченный пептид, аналогичный эпитопу вируса ГС, вызывающему выработку специфических анти-ВГС-антител у инфицированных пациентов, при добавлении флюоресцентно-меченного пептида к сыворотке крови больного по возрастанию поляризации флюоресценции можно детектировать образование антиген-антительного комплекса, а значит и диагностировать вирусный ГС. Данный принцип является основой для разрабатываемой ПФИА диагностической тест-системы. Вирус гепатита С. Вирусный геном ГС, представленный односпиральной (+) РНК, кодирует поли-протеинпредшественник размером около 3000 аминокислотных остатков (а. о.), посттрансляционный процессинг которого приводит к образованию ряда структурных и неструктурных белков [6]. Нуклео-капсидный белок ВГС (HCV-core), ограниченный а. о. 1-192, является одним из наиболее консервативных [6] и иммуногенных в составе вируса и вызывает появление в крови специфических антител уже в ранних стадиях инфекции [1, 5]. Определение антител к нуклеокапсидному белку (aнти-HCV-corе-антител) лежит в основе скрининговых тестов для диагностики инфекции [5], базирующихся на рекомбинантных Таблица 1 Аминокислотные последовательности синтезированных пептидов Пептид № Аминокислотная последовательность Район белка, a. o. 1 FAM-RPQDVKFPGG 17-27 2 FAM-RPQDVKFPGGGQIVGGV 17-34 3 FAM-PGYPWPL 79-85 4 FAM-AQPGYPWPL 77-85 5 FAM-TWAQPGYPWPL 75-85 (или) синтетических антигенах [8, 15]. Согласно современным данным по исследованию антигенной структуры HCV-соге-белка, основные иммунореак-тивные В-эпитопы локализуются в N-концевой части [3, 4, 10, 11], высокой антигенной активностью обладают также эпитопы из центрального региона [17]. Выбор аминокислотных последовательностей. Основываясь на ранее полученных результатах и данных литературы [3, 4, 10, 11, 17], мы решили разрабатывать ПФИА-тест-систему с использованием пептидов, меченных карбоксифлюоресцеином (FAM) с N-конца полипептидной цепи HCV-соге-белка. Аминокислотные последовательности пептидов перекрывали иммунореактивные участки а.о. 7-19 и 20-34 из N-концевой части и а.о. 73-85 из центральной области нуклеокапсидного белка вируса ГС (су6тип1Ь). Последовательности аминокислот синтетических пептидов соответствовали нуклеотидной последовательности генома изолята ВГС (субтип 1b), определенной в результате анализа кДНК клонов из образцов плазмы крови японских пациентов с хроническим гепатитом [7]. Аминокислотный синтез пептидов. Синтез пептидов осуществляли твердофазным методом путем наращивания пептидной цепи с N-конца на тефлоне с радиационно-привитым полистиролом по Boc/ Вzl-стратегии. В синтезе были использованы Boc-аминокислоты и их производные ("Reanal", Венгрия), имеющие L-конфигурацию. Полноту прохождения реакций на носителе проверяли с помощью нингидринового теста. Синтез выполняли в ручном режиме методами активированных эфиров и симметричных ангидридов, используя стандартный протокол проведения синтетического цикла, блокирования непрореагировавших аминогрупп и отщепления пептидов от полимера [18]. Флюоресцентный зонд вводили в структуры пептидов присоединением FAM по карбодиимидной методике. Обессоливание и удаление низкомолекулярных продуктов пептидной природы проводили методом гель-фильтрации на сефадексах G-10, G-15 или G-15 в 10% уксусной кислоте. Пептиды очищали путем полупрепаратив-ной обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на хроматографе фирмы "Du Pont" (США). Индивидуальность пептидов подтверждали в ходе аналитической ВЭЖХ и по данным количественного аминокислотного анализа. Малый размер молекулы Низкая поляризация флюоресценции Большой размер молекулы (комплекса) Высокая поляризация флюоресценции Зависимость поляризации флюоресценции от размера молекулы. 44 Таблица 2 Выявление методом ПФИА, основанного на пептидах № 1-5, анти-HCV-core-позитивных сывороток пациентов с диагнозом ВГС Образец № ОП в ИФА-тест-системе "Вектор-Бест спектр" Позитивность образцов сывороток в ПФИА-тест-системе. анти-core анти- NS N-конец HCV-соге-белка центральная область HCV-соге-белка пептид № 1 пептид № 2 пептид № 3 пептид № 4 пептид № 5 1 3,4 2,2 + + + + + 2 3,3 3,3 - + - - + 3 3,5 3,3 - - - - + 4 3,5 3,3 + + + + + 5 3,4 3,2 + + + + + 6 3,3 3,2 + + + + + 7* 3,3 2,7 - - - - - 8 3,4 3 + + + + + 9* 3,3 3,3 - - - - - 10 3,4 3,4 + + + + + 11 3,6 3,2 + + + + + 12 3,4 3 - - - - + 13 3,3 3,3 + + + + + 14* 3,4 3,4 - - - - - 15 3,3 3 + + - + + 16 3,5 3,5 - + - - - 17 3 3,2 + + - + + 18 3,3 3,2 - + - - - 19 3,6 3,3 - + - - + 20 3,7 3,8 + + + + + 21 3,6 3,8 - - - + - 22 3,7 3,8 - - - - + 23* 3,6 3,9 - - - - - 24 1 2,1 + + + + + 25 3,6 3,7 + + + + + 26 2 0,8 - - - + - 27 3,5 3 - + + - + 28 2,9 - + + + + + 29 3,5 3,5 + + + + + 30* 3,2 3,2 - - - - - 31 3,5 3,6 + + + + + 32 3,5 3,6 + + + + + 33 3,3 3,5 + + + + + 34* 3,4 3 - - - - - 35 3 0,7 - + - - + 36 3,3 3,3 + + + + + 37 3,5 3,4 + + + + + 38 3,2 3,2 + + + + + 39 3,7 3,8 - - - - + 40 3,6 3,8 + + + + + % выявления 55 70 53 60 75 П р и м е ч а н и е . * - сыворотки, не взаимодействующие ни с одним из пептидов. Иммуногенность флюоресцентно-меченных пептидов. Флюоресцентно-меченные пептиды были проверены иммуноферментным методом, который показал, что введение флюоресцентной метки не влияет на иммуногенные свойства синтезированных пептидов. ИФА выполняли по стандартному протоколу [18]. Биологический материал - образцы сывороток крови, содержащие анти-ВГС. Сыворотки отбирались в ходе плановой работы скрининговой лаборатории НИИ СП им. Н.В. Склифосовского. Тестирование проводили при помо-щи коммерческой ИФА-тест-системы "БЕСТ анти-ВГС-комплект 4" производства ЗАО "Век-тор-Бест". Анализ выполняли согласно рекомендованному фирмой-производителем протоколу. По совокупности результатов лабораторных исследований у всех 40 пациентов был установлен диагноз вирусного гепатита С. Методика проведения ПФИА. В боросиликатную кювету вносили 1000 мкл фосфатного буфера (рН 7,4) с добавлением лаурил-сульфата натрия в концентрации 0,05% и 0,1 г/л бычьего гамма-глобулина, содержащего флюоресцентно-меченный пептид в концентрации, при которой интенсивность флюоресценции раствора составляет 1000 усл. ед. Сыворотки вносили таким образом, чтобы итоговое разведение составляло 1/100. Стадии инкубации отсутствовали. Для измерения поляризации флюоресценции использовали TDx-анализатор фирмы "Abbot" в режиме Photo-check. Границы "серой зоны" и "cut off" рассчитывали отдельно для каждого пептида, прибавляя к среднему арифметическому сигналу в кюветах с 20 отрицательными сыворотками (отрицательный контроль) два стандартных арифметических отклонения, рассчитанного для данной выборки. Коэффициентом позитивности (КП) считали отношение значения поляризации флюоресценции в ВГС-позитивном образце к значению "cut off". Результаты и обсуждение В табл. 1 представлены аминокислотные последовательности пептидов № 1-5. Первичная структура синтезированных пептидов соответствует последовательности изолята HCV-J, относящегося к генотипу 1b [7], самому распространенному на территории РФ [16]. Известно, что N-концевая часть нуклеокапсидного белка наиболее консервативна, и отдельные аминокислотные замены в зависимости от типа или субтипа ВГС существенно не влияют на его антигенную активность, что обусловливает универсальность разрабатываемой диагностической тест системы. Иммунореактивность полученных пептидов оценивали по их взаимодействию с анти-НС^позитивными сыворотками в ПФИА-тест-системе. В табл. 2 представлены результаты определения оптических плотностей (ОП) в коммерческой ИФА-тест-системе ("БЕСТ анти-ВГС- комплект 4", ЗАО "Вектор Бест") и взаимодействия флюоресцентно-меченных пептидов с исследуемыми клиническими образцами. 45 Положительными образцами в ПФИА-тест-сис-темах, основанных на пептидах № 1-5, считались те сыворотки, в которых значение поляризации флюоресценции превышало значение суммы среднего арифметического сигнала в кюветах с 20 стандартными отрицательными сыворотками и двух стандартных арифметических отклонениях, рассчитанных для каждого пептида индивидуально. Как видно из табл. 2 из двух пептидов, перекрывающих эпитопы N-концевой части HCV-соге-белка, и пептида № 2 отмечен наибольший процент выявления aнти-HCV-позитивных сывороток. КП пептида № 2 также был выше КП пептида № 1. Высокая иммуногенность пептида № 2 и более высокий процент выявления им положительных образцов обусловлены наличием дополнительного В-эпитопа по сравнению с пептидом № 1 [17]. Тенденция к увеличению процента выявления от 53 до 75% позитивных сывороток и КП сохраняется и при увеличении полипептидной цепи у пептидов № 3-5 из центральной области нуклеокапсидного белка вируса гепатита С. Следует отметить, что из позитивных сывороток только № 7, 9, 14, 23, 30, 34 (15%) не прореагировали ни с одним из синтезированных пептидов, что свидетельствует о сопоставимости результатов диагностической тест-системы, основанной на методе ПФИЛ, и коммерческой ИФА-тест-системы, которая составила около 85%. Выводы 1. Впервые применен метод поляризационного флюоресцентного иммуноанализа для диагностики вирусного гепатита С. 2. Сопоставимость результатов разработанной диагностической тест-системы, основанной на методе ПФИА, и коммерческой ИФА-тест-системы составила 85%. 3. Продемонстрирована возможность повышения чувствительности разрабатываемой ПФИА-тест-сис-темы при увеличении полипептидной цепи в синтетическом флюоресцентно-меченном пептиде. 4. Полученные данные свидетельствует о перспективности дальнейших исследований по разработке ПФИА-тест-системы для диагностики вирусного гепатита С.

References

Supplementary files