The taxonomy of the issyk-Kul virus (iSKV, Bunyaviridae, Nairovirus), the etiologic Agent of the issyk-Kul fever isolated from bats (Vespertilionidae) and ticks Argas (Carios) vespertilionis (Latreille, 1796)

Full Text

Введение Вирус Иссык-Куль (Issyk-Kul; ISKV) - этиологический агент Иссык-Кульской лихорадки (ИКЛ) впервые был выделен в 1973 г. в Киргизии от летучих мышей Nyctalus noctula Schreber, 1774 (Chiroptera: Vespertilionidae) и их облигатных паразитов - клещей Argas (Carios) vespertilionis Latreille, 1796 (Parasitiformes: Argasidae) [1, 2]. Позднее ISKV выделяли и от других видов летучих мышей, птиц, комаров, а также от заболевших ИКЛ людей [3-7]. Спорадическую заболеваемость и эпидемические вспышки ИКЛ регистрируют в странах Средней Азии с 1979 г. Уровень иммунной прослойки к ISKV у населения Киргизии составляет до 1,5% (в Чуйской долине). В Таджикистане иммунная прослойка составляет в среднем 2,7%, достигая 7,8% в южных районах [5]. В западной части Туркмении антитела к ISKV выявлены у 9% населения. Случаи заболеваемости ИКЛ, как правило, связаны с обитанием в жилых помещениях летучих мышей, а заражение ISKV может происходить респираторным, алиментарным или трансмиссивным путем [5-7]. Основным природным резервуаром ISKV являются рукокрылые (Chiptera), прежде всего сем. Vespertionidae - рыжая вечерница (N. noctula), поздний кожан (Vesper-tilio serotinus Schreber, 1774), нетопырь карлик (Pipistrellus pipistrellus Schreber, 1774), остроухая ночница (Myotis blythi Tomes, 1857; Myotis oxygnathus Monticelli, 1885) и др., а также аргасовы клещи комплекса Argas (Carios) ver-spertilionis. Некоторое значение в циркуляции ISKV имеют комары Aedes spp, Anopheles spp. и Culex pipiens [4]. На основании морфологии вириона ISKV отнесен к семейству Bunyaviridae, более точная классификация (до рода) оказалась невозможной в связи с отсутствием антигенных связей с известными буньявирусами [1]. В результате ISKV причислен к группе неклассифицированных буньявирусов, к которым отнесены около 40 вирусов [8]. В настоящей работе геном ISKV был секвенирован de novo с использованием технологии полногеномного сек-венирования. На основании проведенного молекулярногенетического и филогенетического анализа ISKV отнесен к роду Nairovirus (сем. Bunyaviridae). Контактная информация: Альховский Сергей Владимирович, e-mail: salkh@ya.ru 11 Материалы и методы Использованные вирусы и выделение РНК. Вирус Иссык-Куль (штамм ЬБ]^-315К) был получен из Государственной коллекции вирусов РФ ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздрава России в виде лиофилизированной мозговой суспензии. Восстановленной суспензией (0,2 мл) проводили интрацеребральное заражение новорожденных беспородных белых мышей. После развития симптомов поражения ЦНС (2-4-е сутки) мышей забивали в соответствии с правилами содержания и использования лабораторных животных, одобренных комиссией института по этике экспериментов с животными. Фрагменты мозга (около 50 мг) помещали в 350 мкл лизирующего буфера RLT (QIAGEN, Германия) и гомогенизировали в гомогенизаторе TyssueLyser LT той же фирмы. Далее РНК была выделена набором RNeasy mini kit (QIAGEN, Германия) на автоматической станции QIAcube (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией. Концентрацию РНК измеряли с использованием флюориметра Qubit ("Invitrogen", США). Подготовка библиотек и секвенирование. 100 нг тотальной РНК фрагментировали в 15 мкл реакционной смеси для обратной транскриптазы (50 мМ Tris-HCl (pH 8,3, при 25°C), 50 мМ KCl, 4 мМ MgCl2, 10 мМ DTT, dNTP (1 мМ каждого) и гексапраймер (0,2 мкг)) при 85°С в течение 5 мин, после чего помещали в лед. К фрагментированной РНК добавляли 200 ед. фермента RevertAid Premium ("Thermo Scintific", США) и 20 ед. ингибитора РНКаз RNasin ("Promega", США). Инкубировали при 25°С в течение 10 мин, далее при 42°С в течение 60 мин. Реакцию останавливали прогреванием при 70°С в течение 10 мин. Синтез второй цепи кДНК проводили с использованием набора "NEBNext® mRNA Second Strand Synthesis Module" (NEB, США) в соответствии с инструкцией. Полученную дцДНК очищали с использованием набора "MinElute PCR Purification Kit" (QIAGEN, Германия) на автоматической станции QIAcube. Для получения ДНК библиотек из дцДНК использовали набор "TruSeq DNA Sample Prep Kits v2" ("Illumi-na", США) в соответствии с инструкцией. Полученные библиотеки визуализировали на станции автоматического электрофореза QIAxcel Advanced System (QIA-GEN, Германия). Молярность полученных библиотек измеряли с помощью метода ПЦР в реальном времени (2-кратно SsoFast EvaGreen Supermix ("Bio-Rad", США), прибор Bio-Rad CFX1000) согласно рекомендациям, изложенным в руководстве "Sequencing Library qPCR Quantification Guide" ("Illumina", США). Таблица 1 Уровень (в %) идентичности полноразмерных последовательностей белков ISKV с вирусами рода Nairovirus Вирус RdRp (L-сегмент) Gc/Gn (M-сегмент) N (S-сегмент) ККГЛ (CCHF) 44 35 36 Болезнь овец Найроби (NSDV) 43 33 35 Дугбе (DUGV) 47 34 34 Купе (KUV) 47 35 35 Хазара (HAZV) 43 37 34 Ерве (ERVEV) 41 32 35 Секвенирование ДНК-библиотек проводили на приборе MiSeq ("Illumina", США) с использованием набора MiSeq Reagent Kits V2 (300PE) в соответствии с инструкцией производителя. Биоинформационный анализ. Обработку данных полногеномного секвенирования, сборку контигов и картирование ридов осуществляли, используя программу "CLC Genomics Workbench 5.5" ("CLC bio", США). Предварительный поиск гомологичных последовательностей проводили с помощью сервиса BLASTX (http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov). Для подбора праймеров, множественного выравнивания, анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей использовали пакет программ Lasergene Core Suite ("DNAstar", США). Выравнивание последовательностей выполняли по алгоритму ClustalW [9]. Филогенетический анализ и построение дендрограмм осуществляли, применяя программу MEGA 5. Поиск сайтов гликозилирования, сайтов нарезания сигнального пептида и трансмембранных доменов проводили с использованием on-line ресурсов NetNGlyc1.0, SignalP и TMHMM2.0 соответственно (сайт CBS Prediction Servers http://www.cb.sdtu. dk/services). Результаты и обсуждение Индексированная ДНК-библиотека, полученная на матрице суммарной РНК из материала, который содержал ISKV (ткани мозга зараженных мышей-сосунков), была секвенирована в мультиплексном формате. Возможность такого подхода для полногеномного секвени-рования РНК-вирусов показана нами ранее [10]. В результате de novo сборки коротких ридов (от англ. reads) Таблица 2 Уровень (в %) идентичности частичной последовательности (118 а.о.) каталитического центра RdRp наировирусов Вирус 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 ISKV 1 *** 75,7 71,6 70,9 75,7 69,6 66,9 74,6 68,9 66,9 68,9 66,9 Tillamook 2 *** 75,0 76,4 74,3 75,0 72,3 73,9 75,0 72,3 75,7 68,9 Abu hammad 3 *** 89,2 76,4 76,4 74,3 76,8 75,0 70,3 70,9 67,6 Abu mina 4 *** 75,0 77,0 74,3 76,8 77,0 70,9 70,9 68,2 Bandia 5 *** 72,3 73,0 94,2 72,3 68,2 70,3 67,6 Farallon 6 *** 91,9 71,0 97,3 70,9 75,7 70,3 Punta Salinas 7 *** 71,7 91,9 70,9 71,6 71,6 Qalyub 8 *** 69,6 65,9 68,8 64,5 Raza 9 *** 70,3 73,6 70,3 DUGV 10 *** 85,8 73,6 CCHFV 11 *** 75,7 ERVEV 12 *** 12 Рис. 1. Дендрограммы, построенные на основе сравнения полноразмерных аминокислотных последовательностей белков буньявирусов животных. а - RdRp; б - структурные белки оболочки Gc/Gn; в - белок нуклеокапсида N. получили протяженные последовательности длиной от 250 до 12 238 нуклеотидных остатков (н.о.), которые проанализировали, используя on-line сервис BLASTX с ограничением поиска по таксону "viruses (taxid 10239)". Три последовательности (длиной 12 238, 5297 и 1754 н.о.) были определены как содержащие открытые рамки считывания (ОРС) белков, обладающих гомологией с белками вирусов рода Nairovirus семейства Bunyaviridae. Таким образом, большая часть генома ISKV, состоящего из трех сегментов РНК (L, M и S) негативной полярности, была секвенирована. Структура генома ISKV является характерной для наи-ровирусов. L-сегмент кодирует РНК-зависимую РНК-полимеразу (RdRp). М-сегмент кодирует полипротеин-предшественник двух структурных оболочечных гликопротеидов ^с и Gn). S-сегмент кодирует структурный белок нуклеокапсида (N) [8]. L-сегмент ISKV содержит одну ОРС длиной 11 877 н.о., которая кодирует белок RdRp длиной 3958 аминокислотных остатков (а.о.). Расчетная масса RdRp составляет 452 кД. Размер RdRp ISKV соответствует другим найровирусам, у которых он может варьировать от 3863 (вирус Эрве (ERVEV)) до 4050 а.о. (вирус Дугбе (DUGV)). Уровень идентичности полноразмерного RdRp ISKV с наировирусами составляет в среднем 45% (от 41% для ERVEV до 47% для DUGV) (табл. 1). M-сегмент ISKV кодирует полипротеин-предшественник длиной 1631 а.о. (у других наировирусов от 1296 (ERVEV) до 1684 а.о. (вирус Крымской-Конго геморрагической лихорадки (CCHFV)). В полипротеине (с использованием программы SignalP) найден сигнальный пептид, который состоит из первых 29 а.о., а сайт его нарезания представлен последовательностью AWC/GD. Предполагаемый сайт нарезания зрелых белков Gn/Gc в виде PVQ/GL определен в позиции 952/953 (по полипротеину). Это подтверждается расположением трансмембранных доменов в С-концевой части зрелых белков Gc и Gn, выявленных с использованием программы TMHMM 2.0. Уровень идентичности полипротеина-предшественника Gn/Gc ISKV с наировирусами составляет от 32 до 37% (см. табл. 1). S-сегмент наировирусов имеет одну ОРС, кодирующую структурный белок нуклеокапсида. Его длина варьирует от 482 (CCHFV) до 630 (ERVEV) а.о. Длина белка N у ISKV составляет 485 а.о., а уровень его идентичности с известными наиро-вирусами в среднем достигает 35% (см. табл. 1). В род Nairovirus включены 35 вирусов, которые объединены в 7 серо-групп: CCHF, DUGV, Тиафора (Tiafora - TFAV), Дера Гази Хан (Dera Ghazi Khan - DGKV), Хьюз (Hughes - HUGV), Сахалин (Sakhalin - SAKHV) и Калюб (Qalyub - QYBV) [8]. Полные последовательности генома сегодня известны только для вирусов групп CCHF и DUGV, а также для ERVEV (группа TFAV) [11-14]. Поэтому возможности сравнительного молекулярно-генетического и филогене 13 Рис. 2. Дендрограмма, построенная на основе сравнения консервативного участка (118 а.о.) каталитического центра RdRp наировирусов. Справа указаны антигенные группы. тического анализа полноразмерных белковых последовательностей наировирусов ограничены. Уровень идентичности белков среди наировирусов указанных серогрупп составляет от 35 до 68%. Наиболее консервативным белком наировирусов, как и всех буньявирусов, является RdRp [8]. Так, уровень идентичности RdRp между вирусами группами CCHFV и DUGV составляет около 65%. ERVEV обладает с вирусами CCHFV и DUGV около 46% идентичности [11]. Геномные данные о вирусах рода Nairovirus других серогрупп ограничены частичными последовательностями (118 а.о.) консервативного участка каталитического центра RdRp [15]. Уровень гомологии между наирови-русами разных серогрупп на данном участке RdRp составляет от 65 до 75% (табл. 2). Максимальный уровень идентичности ISKV здесь составляет 75,7% с вирусом Тиламук (Tillamook, TILV; серогруппа SAKHV) и Бан-диа (Bandia, BDAV; серогруппа QYBV). С остальными вирусами ISKV уровень идентичности составляет от 65 (DUGV) до 74% (QYBV). Идентичность структурных оболочечных белков Gn/Gc у наировирусов с секвенированным геномом составляет от 40 до 50%. ERVEV обладает наименьшим уровнем идентичности с вирусами групп CCHFV и DUGV по оболочечным белкам (33-39%). Такая гетерогенность связана с давлением иммунного ответа, направленного в первую очередь на внешнюю часть оболочечных белков, несущих основные антигенные детерминанты. ISKV по уровню идентичности (32-37%) оболочечных белков является равноудаленным от наировирусов серогрупп CCHFV, DUGV и TFAV. Идентичность белка нуклеокапсида N среди наировирусов варьирует от 56 до 63%, при этом ERVEV также является наиболее гетерогенным среди них (41-44% идентичности) [11]. Таким образом, хотя наиболее консервативным белком является RdRp, уровень дивергенции белка N в целом совпадает с уровнем, характерным для RdRp. Однако уровень идентичности белка N ISKV с наировирусами практически совпадает со значениями, полученными для полипротеина Gn/Gc, и не превышает 37%. Филогенетический анализ провели методом "присоединения соседей" (neighbor-joining) на основе выровненных (ClustalW) полноразмерных белковых последовательностей всех трех сегментов буньявирусов животных (рис. 1). На построенных дендрограммах видно, что ISKV наиболее близко группируется с вирусами рода Nairovirus. Структура генома ISKV, уровень идентичности белков и результаты филогенетического анализа позволяют отнести ISKV к роду Nairovirus. При анализе полноразмерных последовательностей ISKV формирует внешнюю по отношению к CCHVF, DUGV и TFAV ветвь и является, таким образом, наиболее дивергентным из наи-ровирусов, для которых известны полные последовательности генома. При анализе частичных последовательностей RdRp (рис. 2) ISKV также формирует самостоятельную ветвь, которая соответствует новой группе, наиболее близкой (но равноудаленной) от вирусов групп SAKHV и QYBV. ISKV экологически связан с мигрирующими рукокрылыми. Предполагаемый ареал ISKV охватывает обширные территории Африки, Австралии и Океании и совпадает с ареалом облигатных паразитов рукокрылых - клещей комплекса A. (Carios) verspertilionis, являющихся основным переносчиком и, возможно, резервуаром ISKV в природе. Это подтверждается выделением в Малайзии антигенно близкого вируса Кетерах [16]. Полученные нами данные, помимо решения фундаментальных задач, связанных с описанием генетического разнообразия и таксономии вирусов, могут быть использованы для разработки молекулярно-генетических методов детекции ISKV (ПЦР) в целях мониторинга и диагностики ИКЛ на эндемичных территориях.

References

Supplementary files