Experimental infection caused by influenza A (H5N1) virus in common gull ( Larus canus)

Abstract

The influenza A/common gull/chany/P/2006 (H5N1) virus strain isolated from a clinically healthy common gull ( Larus canus) caused no death of its natural host (a common gull). The virus was shown to be capable for effective replication in the tissues of the lung, spleen, and upper respiratory tract and in the intestinal mucosal cells of the common gull with further environmental virus liberation elimination along with mucinous discharges from the cloaca and fauces for 2 weeks. The potential role of this bird species in the circulation of influenza virus is discussed.

Full Text

Природным резервуаром вируса гриппа являются различные перелетные птицы, принадлежащие к отрядам гусеобразных (Anseriformes) и ржанкообразных (Charadriiformes) [16]. Они широко распространены во всем мире и в основном представлены видами, мигрирующими на далекие расстояния [15]. В 2005 г. была зарегистрирована эпизоотия гриппа птиц на территории Новосибирской области среди разных видов домашних и диких птиц. Результаты филогенетического анализа указывают на то, что вирус гриппа был занесен с территории Китая, по-видимому, дикими перелетными птицами в период весенней миграции [3, 13]. В июле 2006 г. от сизой чайки, не имеющей видимых признаков болезни, был выделен вирус A/common gull/Chany/P/2006 Н5Ш-субтипа. Генетически вирус охарактеризован как высокопатогенный для кур, однако в эксперименте он показал более низкую степень патогенности для кур по сравнению с другими штаммами вируса гриппа Н5Ш-субтипа, выделенными на территории Западной Сибири (показатель внутривенного теста на патогенность был равен 1,7). Таким образом, обладая патогенным потенциалом для кур, вирус не вызывал видимого клинического проявления болезни у своего естественного хозяина в природных условиях [6, 12]. Дикие птицы относительно устойчивы к вирусу гриппа птиц [2]. Было показано, что некоторые виды диких уток (представителей отряда гусеобразных) могут быть носителями вируса гриппа Н5-субтипа до 3 нед, выделяя вирус в высоких концентрациях с фекалиями, при этом в большинстве случаев видимых признаков болезни не наблюдается [14]. Роль представителей отряда ржанкообразных в поддержании циркуляции патогенных вариантов вируса гриппа Н5-субтипа в природе к настоящему времени изучена недостаточно. Целью исследований явилась оценка восприимчивости диких птиц вида сизая чайка (Larus canus) к штамму вируса гриппа A/common gull/Chany/P/2006 (H5N1) при экспериментальном инфицировании. Материалы и методы Животные. В эксперименте были использованы птицы вида сизая чайка (Larus canus) 6-недельного возраста. Яйца птиц были собраны из гнезд на колониальных поселениях сизых чаек. Инкубация яиц и выращивание молодняка были проведены на биологическом стационаре Института систематики и экологии животных СО РАН. Работу с инфицированными животными выполняли в условиях инфекционного вивария с уровнем биобезопасности BSL-2 с соблюдением рекомендаций, изложенных в работе [4]. Вирус: A/common gull/Chany/P/2006 (H5N1) в виде аллантоисной жидкости развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) (6-й пассаж на РКЭ) с титром 108,5ЭИД/мл. Инфицирование проводили дозой вируса 106ЭИД50/мл в объеме 1 см3 на птицу путем нанесения на слизистые оболочки носовых ходов, конъюнктивы и ротовой полости. В течение 14 дней после инфицирования у каждой птицы ежедневно брали мазки из клоаки и глотки. На 2, 4, 6, 8, 10 и 14-е сутки прибегали к эвтаназии одной или двух птиц для определения наличия вируса в тканях органов. титры вируса в мазках из клоаки и глотки определяли следующими методами. ОТ-ПЦР в реальном времени. Для выделения РНК использовали набор «SV Total RNA Isolation system» («Promega», США), для ПЦР в реальном времени -набор «АмплиСенс Influenza virus A H5N1-FL» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) согласно инструкции производителей. Инфицирование РКЭ. Готовили 2 последовательных 10-кратных разведения исследуемого материала. Для инфицирования использовали РКЭ 9-дневного возраста с последующим подтверждением наличия вируса в аллантоисной жидкости РКЭ при помощи реакции ге-магглютинации (РГА) с использованием 1% суспензии эритроцитов петуха [17]. Статистический анализ. Значение 50% эмбриональной инфекционной дозы (ЭИД50) рассчитывали по методу Кербера в модификации Ашмарина [1]. Результаты Восприимчивость к вирусу при экспериментальном инфицировании птиц вида сизая чайка (Larus canus), которые являются естественными хозяевами штамма вируса гриппа A/common gull/Chany/P/2006 (H5N1), оценивали по способности вируса эффективно продуцироваться в организме подопытных птиц, вызывая заболевание с Результаты исследования мазков из глотки и клоаки птиц при помощи ОТ-ПЦР в реальном времени Сутки п. и. Количество птиц (голов) Результат ОТ-ПЦР в реальном времени мазки из глотки мазки из клоаки +/- % положительных проб +/- % положительных проб 1 9 9/9 100 8/9 88,9 2 9 9/9 100 8/9 88,9 3 8 8/8 100 7/8 87,5 4 8 5/8 62,5 7/8 87,5 5 6 3/6 50 5/6 83,3 6 4 2/4 50 3/4 75 8 3 2/3 66,7 2/3 66,7 10 3 1/3 33,3 1/3 33,3 12 2 2/2 100 2/2 100 14 2 2/2 100 2/2 100 Примечание. п. и. - после инфицирования; +/--количество положительных проб от общего количества. выделением вируса во внешнюю среду и накоплением в тканях внутренних органов. Было отмечено, что вирус способен вызывать болезнь у инфицированных птиц, которая проявлялась конъюнктивитами, диареей, гиперемией глотки. Неврологические симптомы, за исключением снижения аппетита и активности, не отмечены. Случаи специфической гибели птиц в течение всего периода наблюдения не зарегистрированы. Выделение вируса во внешнюю среду со слизистыми выделениями клоаки и глотки в От-ПЦР в реальном времени регистрировали в течение всего периода наблюдения, который в эксперименте составил 2 нед (см. таблицу). В течение первых 3 сут после инфицирования процент птиц, выделяющих вирус со слизью из глотки, составил 100, из клоаки - 88,9. С 4-х по 6-е сутки этот показатель для мазков из клоаки превышал таковой для мазков из глотки. Однако в целом наблюдается общая тенденция к уменьшению этих показателей до 10-х суток. Обе особи, которые остались в эксперименте после 12 сут, выделяли вирус и из глотки, и из клоаки. На протяжении эксперимента вирус был выявлен у всех подопытных птиц. Наибольшие титры вируса в мазках из глотки были зарегистрированы в 1-е сутки, а из клоаки - на 4-е сутки после инфицирования. титр вируса в мазках из глотки постепенно снижается в течение всего периода наблюдения, а в мазках из клоаки наблюдается увеличение концентрации вируса к 4-му дню с последующим уменьшением. Начиная с 8-го дня титры вируса в мазках как из глотки, так и из клоаки не превышали 1,0 lg ЭИД50/мл. При анализе количества птиц, выделяющих инфекционный вирус со слизистыми выделениями из клоаки и глотки (см. рисунок), можно отметить, что до 5-х суток после инфицирования процент положительных проб мазков из глотки выше аналогичного значения для клоакальных проб. Начиная с 6-х суток значения этих показателей равны. Полученные данные свидетельствуют о том, что наиболее активно птицы выделяют инфекционный вирус в течение первых 5 сут после инфицирования. Определение вируса в тканях внутренних органов подопытных птиц без определения его количественных показателей было проведено путем инфицирования РКЭ. Вирус гриппа был диагностирован в ткани легких на 2, 4 и 6-е сутки, селезенки - на 4-е и 6-е сутки и кишечника - на 14-е сутки после инфицирования. 5 6 Сутки после инфицирования ЦЦ Титр вируса в мазках из глотки Титр вируса в мазках из клоаки Титры вируса в мазках из глотки и клоаки. Титры вируса выражены в lg ЭИД50 в 1 мл исследуемого образца в виде M ± SD, где M - среднее значение, SD - стандартное отклонение, ЭИД50 -50% эмбриональная инфекционная доза. Над соответствующими столбцами указано отношение количества положительных проб к количеству исследованных. Обсуждение Представители отряда ржанкообразных (Charadrii-formes), в частности семейства чайковых (Laridae), играют важную роль в циркуляции вируса гриппа А. Для территории Евразии дикие птицы вида сизая чайка являются массовым, широко распространенным видом диких птиц, способным совершать длительные миграции и имеющим при этом тесный контакт со многими видами диких и домашних птиц. Восприимчивость птиц семейства чайковых к вирусу гриппа А показана в ряде работ [2, 8-11]. В данной работе представлены результаты моделирования приближенного к естественному инфекционного процесса, вызванного вирусом A/common gull/Chany/P/2006 (H5N1). Для моделирования гриппозной инфекции нами были использованы дикие птицы вида сизая чайка, которые являются природным хозяином штамма вируса гриппа A/common gull/Chany/P/2006 (H5N1). Инфицирование проведено, наиболее приближенным к естественному для диких птиц водного и околоводного комплекса путем нанесения вируса на слизистые оболочки носовых ходов, конъюнктивы и ротовой полости. Было установлено, что вирус A/common gull/Chany/ P/2006 (H5N1) при экспериментальном инфицировании вызывает у птиц вида сизая чайка (Larus canus) нелетальную инфекцию, которая проявляется воспалительными процессами негнойного характера в местах внедрения вируса, временным общим угнетением. При этом инфицированные птицы не теряют способность к полетам и, следовательно, к механическому распространению вируса. Штамм вируса гриппа A/common gull/Chany/P/2006 (H5N1) при экспериментальном заражении сизых чаек способен к эффективной репродукции в тканях верхних дыхательных путей, легких, селезенки, в клетках слизистых оболочек кишечника с последующим выделением во внешнюю среду. Инфицированные птицы выделяли инфекционный вирус из клоаки и глотки в течение 2 нед, т. е. на протяжении всего периода наблюдения. Вирус гриппа был выявлен у всех подопытных птиц, что говорит о высокой степени восприимчивости этого вида к исследуемому штамму вируса гриппа. Полученные результаты свидетельствуют о возможности активного участия птиц вида сизая чайка в распространении высокопатогенного вируса гриппа во время миграций. Случаи заболевания гриппом H5N1 регулярно регистрируются у животных, в частности у птиц семейства чайковых (Laridae), что делает актуальным дальнейшее изучение роли чаек в экологии вируса гриппа А.