Экспериментальная инфекция сизой чайки ( Larus canus), вызванная вирусом гриппа A/H5N1

Аннотация

Штамм вируса гриппа A/common gull/chany/P/2006 (H5N1), выделенный от клинически здоровой сизой чайки ( Larus canus), при экспериментальном инфицировании не вызывает гибель своего естественного хозяина (сизая чайка). Показано, что вирус способен к эффективной репликации в тканях легких, селезенки, верхних дыхательных путей, в клетках слизистых оболочек кишечника сизой чайки с последующим выделением во внешнюю среду со слизистыми выделениями из клоаки и глотки в течение 2 нед. Обсуждается потенциальная роль этого вида птиц в циркуляции вируса гриппа.

Полный текст

Природным резервуаром вируса гриппа являются различные перелетные птицы, принадлежащие к отрядам гусеобразных (Anseriformes) и ржанкообразных (Charadriiformes) [16]. Они широко распространены во всем мире и в основном представлены видами, мигрирующими на далекие расстояния [15]. В 2005 г. была зарегистрирована эпизоотия гриппа птиц на территории Новосибирской области среди разных видов домашних и диких птиц. Результаты филогенетического анализа указывают на то, что вирус гриппа был занесен с территории Китая, по-видимому, дикими перелетными птицами в период весенней миграции [3, 13]. В июле 2006 г. от сизой чайки, не имеющей видимых признаков болезни, был выделен вирус A/common gull/Chany/P/2006 Н5Ш-субтипа. Генетически вирус охарактеризован как высокопатогенный для кур, однако в эксперименте он показал более низкую степень патогенности для кур по сравнению с другими штаммами вируса гриппа Н5Ш-субтипа, выделенными на территории Западной Сибири (показатель внутривенного теста на патогенность был равен 1,7). Таким образом, обладая патогенным потенциалом для кур, вирус не вызывал видимого клинического проявления болезни у своего естественного хозяина в природных условиях [6, 12]. Дикие птицы относительно устойчивы к вирусу гриппа птиц [2]. Было показано, что некоторые виды диких уток (представителей отряда гусеобразных) могут быть носителями вируса гриппа Н5-субтипа до 3 нед, выделяя вирус в высоких концентрациях с фекалиями, при этом в большинстве случаев видимых признаков болезни не наблюдается [14]. Роль представителей отряда ржанкообразных в поддержании циркуляции патогенных вариантов вируса гриппа Н5-субтипа в природе к настоящему времени изучена недостаточно. Целью исследований явилась оценка восприимчивости диких птиц вида сизая чайка (Larus canus) к штамму вируса гриппа A/common gull/Chany/P/2006 (H5N1) при экспериментальном инфицировании. Материалы и методы Животные. В эксперименте были использованы птицы вида сизая чайка (Larus canus) 6-недельного возраста. Яйца птиц были собраны из гнезд на колониальных поселениях сизых чаек. Инкубация яиц и выращивание молодняка были проведены на биологическом стационаре Института систематики и экологии животных СО РАН. Работу с инфицированными животными выполняли в условиях инфекционного вивария с уровнем биобезопасности BSL-2 с соблюдением рекомендаций, изложенных в работе [4]. Вирус: A/common gull/Chany/P/2006 (H5N1) в виде аллантоисной жидкости развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) (6-й пассаж на РКЭ) с титром 108,5ЭИД/мл. Инфицирование проводили дозой вируса 106ЭИД50/мл в объеме 1 см3 на птицу путем нанесения на слизистые оболочки носовых ходов, конъюнктивы и ротовой полости. В течение 14 дней после инфицирования у каждой птицы ежедневно брали мазки из клоаки и глотки. На 2, 4, 6, 8, 10 и 14-е сутки прибегали к эвтаназии одной или двух птиц для определения наличия вируса в тканях органов. титры вируса в мазках из клоаки и глотки определяли следующими методами. ОТ-ПЦР в реальном времени. Для выделения РНК использовали набор «SV Total RNA Isolation system» («Promega», США), для ПЦР в реальном времени -набор «АмплиСенс Influenza virus A H5N1-FL» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) согласно инструкции производителей. Инфицирование РКЭ. Готовили 2 последовательных 10-кратных разведения исследуемого материала. Для инфицирования использовали РКЭ 9-дневного возраста с последующим подтверждением наличия вируса в аллантоисной жидкости РКЭ при помощи реакции ге-магглютинации (РГА) с использованием 1% суспензии эритроцитов петуха [17]. Статистический анализ. Значение 50% эмбриональной инфекционной дозы (ЭИД50) рассчитывали по методу Кербера в модификации Ашмарина [1]. Результаты Восприимчивость к вирусу при экспериментальном инфицировании птиц вида сизая чайка (Larus canus), которые являются естественными хозяевами штамма вируса гриппа A/common gull/Chany/P/2006 (H5N1), оценивали по способности вируса эффективно продуцироваться в организме подопытных птиц, вызывая заболевание с Результаты исследования мазков из глотки и клоаки птиц при помощи ОТ-ПЦР в реальном времени Сутки п. и. Количество птиц (голов) Результат ОТ-ПЦР в реальном времени мазки из глотки мазки из клоаки +/- % положительных проб +/- % положительных проб 1 9 9/9 100 8/9 88,9 2 9 9/9 100 8/9 88,9 3 8 8/8 100 7/8 87,5 4 8 5/8 62,5 7/8 87,5 5 6 3/6 50 5/6 83,3 6 4 2/4 50 3/4 75 8 3 2/3 66,7 2/3 66,7 10 3 1/3 33,3 1/3 33,3 12 2 2/2 100 2/2 100 14 2 2/2 100 2/2 100 Примечание. п. и. - после инфицирования; +/--количество положительных проб от общего количества. выделением вируса во внешнюю среду и накоплением в тканях внутренних органов. Было отмечено, что вирус способен вызывать болезнь у инфицированных птиц, которая проявлялась конъюнктивитами, диареей, гиперемией глотки. Неврологические симптомы, за исключением снижения аппетита и активности, не отмечены. Случаи специфической гибели птиц в течение всего периода наблюдения не зарегистрированы. Выделение вируса во внешнюю среду со слизистыми выделениями клоаки и глотки в От-ПЦР в реальном времени регистрировали в течение всего периода наблюдения, который в эксперименте составил 2 нед (см. таблицу). В течение первых 3 сут после инфицирования процент птиц, выделяющих вирус со слизью из глотки, составил 100, из клоаки - 88,9. С 4-х по 6-е сутки этот показатель для мазков из клоаки превышал таковой для мазков из глотки. Однако в целом наблюдается общая тенденция к уменьшению этих показателей до 10-х суток. Обе особи, которые остались в эксперименте после 12 сут, выделяли вирус и из глотки, и из клоаки. На протяжении эксперимента вирус был выявлен у всех подопытных птиц. Наибольшие титры вируса в мазках из глотки были зарегистрированы в 1-е сутки, а из клоаки - на 4-е сутки после инфицирования. титр вируса в мазках из глотки постепенно снижается в течение всего периода наблюдения, а в мазках из клоаки наблюдается увеличение концентрации вируса к 4-му дню с последующим уменьшением. Начиная с 8-го дня титры вируса в мазках как из глотки, так и из клоаки не превышали 1,0 lg ЭИД50/мл. При анализе количества птиц, выделяющих инфекционный вирус со слизистыми выделениями из клоаки и глотки (см. рисунок), можно отметить, что до 5-х суток после инфицирования процент положительных проб мазков из глотки выше аналогичного значения для клоакальных проб. Начиная с 6-х суток значения этих показателей равны. Полученные данные свидетельствуют о том, что наиболее активно птицы выделяют инфекционный вирус в течение первых 5 сут после инфицирования. Определение вируса в тканях внутренних органов подопытных птиц без определения его количественных показателей было проведено путем инфицирования РКЭ. Вирус гриппа был диагностирован в ткани легких на 2, 4 и 6-е сутки, селезенки - на 4-е и 6-е сутки и кишечника - на 14-е сутки после инфицирования. 5 6 Сутки после инфицирования ЦЦ Титр вируса в мазках из глотки Титр вируса в мазках из клоаки Титры вируса в мазках из глотки и клоаки. Титры вируса выражены в lg ЭИД50 в 1 мл исследуемого образца в виде M ± SD, где M - среднее значение, SD - стандартное отклонение, ЭИД50 -50% эмбриональная инфекционная доза. Над соответствующими столбцами указано отношение количества положительных проб к количеству исследованных. Обсуждение Представители отряда ржанкообразных (Charadrii-formes), в частности семейства чайковых (Laridae), играют важную роль в циркуляции вируса гриппа А. Для территории Евразии дикие птицы вида сизая чайка являются массовым, широко распространенным видом диких птиц, способным совершать длительные миграции и имеющим при этом тесный контакт со многими видами диких и домашних птиц. Восприимчивость птиц семейства чайковых к вирусу гриппа А показана в ряде работ [2, 8-11]. В данной работе представлены результаты моделирования приближенного к естественному инфекционного процесса, вызванного вирусом A/common gull/Chany/P/2006 (H5N1). Для моделирования гриппозной инфекции нами были использованы дикие птицы вида сизая чайка, которые являются природным хозяином штамма вируса гриппа A/common gull/Chany/P/2006 (H5N1). Инфицирование проведено, наиболее приближенным к естественному для диких птиц водного и околоводного комплекса путем нанесения вируса на слизистые оболочки носовых ходов, конъюнктивы и ротовой полости. Было установлено, что вирус A/common gull/Chany/ P/2006 (H5N1) при экспериментальном инфицировании вызывает у птиц вида сизая чайка (Larus canus) нелетальную инфекцию, которая проявляется воспалительными процессами негнойного характера в местах внедрения вируса, временным общим угнетением. При этом инфицированные птицы не теряют способность к полетам и, следовательно, к механическому распространению вируса. Штамм вируса гриппа A/common gull/Chany/P/2006 (H5N1) при экспериментальном заражении сизых чаек способен к эффективной репродукции в тканях верхних дыхательных путей, легких, селезенки, в клетках слизистых оболочек кишечника с последующим выделением во внешнюю среду. Инфицированные птицы выделяли инфекционный вирус из клоаки и глотки в течение 2 нед, т. е. на протяжении всего периода наблюдения. Вирус гриппа был выявлен у всех подопытных птиц, что говорит о высокой степени восприимчивости этого вида к исследуемому штамму вируса гриппа. Полученные результаты свидетельствуют о возможности активного участия птиц вида сизая чайка в распространении высокопатогенного вируса гриппа во время миграций. Случаи заболевания гриппом H5N1 регулярно регистрируются у животных, в частности у птиц семейства чайковых (Laridae), что делает актуальным дальнейшее изучение роли чаек в экологии вируса гриппа А.