The Effect of Ingavirin on the Ultrastructural Properties of Morphogenesis of Parainfluenza in vitro and in vivo

Full Text

Введение. Вирусы парагриппа человека вызывают поражения верхних дыхательных путей у пациентов всех возрастных групп, при этом наибольшая тяжесть заболевания отмечается у детей в возрасте от полугода до 3 лет [1]. Заражение вирусом парагриппа приводит к развитию ларинготрахеобронхитов, бронхиолитов и в тяжелых случаях пневмоний.Иногда вирусы парагриппа обусловливают развитие острого респираторного дистресс-синдрома, миокардита, цистического фиброза, гепатита и ряда неврологических заболеваний, таких как подострый склерозирующий панэнцефалит и рассеянный склероз [1]. Для пациентов с иммунодефицитами той или иной природы (новорожденных, реципиентов костного мозга и донорских органов, ВИЧ-инфицированных, онкологических пациентов и т. п.) вирусы парагриппа, как и любые другие патогены, представляют особую опасность. В то же время выбор препаратов для лечения этой инфекции весьма скуден. Поэтому разработка как этиотропных препаратов, так и препаратов широкого спектра противовирусной активности является актуальной задачей медицинской науки и практического здравоохранения. Сегодня основное противовирусное средство - ри-бавирин, активный в отношении 85% РНК-геномных вирусов человека. Являясь аналогом нуклеозидов, рибавирин приводит к угнетению кроветворения [2]. Помимо этого, опубликованный ВОЗ перечень побочных эффектов рибавирина включает 129 патологий [3], поэтому данный препарат назначают исключительно по жизненным показаниям. В частности, со стороны системы кроветворения отмечено уменьшение содержания гемоглобина вследствие гемолиза; возможно появление слабовыраженной анемии, лейкопении, гра-нулоцитопении, тромбоцитопении, со стороны эндокринной системы - нарушение функции щитовидной железы (изменение содержания тиреотропного гормона (ТТГ)). Наблюдаются также аллергические реакции: кожная сыпь, крапивница, ангионевротический отек, бронхоспазм, анафилаксия. Препараты интерферона и его индукторов не могут считаться основным средством терапии при пара-гриппозной инфекции, поскольку эффективны только при профилактическом применении. Как известно, вирусы парагриппа способны подавлять интерферон-индуцированный противовирусный ответ [4, 5], что делает их относительно устойчивыми к влиянию как интерферона, так и его индукторов. В ряде исследований на модели парагриппозной инфекции у животных снижение активности патологического процесса было продемонстрировано при комбинированном применении специфических антител и противовоспалительных кортикостероидов [6]. В опытах in vitro [7] и in vivo [8] была показана активность препарата Ингавирин - низкомолекулярного аналога пептидоамина, выделенного из моллюска Aplysia californica, - в отношении вируса гриппа. Также была продемонстрирована способность Ингавири-на снижать продукцию вируса парагриппа в культуре клеток [9] и репродукцию вируса и проявления отека и инфильтрации легких на модели парагриппозной пневмонии у хомяков [10]. Целью настоящего исследования была оценка противовирусных свойств препарата Ин-гавирин в отношении вируса парагриппа человека при помощи методов электронной микроскопии. Материалы и методы Вирусы и клетки. Для заражения клеток использовали вирус парагриппа человека 3-го типа (hPIV3) из музея вирусов ФГБУ НИИ гриппа, пассированный в клетках MA-104. Клетки MA-104, зараженные вирусом в дозе 102 ТЦИД50 на клетку, культивировали на среде DMEM с 2% эмбриональной сыворотки. Препараты. В работе использовали субстанцию препарата Ингавирин в виде белого кристаллического порошка. Аликвоты препарата разводили в среде для клеточных культур Игла МЕМ («БиолоТ», Санкт-Петербург, кат.# 1.3.3). Из полученного раствора были приготовлены необходимые разведения на среде МЕМ для экспериментов в культуре клеток. В опытах по изучению морфогенеза вирусной инфекции в культуре клеток применяли Ингавирин в концентрации 200 мкг/мл. В качестве препарата сравнения использовали рибавирин (Виразол, «ICN Pharmaceuticals», США) в концентрации 20 мкг/мл. В опытах по моделированию парагриппозной инфекции у животных применяли Ингавирин в дозе 30 мг/кг, рибавирин - 50 мг/кг. Животные. Для воспроизведения парагриппозной инфекции у лабораторных животных были использованы 4-недельные сирийские хомяки (Mesocricetus auratus). Новорожденных хомяков получали от половозрелых родителей и использовали в опытах через 4 нед после рождения. Животных в группы опыта подбирали методом случайной выборки. Экспериментальная парагриппозная инфекция. Вирус вводили животным интраназально под эфирным наркозом в объеме 0,05 мл и дозе 5 • 104 ТЦИД50. В каждую группу наблюдения брали по 3 хомяка. Препараты вводили перорально в объеме 0,2 мл через 12, 36 и 60 ч после инфицирования. В качестве плацебо животным контрольной группы вводили физиологический раствор (0,15М NaCl). В качестве отрицательного контроля использовали интактных животных, которые содержались в тех же условиях, что и опытные группы. Через 72 ч после заражения животных из каждой группы умерщвляли, вскрывали и изолировали легкие. Участки поражения размером 1x1 мм вырезали, измельчали лезвием в капле холодного 2,5% глутарового Рис.1. Клетка интактной культуры MA-104. Ув. 5000. альдегида на какодилатном буфере и хранили при 4°С. Рис.2. Ультраструктура клеток MA-104 через 20 ч после инфицирования вирусом парагриппа человека 3-го типа. Почкование вирионов потомства от цитоплазматической мембраны (а); начальная стадия формирования цитоплазматических вакуолей (указаны стрелками) (б); пересортировка хроматина в ядре (в). Ув. 5000. Электронно-микроскопические исследования. Клетки МА-104 инкубировали с вируссодержащим материалом в течение 1 ч при 37°С. Несвязавшийся вирус отмывали 2 раза стерильной средой DMEM и вносили в лунки препараты в необходимых концентрациях. Через 20 или 48 ч после заражения контрольные и опытные культуры клеток фиксировали 2,5% раствором глута-ральдегида на среде DMEM (рН 7,2), центрифугировали 20 мин при 2000 об/мин и фиксировали 2,5% раствором OsO4. Клетки обезвоживали ацетоном в возрастающей концентрации и заливали в смесь эпон-аралдит. Ультратонкие срезы, полученные на ультрамикротоме Ultracut («Reichert», Австрия), контрастировали ура-нилацетатом и цитратом свинца и просматривали на электронном микроскопе JEM-100S («JEOL», Япония) при инструментальном увеличении 5000-50000. Фотосъемку производили на пленку Фт-41МД. Кусочки ткани легких фиксировали 2,5% раствором OsO4, обезвоживали ацетоном в возрастающей концентрации и заливали в смесь эпон-аралдит. Ультра-тонкие срезы, полученные на ультрамикротоме Ultracut («Reichert», Австрия), контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца и просматривали на электронном микроскопе JEM-100S («JEOL», Япония) при инструментальном увеличении 5000-8000. Фотосъемку производили на пленку ФТ-41МД. На полученных фотографиях оценивали степень деструкции альвеолоцитов, наличие или отсутствие клеток воспалительного инфильтрата, а также почкующихся вирионов. Рис.3. Ультраструктура клеток MA-104 через 48 ч после инфицирования вирусом парагриппа человека 3-го типа. Расширенные полости комплекса Гольджи и формирование многочисленных цитопатических вакуолей в цитоплазме клеток. Ув. 5000. Результаты Морфогенез парагриппозной инфекции in vitro. Как было показано в ходе ультраструктур-ных исследований, клетки интактной культуры MA-104 имели округлую или овальную форму и содержали крупное центрально расположенное ядро. В цитоплазме находились многочисленные округлые или овальные митохондрии, вакуоли гранулярной и агранулярной эндо-плазматической сети. В вакуолях определялись рыхлые округлые тела умеренной электронной плотности. Аппарат Гольджи был представлен скоплениями уплощенных цистерн, вакуолями и микропузырьками. Ядерный хроматин в нуклеоплазме в виде конденсатов располагался по всему объему ядра или был частично смещен к периферии. В центре каждого ядра обнаруживались крупные ядрышки (рис. 1). Клетки контрольной культуры, инфицированные hPIV3, через 20 ч после инфицирования несли первичные признаки цитопатогенного действия вируса. Клеточные органеллы в цитоплазме выглядели интактны-ми. В самой цитоплазме начинались процессы вакуолизации, типичные для цитодеструктивного действия вируса парагриппа и других родственных вирусов семейства Paramyxoviridae (рис. 2, а). На поверхности клеточной мембраны отмечалось почкование многочисленных плейоморфных вирионов, имеющих характерную структуру (рис. 2, б). В ядрах инфицированных клеток наблюдалась патологическая пересортировка хроматина от периферии к центру (рис. 2, в). Через 48 ч после инфицирования процессы вакуолизации клеток еще более усиливались. В цитоплазме клеток происходило формирование большого количества характерных цитопатических вакуолей размером 0,5-1 мкм с гетерогенным содержимым. Как и в предыдущий срок исследования, на плазматической мембране продолжалось формирование вирионов парагриппа (рис. 3). Применение Ингавирина существенно ограничивало морфологические проявления как вирусной репликации, так и вирусиндуцированной цитопатологии. Так, в оба срока исследования (через 20 и 48 ч после инфицирования) количество почкующихся от клеточной поверхности вирионов было существенно меньше, чем в контрольных культурах. Такие признаки цитопатогенного действия вируса, как формирование цитопатических вакуолей, деградация клеточных орга-нелл, патологическое перераспределение хроматина в ядре, были также выражены в существенно меньшей степени по сравнению с контрольными клетками, культивировавшимися без химиопрепаратов (рис.4, а, б). Сходное влияние на морфогенез парагриппозной инфекции оказал препарат сравнения рибавирин. Как и Ингавирин, он приводил к снижению вирусной продукции и уменьшению проявлений цитопатогенности, в частности ваукуолизации цитоплазмы. Ингибирующее действие рибавирина на цитодеструктивные процессы в цитоплазме проявлялось в равной или меньшей степени по сравнению с активностью Ингавирина (рис.5). Экспериментальная парагриппозная инфекция у животных. В ходе опыта по определению протективной активности Ингавирина на животных неспецифическая смертность не зафиксирована ни в одной из групп животных. Как было показано в ходе ультраструктурных исследований, легкие интактных животных имели типичную тканевую организацию, характерную для нормальных легких. Аэрогематический барьер выглядел интактным, в сосудах отмечались электронноплотные эритроциты, в альвеолах клеточные элементы отсутствовали. Эпителиальные клетки не содержали признаков цитопатогенности (рис.6). Заражение вирусом парагриппа приводило к резким изменениям морфологической картины легких. Так, через 72 ч после инфицирования животных, как и в опытах в культуре клеток, в ядрах клеток наблюдались пересортировка хроматина и развитие многочисленных оформленных(фибриллярных) и диффузных ядерных включений различной плотности. В их составе были хорошо различимы типичные спиральные структуры, представляющие собой новосинтезированные рибону-клеопротеиды, еще не покрытые оболочкой. От поверхности клеток почковались многочисленные вирионы потомства. Кроме того, отмечались выраженная вакуолизация инфицированных клеток и скопление серозной жидкости и клеточного детрита в просветах альвеол. Наблюдали реактивные процессы в виде многочисленных клеточных элементов в просветах альвеол (рис.7). Рис. 4. Ультраструктура клеток MA-104 через 20 ч после инфицирования вирусом парагриппа 3-го типа в условиях применения Ингавирина. Почкование немногочисленных вирионов от клеточной поверхности (а); интактная структура цитоплазмы клеток (б). Ув. 5000. Применение Ингавирина и препарата сравнения рибавирина оказывало сходное влияние на уль-траструктурные особенности вирусной инфекции. Прежде всего оба препарата значительно нормализовали морфологическую картину легких по сравнению с наблюдаемой у контрольных животных. так, клетки альвеолярного эпителия выглядели интактными, вирусспецифическая пересортировка хроматина не отмечалась, почкование вирионов было ограниченным (рис.8). Обсуждение Проведено исследование активности Ингавирина на модели парагриппозной инфекции в культуре Рис. 5. Ультраструктура клеток MA-104 через 48 ч после инфицирования вирусом парагриппа 3-го типа в условиях примене- Рис.6. Респираторные °тделы дагаж ттактшго сирийског° ния рибавирина. Немногочисленные вирионы, почкующиеся от хомяка. ^такшьш аэрогемагаческий барьер слабая вакуоли-плазматической мембраны, умеренное количество цитопатоген- зация эршроциты в просветах сосудов. Альвеолярные ных вакуолей в цитоплазме. Ув. 5000. полости воздушны. Ув. 2500. Рис 7. Морфогенез парагриппозной инфекции в легких сирийских хомяков через 72 ч после инфицирования вирусом парагриппа 3-го типа. Почкование вирионов потомства и выраженная вакуолизация цитоплазмы альвеолоцита (а); скопление серозной жидкости и воспалительного инфильтрата в альвеолярной полости легкого (б). Ув. 4000 (а), 6000 (б). Рис. 8. Морфогенез экспериментальной парагриппозной инфекции в легких сирийских хомяков на 3-и сутки после инфицирования вирусом парагриппа 3-го типа в условиях применения Ингавирина. Ограниченное почкование вирионов от поверхности альвеолоцита (а); структура альвеол. Альвеолоциты интактны или слабо вакуолизированы, в просвете альвеолы отсутствуют серозная жидкость и компоненты воспалительного инфильтрата (б). Ув. 10 000 (а), 5 000 (б). клеток и в легких хомяков с помощью электронномикроскопического анализа. Сопоставление морфогенеза процессов в клетках, протекающих при инфицировании вирусом парагриппа, с литературными данными показало, что уль-траструктурная картина парагриппозной инфекции, наблюдаемая в наших экспериментах, в целом согласовывалась с результатами аналогичных исследований, проведенных на вирусе парагриппа [11] и других парамиксовирусах - вирусе краснухи [12], кори [13] и бычьего парагриппа [14]. Показано, что применение Ингавирина снижает количество почкующихся ви-рионов потомства, а также существенно нормализует ультраструктуру цитоплазмы, снижая проявления цитодеструктивного действия вируса. В этом отношении эффект Ингавирина оказывался идентичным действию препарата сравнения рибавирина или превосходил его. В опытах in vivo на модели экспериментальной па-рагриппозной пневмонии у сирийских хомяков продемонстрировано, что Ингавирин, как и препарат сравнения рибавирин, значительно нормализует морфологическую картину легких по сравнению с наблюдаемой у контрольных животных. Эта нормализация проявляется снижением степени деструкции альвеолоцитов, а также ограничением почкования вирионов потомства и отсутствием в альвеолярных полостях клеточных и серозных компонентов воспалительного инфильтрата, что свидетельствует также о противовоспалительных свойствах препарата. Если учесть гораздо более низкую токсичность Ингавирина по сравнению с риба-вирином и приблизительно одинаковое их влияние на интенсивность формирования вирионов потомства, есть основания говорить о преимуществах Ингавири-на перед использованным препаратом сравнения. Результаты, полученные в нашем исследовании, затрагивают лишь морфологическую сторону пара-гриппозной инфекции в клетках и у лабораторных животных. В то же время они хорошо согласуются с ранее полученными данными о способности Инга-вирина снижать инфекционные титры этого вируса в культуре клеток и ткани легких лабораторных животных. В связи с этим следует отметить, что сочетание в одном препарате противовирусных, цитопро-текторных и противовоспалительных свойств делает его важной составляющей комплексной терапии па-рагриппозной инфекции человека.

References

Supplementary files