Влияние Ингавирина на ультраструктурные особенности морфогенеза парагриппозной инфекции in vitro и in vivo


Цитировать

Полный текст

Аннотация

Вирусы парагриппа человека вызывают поражения верхних дыхательных путей у пациентов всех возрастных групп. Основным проивовирусным средством является рибавирин, дающий серьезные побочные эффекты и назначаемый по жизненным показаниям. В настоящей работе при помощи электронной микроскопии показана активность препарата Ингавирин против вируса парагриппа человека в культуре клеток и на модели парагриппозной пневмонии у сирийских хомяков. Показано, что применение Ингавирина снижает количество вирионов потомства и проявления цитодеструктивного действия вируса. Эффект Ингавирина был идентичен действию рибавирина или превосходил его. В опытах in vivo продемонстрировано, что Ингавирин нормализует морфологическую картину легких, снижая степень деструкции альвеолоцитов, ограничивая почкование варионов потомства и уменьшая количество воспалительного инфильтрата. Таким образом, сочетание противовирусных, цитопротекторных и противовоспалительных свойств Ингавирина делает его важной составляющей комплексной терапии парагриппозной инфекции человека.

Полный текст

Введение. Вирусы парагриппа человека вызывают поражения верхних дыхательных путей у пациентов всех возрастных групп, при этом наибольшая тяжесть заболевания отмечается у детей в возрасте от полугода до 3 лет [1]. Заражение вирусом парагриппа приводит к развитию ларинготрахеобронхитов, бронхиолитов и в тяжелых случаях пневмоний.Иногда вирусы парагриппа обусловливают развитие острого респираторного дистресс-синдрома, миокардита, цистического фиброза, гепатита и ряда неврологических заболеваний, таких как подострый склерозирующий панэнцефалит и рассеянный склероз [1]. Для пациентов с иммунодефицитами той или иной природы (новорожденных, реципиентов костного мозга и донорских органов, ВИЧ-инфицированных, онкологических пациентов и т. п.) вирусы парагриппа, как и любые другие патогены, представляют особую опасность. В то же время выбор препаратов для лечения этой инфекции весьма скуден. Поэтому разработка как этиотропных препаратов, так и препаратов широкого спектра противовирусной активности является актуальной задачей медицинской науки и практического здравоохранения. Сегодня основное противовирусное средство - ри-бавирин, активный в отношении 85% РНК-геномных вирусов человека. Являясь аналогом нуклеозидов, рибавирин приводит к угнетению кроветворения [2]. Помимо этого, опубликованный ВОЗ перечень побочных эффектов рибавирина включает 129 патологий [3], поэтому данный препарат назначают исключительно по жизненным показаниям. В частности, со стороны системы кроветворения отмечено уменьшение содержания гемоглобина вследствие гемолиза; возможно появление слабовыраженной анемии, лейкопении, гра-нулоцитопении, тромбоцитопении, со стороны эндокринной системы - нарушение функции щитовидной железы (изменение содержания тиреотропного гормона (ТТГ)). Наблюдаются также аллергические реакции: кожная сыпь, крапивница, ангионевротический отек, бронхоспазм, анафилаксия. Препараты интерферона и его индукторов не могут считаться основным средством терапии при пара-гриппозной инфекции, поскольку эффективны только при профилактическом применении. Как известно, вирусы парагриппа способны подавлять интерферон-индуцированный противовирусный ответ [4, 5], что делает их относительно устойчивыми к влиянию как интерферона, так и его индукторов. В ряде исследований на модели парагриппозной инфекции у животных снижение активности патологического процесса было продемонстрировано при комбинированном применении специфических антител и противовоспалительных кортикостероидов [6]. В опытах in vitro [7] и in vivo [8] была показана активность препарата Ингавирин - низкомолекулярного аналога пептидоамина, выделенного из моллюска Aplysia californica, - в отношении вируса гриппа. Также была продемонстрирована способность Ингавири-на снижать продукцию вируса парагриппа в культуре клеток [9] и репродукцию вируса и проявления отека и инфильтрации легких на модели парагриппозной пневмонии у хомяков [10]. Целью настоящего исследования была оценка противовирусных свойств препарата Ин-гавирин в отношении вируса парагриппа человека при помощи методов электронной микроскопии. Материалы и методы Вирусы и клетки. Для заражения клеток использовали вирус парагриппа человека 3-го типа (hPIV3) из музея вирусов ФГБУ НИИ гриппа, пассированный в клетках MA-104. Клетки MA-104, зараженные вирусом в дозе 102 ТЦИД50 на клетку, культивировали на среде DMEM с 2% эмбриональной сыворотки. Препараты. В работе использовали субстанцию препарата Ингавирин в виде белого кристаллического порошка. Аликвоты препарата разводили в среде для клеточных культур Игла МЕМ («БиолоТ», Санкт-Петербург, кат.# 1.3.3). Из полученного раствора были приготовлены необходимые разведения на среде МЕМ для экспериментов в культуре клеток. В опытах по изучению морфогенеза вирусной инфекции в культуре клеток применяли Ингавирин в концентрации 200 мкг/мл. В качестве препарата сравнения использовали рибавирин (Виразол, «ICN Pharmaceuticals», США) в концентрации 20 мкг/мл. В опытах по моделированию парагриппозной инфекции у животных применяли Ингавирин в дозе 30 мг/кг, рибавирин - 50 мг/кг. Животные. Для воспроизведения парагриппозной инфекции у лабораторных животных были использованы 4-недельные сирийские хомяки (Mesocricetus auratus). Новорожденных хомяков получали от половозрелых родителей и использовали в опытах через 4 нед после рождения. Животных в группы опыта подбирали методом случайной выборки. Экспериментальная парагриппозная инфекция. Вирус вводили животным интраназально под эфирным наркозом в объеме 0,05 мл и дозе 5 • 104 ТЦИД50. В каждую группу наблюдения брали по 3 хомяка. Препараты вводили перорально в объеме 0,2 мл через 12, 36 и 60 ч после инфицирования. В качестве плацебо животным контрольной группы вводили физиологический раствор (0,15М NaCl). В качестве отрицательного контроля использовали интактных животных, которые содержались в тех же условиях, что и опытные группы. Через 72 ч после заражения животных из каждой группы умерщвляли, вскрывали и изолировали легкие. Участки поражения размером 1x1 мм вырезали, измельчали лезвием в капле холодного 2,5% глутарового Рис.1. Клетка интактной культуры MA-104. Ув. 5000. альдегида на какодилатном буфере и хранили при 4°С. Рис.2. Ультраструктура клеток MA-104 через 20 ч после инфицирования вирусом парагриппа человека 3-го типа. Почкование вирионов потомства от цитоплазматической мембраны (а); начальная стадия формирования цитоплазматических вакуолей (указаны стрелками) (б); пересортировка хроматина в ядре (в). Ув. 5000. Электронно-микроскопические исследования. Клетки МА-104 инкубировали с вируссодержащим материалом в течение 1 ч при 37°С. Несвязавшийся вирус отмывали 2 раза стерильной средой DMEM и вносили в лунки препараты в необходимых концентрациях. Через 20 или 48 ч после заражения контрольные и опытные культуры клеток фиксировали 2,5% раствором глута-ральдегида на среде DMEM (рН 7,2), центрифугировали 20 мин при 2000 об/мин и фиксировали 2,5% раствором OsO4. Клетки обезвоживали ацетоном в возрастающей концентрации и заливали в смесь эпон-аралдит. Ультратонкие срезы, полученные на ультрамикротоме Ultracut («Reichert», Австрия), контрастировали ура-нилацетатом и цитратом свинца и просматривали на электронном микроскопе JEM-100S («JEOL», Япония) при инструментальном увеличении 5000-50000. Фотосъемку производили на пленку Фт-41МД. Кусочки ткани легких фиксировали 2,5% раствором OsO4, обезвоживали ацетоном в возрастающей концентрации и заливали в смесь эпон-аралдит. Ультра-тонкие срезы, полученные на ультрамикротоме Ultracut («Reichert», Австрия), контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца и просматривали на электронном микроскопе JEM-100S («JEOL», Япония) при инструментальном увеличении 5000-8000. Фотосъемку производили на пленку ФТ-41МД. На полученных фотографиях оценивали степень деструкции альвеолоцитов, наличие или отсутствие клеток воспалительного инфильтрата, а также почкующихся вирионов. Рис.3. Ультраструктура клеток MA-104 через 48 ч после инфицирования вирусом парагриппа человека 3-го типа. Расширенные полости комплекса Гольджи и формирование многочисленных цитопатических вакуолей в цитоплазме клеток. Ув. 5000. Результаты Морфогенез парагриппозной инфекции in vitro. Как было показано в ходе ультраструктур-ных исследований, клетки интактной культуры MA-104 имели округлую или овальную форму и содержали крупное центрально расположенное ядро. В цитоплазме находились многочисленные округлые или овальные митохондрии, вакуоли гранулярной и агранулярной эндо-плазматической сети. В вакуолях определялись рыхлые округлые тела умеренной электронной плотности. Аппарат Гольджи был представлен скоплениями уплощенных цистерн, вакуолями и микропузырьками. Ядерный хроматин в нуклеоплазме в виде конденсатов располагался по всему объему ядра или был частично смещен к периферии. В центре каждого ядра обнаруживались крупные ядрышки (рис. 1). Клетки контрольной культуры, инфицированные hPIV3, через 20 ч после инфицирования несли первичные признаки цитопатогенного действия вируса. Клеточные органеллы в цитоплазме выглядели интактны-ми. В самой цитоплазме начинались процессы вакуолизации, типичные для цитодеструктивного действия вируса парагриппа и других родственных вирусов семейства Paramyxoviridae (рис. 2, а). На поверхности клеточной мембраны отмечалось почкование многочисленных плейоморфных вирионов, имеющих характерную структуру (рис. 2, б). В ядрах инфицированных клеток наблюдалась патологическая пересортировка хроматина от периферии к центру (рис. 2, в). Через 48 ч после инфицирования процессы вакуолизации клеток еще более усиливались. В цитоплазме клеток происходило формирование большого количества характерных цитопатических вакуолей размером 0,5-1 мкм с гетерогенным содержимым. Как и в предыдущий срок исследования, на плазматической мембране продолжалось формирование вирионов парагриппа (рис. 3). Применение Ингавирина существенно ограничивало морфологические проявления как вирусной репликации, так и вирусиндуцированной цитопатологии. Так, в оба срока исследования (через 20 и 48 ч после инфицирования) количество почкующихся от клеточной поверхности вирионов было существенно меньше, чем в контрольных культурах. Такие признаки цитопатогенного действия вируса, как формирование цитопатических вакуолей, деградация клеточных орга-нелл, патологическое перераспределение хроматина в ядре, были также выражены в существенно меньшей степени по сравнению с контрольными клетками, культивировавшимися без химиопрепаратов (рис.4, а, б). Сходное влияние на морфогенез парагриппозной инфекции оказал препарат сравнения рибавирин. Как и Ингавирин, он приводил к снижению вирусной продукции и уменьшению проявлений цитопатогенности, в частности ваукуолизации цитоплазмы. Ингибирующее действие рибавирина на цитодеструктивные процессы в цитоплазме проявлялось в равной или меньшей степени по сравнению с активностью Ингавирина (рис.5). Экспериментальная парагриппозная инфекция у животных. В ходе опыта по определению протективной активности Ингавирина на животных неспецифическая смертность не зафиксирована ни в одной из групп животных. Как было показано в ходе ультраструктурных исследований, легкие интактных животных имели типичную тканевую организацию, характерную для нормальных легких. Аэрогематический барьер выглядел интактным, в сосудах отмечались электронноплотные эритроциты, в альвеолах клеточные элементы отсутствовали. Эпителиальные клетки не содержали признаков цитопатогенности (рис.6). Заражение вирусом парагриппа приводило к резким изменениям морфологической картины легких. Так, через 72 ч после инфицирования животных, как и в опытах в культуре клеток, в ядрах клеток наблюдались пересортировка хроматина и развитие многочисленных оформленных(фибриллярных) и диффузных ядерных включений различной плотности. В их составе были хорошо различимы типичные спиральные структуры, представляющие собой новосинтезированные рибону-клеопротеиды, еще не покрытые оболочкой. От поверхности клеток почковались многочисленные вирионы потомства. Кроме того, отмечались выраженная вакуолизация инфицированных клеток и скопление серозной жидкости и клеточного детрита в просветах альвеол. Наблюдали реактивные процессы в виде многочисленных клеточных элементов в просветах альвеол (рис.7). Рис. 4. Ультраструктура клеток MA-104 через 20 ч после инфицирования вирусом парагриппа 3-го типа в условиях применения Ингавирина. Почкование немногочисленных вирионов от клеточной поверхности (а); интактная структура цитоплазмы клеток (б). Ув. 5000. Применение Ингавирина и препарата сравнения рибавирина оказывало сходное влияние на уль-траструктурные особенности вирусной инфекции. Прежде всего оба препарата значительно нормализовали морфологическую картину легких по сравнению с наблюдаемой у контрольных животных. так, клетки альвеолярного эпителия выглядели интактными, вирусспецифическая пересортировка хроматина не отмечалась, почкование вирионов было ограниченным (рис.8). Обсуждение Проведено исследование активности Ингавирина на модели парагриппозной инфекции в культуре Рис. 5. Ультраструктура клеток MA-104 через 48 ч после инфицирования вирусом парагриппа 3-го типа в условиях примене- Рис.6. Респираторные °тделы дагаж ттактшго сирийског° ния рибавирина. Немногочисленные вирионы, почкующиеся от хомяка. ^такшьш аэрогемагаческий барьер слабая вакуоли-плазматической мембраны, умеренное количество цитопатоген- зация эршроциты в просветах сосудов. Альвеолярные ных вакуолей в цитоплазме. Ув. 5000. полости воздушны. Ув. 2500. Рис 7. Морфогенез парагриппозной инфекции в легких сирийских хомяков через 72 ч после инфицирования вирусом парагриппа 3-го типа. Почкование вирионов потомства и выраженная вакуолизация цитоплазмы альвеолоцита (а); скопление серозной жидкости и воспалительного инфильтрата в альвеолярной полости легкого (б). Ув. 4000 (а), 6000 (б). Рис. 8. Морфогенез экспериментальной парагриппозной инфекции в легких сирийских хомяков на 3-и сутки после инфицирования вирусом парагриппа 3-го типа в условиях применения Ингавирина. Ограниченное почкование вирионов от поверхности альвеолоцита (а); структура альвеол. Альвеолоциты интактны или слабо вакуолизированы, в просвете альвеолы отсутствуют серозная жидкость и компоненты воспалительного инфильтрата (б). Ув. 10 000 (а), 5 000 (б). клеток и в легких хомяков с помощью электронномикроскопического анализа. Сопоставление морфогенеза процессов в клетках, протекающих при инфицировании вирусом парагриппа, с литературными данными показало, что уль-траструктурная картина парагриппозной инфекции, наблюдаемая в наших экспериментах, в целом согласовывалась с результатами аналогичных исследований, проведенных на вирусе парагриппа [11] и других парамиксовирусах - вирусе краснухи [12], кори [13] и бычьего парагриппа [14]. Показано, что применение Ингавирина снижает количество почкующихся ви-рионов потомства, а также существенно нормализует ультраструктуру цитоплазмы, снижая проявления цитодеструктивного действия вируса. В этом отношении эффект Ингавирина оказывался идентичным действию препарата сравнения рибавирина или превосходил его. В опытах in vivo на модели экспериментальной па-рагриппозной пневмонии у сирийских хомяков продемонстрировано, что Ингавирин, как и препарат сравнения рибавирин, значительно нормализует морфологическую картину легких по сравнению с наблюдаемой у контрольных животных. Эта нормализация проявляется снижением степени деструкции альвеолоцитов, а также ограничением почкования вирионов потомства и отсутствием в альвеолярных полостях клеточных и серозных компонентов воспалительного инфильтрата, что свидетельствует также о противовоспалительных свойствах препарата. Если учесть гораздо более низкую токсичность Ингавирина по сравнению с риба-вирином и приблизительно одинаковое их влияние на интенсивность формирования вирионов потомства, есть основания говорить о преимуществах Ингавири-на перед использованным препаратом сравнения. Результаты, полученные в нашем исследовании, затрагивают лишь морфологическую сторону пара-гриппозной инфекции в клетках и у лабораторных животных. В то же время они хорошо согласуются с ранее полученными данными о способности Инга-вирина снижать инфекционные титры этого вируса в культуре клеток и ткани легких лабораторных животных. В связи с этим следует отметить, что сочетание в одном препарате противовирусных, цитопро-текторных и противовоспалительных свойств делает его важной составляющей комплексной терапии па-рагриппозной инфекции человека.
×

Список литературы

  1. Henrickson K. J. Parainfluenza viruses. Clin. Microbiol. Rev. 2003; 16: 242-264.
  2. De Franceschi L., Fattovich G., Turrini F. et al. Hemolytic anemia induced by ribavirin therapy in patients with chronic hepatitis C virus infection: role of membrane oxidative damage. Hepatology 2000; 31: 997-1004.
  3. http://www.fda-reports.com/ribavirin-ribavirin.html
  4. Boonyaratanakornkit J., Bartlett E., Schomacker H. et al. The C proteins of human parainfluenza virus type 1 limit double-stranded RNA accumulation that would otherwise trigger activation of MDA5 and protein kinase R. J. Virol. 2011; 85 (4): 1495-1506.
  5. Saladino R., Ciambecchini U., Nencioni L., Palamara A. T. Recent advances in the chemistry of parainfluenza-1 (Sendai) virus inhibitors. Med. Res. Rev. 2003; 23: 427-455.
  6. Prince G. A., Porter D. D. Treatment of parainfluenza virus type 3 bronchiolitis and pneumonia in a cotton rat model using topical antibody and glucocorticosteroid. J. Infect. Dis. 1996; 173: 598-608.
  7. Логинова С. Я., Борисевич С. В., Лыков М. В. и др. Изучение эффективности Ингавирина® invitro в отношении «мексиканского» пандемического подтипа H1N1 вируса гриппа А, штаммы A/California/04/2009 и A/California/07/2009. Антибиотики и химиотер. 2009; 3-4: 15-17.
  8. Логинова С. Я., Борисевич С. В., Максимов В. А. и др. Изучение терапевтической эффективности нового отечественного препарата Ингавирин в отношении возбудителя гриппа А (H3N2). Антибиотики и химиотер. 2008; 53 (11-12): 27-30.
  9. Зарубаев В. В., Кривицкая В. З., Небольсин В. Е., Киселев О. И. Экспериментальное исследование противовирусной активности-Ингавири напротив вируса парагриппа человека. Антибиотики и химиотер. 2010; 55 (7-8): 13-16.
  10. Зарубаев В. В., Гаршинина А. В., Калинина Н. А. и др. Лечение экспериментальной парагриппозной пневмонии у сирийских хомяков при помощи Ингавирина®. Вопр. вирусол. 2012.
  11. Hoglund S., Morein B. A. Morphological study of outfolded and released parainfluenza type 3 virus. J. Gen. Virol. I973; 21: 359-369.
  12. Risco C., Carrascosa J. L., Frey T. K. Structural maturation of rubella virus in the Golgi complex. Virology 2003; 312: 261-269.
  13. Nakai M., Imagawa D. T. Electron microscopy of measles virus replication. J. Virol. 1969; 3: 187-197.
  14. McLean A. M., Doane F. W. The morphogenesis and cytopathology of bovine parainfluenza type 3 virus. J. Gen. Virol. 1971, 2: 271-279.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML

© Зарубаев В.В., Гаршинина А.В., Калинина Н.А., Беляевская С.В., Сироткин А.К., Небольсин В.Е., Киселев О.И., Рейхарт Д.В., 2012

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.

СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС77-77676 от 29.01.2020.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах