The taxonomy of the Khasan Virus (KHAV), a new representative of Phlebovirus Genera (Bunyaviridae), isolated from the ticks Haemaphysalis longicornis (Neumann, 1901) in the Maritime territory (Russia)

Full Text

Введение Вирус Хасан (Khasan virus - KHAV) был изолирован в Хасанском районе на юге Приморского края в 1971 г. из клещей Haemophysalis longicornis Neumann, 1901, собранных с пятнистых оленей Cervus nippon Temmink, 1838. На основании биологических свойств и морфологии вириона KHAV был отнесен к неклассифицированным вирусам сем. Bunyaviridae [1-3]. Семейство Bunyaviridae объединяет четыре рода вирусов животных (Orthobunyavirus, Hantavirus, Phlebovirus и Nairovirus), один род вирусов растений (Tospovirus) и около 40 неклассифицированных вирусов. Большинство буньявирусов животных (за исключением хантавирусов) являются арбовирусами. Геном буньявирусов представлен тремя сегментами РНК негативной полярности (L, M и S), длина и структура которых являются характерными для каждого рода [4]. Таксономия буньявирусов постоянно уточняется в связи с открытием новых вирусов, а также с выработкой критериев классификации вирусов на основе геномных данных [4-8]. На территории Приморского края в природных очагах ранее изолировали буньявирусы родов Orthobunyavirus (Батаи - BATV, зайца-беляка - SSHV) и Hantavirus (Пуу-мала - PPUV, Сеул - SEUV, Хантаан - HTNV). Также на данной территории циркулируют вирусы сем. Flavi-viridae (род. Flavivirus): японского (JEV) и клещевого (TBEV) энцефалитов, Повассан (PWV), Западного Нила (WNV), а также сем. Togaviridae (род Alfavirus): Гета (GETV), сем. Orthomyxoviridae: вирусы гриппа (включая высокопатогенные субтипы H5N1) и др. [3, 9-11]. В настоящей работе для уточнения таксономического положения KHAV геном вируса был частично секве-нирован с использованием технологии секвенирования следующего поколения (next-generation sequencing). На основании филогенетического анализа частичных последовательностей всех трех сегментов генома KHAV отнесен к роду Phlebovirus. Материалы и методы Использованные вирусы и выделение РНК. Вирус Хасан (штамм LEIV-776P) был получен из Государственной коллекции вирусов РФ ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздрава России в виде лиофили-зированной мозговой суспензии. Восстановленной суспензией (0,2 мл) проводили интрацеребральное заражение новорожденных беспородных белых мышей. После развития симптомов поражения ЦНС (2-4-е сутки) мышей забивали в соответствии с правилами содержания и использования лабораторных животных, одобренных комиссией института по этике экспериментов с животными. Фрагменты мозга (около 50 мг) помещали в 350 мкл лизирующего буфера RLT (QIAGEN, Германия) и гомогенизировали в гомогенизаторе TyssueLyser LT той же фирмы. Далее РНК была выделена набором RNeasy mini kit (QIAGEN, Германия) на автоматической станции QIAcube той же фирмы в соответствии с инструкцией. Концентрацию РНК измеряли с использованием флюориметра Qubit ("Invitrogen", США). Подготовка библиотек и секвенирование. 100 нг тотальной РНК фрагментировали в 15 мкл реакционной смеси для обратной транскриптазы (50 мМ Tris-HCl (pH 8,3, при 25°C), 50 мМ KCl, 4 мМ MgCl2, 10 мМ DTT, dNTP (1 мМ каждого) и гексапраймер (0,2 мкг)) при 85°С в течение 5 мин, после чего помещали в лед. К фрагментированной РНК добавляли 200 ед. фермента RevertAid Premium ("Thermo Scintific", США) и 20 ед. ингибитора РНаз RNasin ("Promega", США). Инкубировали при 25°С в течение 10 мин, далее при 42°С в течение 60 мин. Реакцию останавливали прогреванием при 70°С в течение 10 мин. Синтез второй цепи кДНК проводили с использованием набора NEBNext® mRNA Second Strand Synthesis Module (NEB, США) в соответствии с инструкцией. Полученную дцДНК очищали с использованием набора MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN, Германия) на автоматической станции QIAcube. Для получения ДНК библиотек из дцДНК использовали набор TruSeq DNA Sample Prep Kits v2 ("Illumina", США) в соответствии с инструкцией. Полученные библиотеки визуализировали на станции автоматического электрофореза QIAxcel Advanced System (QIAGEN, Германия). Молярность полученных библиотек определяли с помощью метода ПЦР в реальном времени (2-кратно SsoFast EvaGreen Supermix ("Bio-Rad", США), прибор Bio-Rad CFX1000) согласно рекомендациям, изложенным в руководстве "Sequencing Library qPCR Quantification Guide" ("Illumina", США). Секвенирование ДНК-библиотек проводили на приборе MiSeq (Illumina, США) с использованием набора "MiSeq Reagent Kits v2 (300PE)" в соответствии с инструкцией производителя. Биоинформационный анализ. Обработку данных полногеномного секвенирования, сборку контигов и картирование ридов осуществляли, используя программу "CLC Genomics Workbench 5.5" ("CLC bio", США). Предварительный поиск гомологичных последовательностей проводили с помощью сервиса BLASTX (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Для подбора праймеров, 16 Дендрограммы, построенные на основе сравнения частичных последовательностей белков буньявирусов. а - фрагмент RdRp (150-337 а.о.); б - фрагмент белка Gn (71-356 а.о.). множественного выравнивания, анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей использовали пакет программ Lasergene Core Suite ("DNAstar", США). Выравнивание последовательностей осуществляли по алгоритму ClustalW [12]. Филогенетический анализ и построение дендрограмм проводили с использованием программы MEGA 5 [13]. Поиск сайтов гликозилирова-ния, сайтов нарезания сигнального пептида и трансмембранных доменов выполняли, используя on-line ресурсы NetNGlyc1.0, SignalP и TMHMM2.0 соответственно (сайт CBS Prediction Servers http://www.cb.sdtu.dk/services). Результаты и обсуждение В результате секвенирования и сборки ридов получили 2878 последовательностей (контигов) длиной от 250 до 3807 нуклеотидных остатков (н.о.). При анализе полученных контигов с использованием on-line сервиса BLASTX были найдены 12 контигов длиной от 348 до 942 н.о., обладающих гомологией с вирусами рода Phlebovirus (Bunyaviridae). Для L-сегмента получили семь фрагментов, распределенных от 173 до 1626 аминокистотных остатков (а.о.) по RdRp вируса Уку-ниеми (Uukuniemi, UUKV). Общая длина кодирующей части полученных фрагментов составила около 730 а.о. Для М-сегмента получили последовательности четырех участков, лежащих в пределах от 71 по 939 а.о. (по UUKV). Общая длина полученных последовательностей для М-сегмента составляет 600 а.о. Только один фрагмент S-сегмента, соответствующий 19-75 а.о. белка нуклеокапсида (N), определили у KHAV. Таким образом, в результате секвенирования установили частичные последовательности всех трех сегментов генома KHAV. Ранее мы показали, что полноразмерное de novo секвенирование генома РНК-содержащих вирусов возможно проводить без предварительной очистки вируса, используя суммарную РНК, выделенную из тканей мозга зараженных мышей [5]. Ограничивающим фактором при этом является количество (титр) вируса в материале. Согласно ранее изученным биологическим свойствам, титр KHAV при заражении мышей-сосунков может достигать 7 log LD50 [1]. Таким образом, низкий титр виру са в материале позволил нам получить только частичные последовательности генома. На основе филогенетического анализа полученных последовательностей KHAV был отнесен к роду Phlebovirus. К роду Phlebovirus отнесены около 70 вирусов, которые на основании экологических, антигенных и геномных свойств разделены на две группы - Москитной лихорадки (Sandfly fever) и Укуниеми (UUKV). Вирусы группы Москитной лихорадки переносятся москитами и комарами, тогда как вирусы UUKV передаются клещами [4]. Из дендрограмм, построенных на основе частичных последовательностей белков Gn (71-356 а.о.) и RdRp (150-337 а.о.), следует, что KHAV группируется с клещевыми флебовирусами группы UUKV (см. рисунок). Ранее при описании морфологии вириона было показано, что нуклеокапсид KHAV имеет структурные элементы (филаменты длиной до 10 нм), которые характерны для UUKV, но отсутствие четких антигенных связей KHAV с вирусами Залив терпения (ZTV) и UUKV не позволило отнести KHAV к группе UUKV [1, 14]. На основе серологического и филогенетического анализа в группу UUKV объединены клещевые флебовирусы UUKV, Чизе - CHZV, Залив терпения - ZTV, Мюр-ре - MURV, Манава - MWAV, Прекариус Пойнт - PPV, Гранд Арбо - GAV [7]. Дискуссионным остается вопрос о включении в серогруппу UUKV вирусов группы Бханджа (Бханджа - BHAV, Форекария - fOrV, Кисмайо - KISV, Раздан - RAZV) и тяжелой лихорадки с синдромом тром-боцитопении (SFTSV, Heartland - HEV), которые формируют отдельные филогенетические группы [7, 8, 15, 16]. Помимо антигенных связей, все клещевые флебовирусы объединяют особенности экологии и структура генома, отличительной чертой которой является отсутствие неструктурного белка NSm в М-сегменте [4]. Нужно отметить, что клещи H. longicornis, из которых был изолирован KHAV, играют основное значения в экологии SFTSV (синоним Huaiyangshan virus), вызвавшего эпидемическую вспышку лихорадочного заболевания с высокой (до 30%) летальностью в западных районах Китая в 2009 г. [17, 18]. Таким образом, на основании филогенетического анализа частичных последовательностей всех трех сегментов 17 генома KHAV был отнесен нами к роду Phlebovirus. Здесь KHAV формирует отдельную ветвь, близко группируясь к вирусам группы UUKV и обладая с ними на анализируемых участках генома до 62% идентичности. Максимальный уровень идентичности наблюдается для фрагментов RdRp. Уровень гомологии KHAV с клещевыми вирусами группы UUKV составляет от 50 до 62%, тогда как с москитными флебовирусами это значение не превышает 30%. Однако вопрос о включении KHAV в группу UUKV или его выделении в отдельную группу в составе рода Phlebovirus требует дальнейшего изучения, и прежде всего определения полной последовательности генома KHAV.

References

Supplementary files