Use of the cultural variants of Coxsackie A viruses in virological practice

Full Text

Вирусы Коксаки, выделенные впервые Д. Дэлдорфом в 1948 г., разделены на 2 группы - А и В. В группу А входят вирусы 23 серотипов, в группу В - 6 серотипов. Вирусы были разделены на 2 группы по характеру изменений, возникающих у зараженных ими сосунков белых мышей. Большинство серотипов вирусов Коксаки А не вызывает цитопатогенные изменения в культуре клеток, поэтому их выделение и работа с ними возможны только на новорожденных белых мышах. Вирусы Коксаки А могут быть причиной как тяжелых, так и легких форм заболеваний человека. В настоящее время с этими вирусами связывают такие заболевания, как серозный менингит (типы 2-4, 6, 7, 9 и 10), герпангину (типы 2-6, 8 и 10), острый фарингит (типы 10 и 21), полиомиелитоподобные заболевания (типы 1, 2, 5, 7-9 и 21), экзантему (типы 4-6, 9 и 16), экзантему полости рта и конечностей (типы 5 и 16), пневмонию новорожденных (типы 9 и 16), контагиозный насморк (типы 21 и 24), гепатит (типы 4, 9 и 20), диарею новорожденных и детей младшего возраста (типы 18, 20-22 и 24), острый геморрагический конъюнктивит (тип 24) [4]. Вероятно, тем, что работа с этой группой вирусов в большинстве случаев требует использования дорогостоящих лабораторных животных, можно объяснить, почему в отечественной литературе за последние 10 лет мы нашли лишь одну работу, посвященную изучению заболеваний, вызванных указанными вирусами [2]. Использование вирусов, адаптированных к культуре клеток, дает возможность значительно расширить диагностические и эпидемиологические исследования. На основании иммуноструктуры населения можно судить о циркуляции отдельных серотипов вирусов в коллективе и популяции. Результаты серологических исследований существенно облегчают расшифровку эпидемических вспышек. Материалы и методы. Результаты исследования Адаптация штаммов вирусов Коксаки A к культуре клеток RD и Vero В лаборатории имелись прототипные штаммы вирусов Коксаки A в виде суспензии головного мозга и тушек зараженных новорожденных белых мышей. Штаммы нескольких серотипов были адаптированы к первичной культуре почек обезьян и культуре клеток амниона человека. В лаборатории была проведена работа по первичной адаптации штаммов вирусов Коксаки А к одной культуре - культуре клеток RD. На первом этапе удалось адаптировать штаммы 14 типов вирусов - серотипов 2, 3, 7, 9-11, 13-16, 18, 20, 21 и 24. Штаммы одних серотипов легко адаптировались к этой культуре клеток и уже после нескольких пассажей вызывали в ней цитопати-ческие изменения. Для адаптации штаммов других серотипов потребовалось более длительное культивирование. После большого числа пассажей дополнительно к вирусам 14 се-ротипов удалось адаптировать штаммы еще 3 типов вирусов Коксаки А - типов 4, 12 и 17. Эти штаммы стали вызывать выраженный цитопатический эффект, а титр вируса достигал 5-6 lg ТЦД/0,1 мл. Таким образом, были получены штаммы 17 из 23 серо-типов вируса Коксаки А, адаптированные к одной культуре клеток RD. В меньшей степени удалось адаптировать к культуре клеток штамм вируса Коксаки А-5. Он вызывал на 4-5-е сутки культивирования частичные цитопатические изменения. Титр вируса не превышал 1,5-2,0 lg ТЦД50/0,1 мл. После адаптации штаммов к культуре клеток RD была сделана попытка переадаптировать их к культуре клеток Vero. После небольшого числа пассажей штаммы вирусов Коксаки типов 7, 9, 10, 14, 16, 18, 20 и 21 стали размножаться в новой культуре клеток, вызывая в ней цитопатогенный эффект (табл. 1). Штаммы вирусов Коксаки А типов 2-4, 12, 15 и 17 раз- Штаммы вирусов коксаки А, адаптированные к культуре клеток RD и Vero Вирусы Коксаки А, тип Штамм Адаптация к культуре клеток RD | Vero 2 Flutwood + 3 Olson + 4 High Point + 5 Swarz ± 7 AB-IV KX + + 9 Bozek + + 10 Kowalik + + 11 Belgium-1 + 12 Texas 12 + 13 Flores + 14 G-14 + + 15 G-9 + 16 G-10 + + 17 G-12 + 18 G-13 + + 20 IH-35 + + 21 Anderson + + 24 Joseph + Таблица 2 Титр вирусов коксаки А, размноженных в культуре клеток RD и Vero Вирусы Коксаки A, тип Титр вируса в lg ТЦД,0/0,1 мл* культура клеток RD | культура клеток Vero 2 7,33 - 3 6,9 - 7 6,6 6,8 9 7,5 5,3 10 6,7 5,6 11 5,1 13 6,1 14 4,8 5,4 15 6,1 16 6,6 6,4 18 7,2 5,6 20 6,5 5,6 21 5,1 7,3 24 6,2 Примечание. * - средний результат 4-5 титрований. множались в культуре клеток Vero, не вызывая в ней ци-топатические изменения даже после 10-15 пассажей. О размножении вирусов в культуре клеток Vero можно было судить по переносу зараженной культуральной жидкости в чувствительную культуру клеток RD, где цитопатическое действие вируса наблюдали уже на 1-2-е сутки первого-второго пассажей. Вирусы Коксаки А типов 5, 11 и 13 не размножались в культуре клеток Vero, так как после 3-4 пассажей из культуральной жидкости при заражении ею чувствительной культуры клеток RD не удавалось выделить вирус. О степени адаптации штаммов отдельных серотипов вирусов Коксаки А в культурах клеток RD и Vero можно судить по титру размноженного в них вируса. Титр вирусов, размноженных в культуре клеток RD, колебался в пределах 4,8-7,3 lg ТЦД50/0,1 мл. Титр вирусов, размноженных в культуре клеток Vero, достигал 5,4-7,3 lg ТЦД50/0,1 мл (табл. 2). Результаты титрования антител в сыворотках иммунизированных кроликов Сыворотка Вирусы Коксаки А, тип 2 3 7 11 13 15 16 18 20 Титр антител 256* 2048 2048 256 64 512 2048 512 128 Примечание. * - обратная величина титра. Таблица 4 количество типов антител к вирусам коксаки A в сыворотках детей из закрытых детских учреждений Москвы Учреждение Число сывороток Число типов антител в сыворотке без антител | 1 2 3 4 5 6 7 Дом ребенка 262 49/18,7 59/22,5 80/30,5 39/14,9 18/6,9 10/3,8 5/1,9 2/0,8 Детский дом 281 28/10,0 54/19,2 77/27,4 56/20,0 38/13,5 15/5,3 8/2,8 5/1,8 Всего 543 77/14,2 113/20,8 157/28,9 95/17,5 56/10,3 25/4,6 13/2,4 7/1,3 Примечание. Числитель - абсолютное число; знаменатель - процент. Таблица 5 Результаты исследования сывороток детей из закрытых детских коллективов на антитела к вирусам коксаки А в Москве и Московской области Учреждение, Число Возраст, Дети с антителами к вирусам Коксаки A, %, тип: район детей годы 2 3 7 9 10 11 13 14 15 16 18 20 21 24 Дом ребенка, Москва 262 1-4 36,2 0,0 3,8 18,3 43,5 2,7 2,3 9,5 0,8 37,0 21,4 2,3 2,7 1,9 Детский дом, Москва 281 5-15 54,1 1,4 12,4 26,0 39,8 0,0 2,8 28,8 0,0 37,7 19,2 8,2 13,9 0,0 Всего 543 1-15 45,5 0,7 8,3 22,3 41,6 1,3 2,6 19,5 0,4 37,4 20,2 5,3 8,5 0,9 Московская область 162 3-14 6,2 0,6 11,7 28,4 11,7 6,2 3,7 22,2 5,6 30,2 10,5 9,3 6,2 21,0 Использование культуральных вариантов штаммов вирусов Коксаки А для иммунизации животных При постановке реакции нейтрализации в качестве контроля необходимо иметь стандартные типоспецифические сыворотки. Для их получения были проиммунизированы кролики культуральными вариантами вирусов Коксаки А типов 2, 3, 7, 11, 13, 15, 16, 18 и 20. Иммунизацию животных проводили по общепринятой схеме. В результате были получены сыворотки с титрами антител 1:64-1:2048 (табл. 3). В настоящее время международные организации не готовят референс-сыворотки к вирусам Коксаки А. ФГУП Предприятие по производству бактерийных и вирусных препаратов Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова РАМН наладило производство диагностических сывороток ряда серотипов этих вирусов. Высокие репродуктивные потенции, проявляемые вирусами в клетках RD, послужили основой для применения этих клеток в качестве матрицы для наработки вируссодержащих суспензий. Культуральные варианты вирусов Коксаки А типов 2, 4, 7, 9 и 10 типов вводили кроликам в соответствии со стандартной схемой иммунизации [3]. Нейтрализующая активность полученных сывороток в культуре клеток RD была следующей: Коксаки А-2 - 1:2000, типа 4 - 1:2000, типа 7 - 1:600, типа 9 - 1:400, типа 10 - 1:200. Использование культуральных вариантов вирусов Коксаки А в качестве антигена для серологических исследований Для выяснения спектра и широты циркуляции вирусов Коксаки А среди людей были обследованы дети из домов ребенка и детских домов-интернатов Москвы. По возрасту детей можно разделить на 2 группы - ясельную (1-4 года) и дошкольно-школьную (5-15 лет). В домах ребенка было обследовано 262 ребенка, в детских домах-интернатах -281 ребенок. О циркуляции вирусов судили по наличию вируснейтрали-зующих антител в сыворотках обследованных детей. Сыворотку крови в разведении 1:8 исследовали в реакции нейтрализации одновременно с 14 антигенами. В качестве антигена использовали культуральные варианты вирусов Коксаки А типов 2, 3, 7, 9-11, 13-16, 18, 20, 21 и 24. В результате обследования детей из домов ребенка было установлено, что 213 (81,3%) обследованных имели вирусней-трализующие антитела к типам вируса 1-7, у 49 (18,7%) детей антитела отсутствовали. Наиболее часто встречались антитела к вирусам Коксаки A типа 10 (43,5%), типа 16 (37,0%), типа 2 (36,2%) и типа 18 (21,4%). Значительно реже были обнаружены антитела к вирусам Коксаки А типа 9 (18,3%) и типа 14 (9,5%). Лишь отдельные дети имели антитела к вирусам Коксаки А - типов 7, 11, 13, 15, 20, 21 и 24 типов. Ни у одного ребенка не было антител к вирусу Коксаки А-3. Среди обследованных детей 53% имели антитела к одному-двум типам вируса, у 21,8% детей имелись антитела к 3-4 типам вируса и у 6,5% обследованных были антитела к 5-7 типам вируса. У детей старшего возраста из детских домов 253 (90%) ребенка имели антитела к вирусам Коксаки А и только у 28 (10%) они отсутствовали. У обследованных детей практически были те же типы антител, что и у детей младшего возраста. Наиболее часто встречались антитела к вирусам Коксаки А типов 2 (54,1%), 10 (39,8%), 16 (37,7%), 14 (28,8%) и 9 (26,0%). Реже находили антитела к вирусам Коксаки А типов 18 (19,2%), 21 (13,9%), 7 (12,4%) и 20 (8,2%). Только отдельные дети имели антитела к вирусам Коксаки A типов 3 (0,7%) и 11 (1,3%). Не обнаружены антитела к вирусам Коксаки А типов 11, 15 и 24. В детских домах число детей с антителами было достоверно выше, чем таких детей в домах ребенка. Отмечена тенденция к уменьшению числа детей с антителами 1-2 типов вируса (46,6%) и достоверное увеличение числа детей с антителами к 3-4 типам вирусов (33,5%). Почти 10% имели антитела к 5-7 типам вируса (табл. 4 и 5). В Московской области было обследовано 162 ребенка в возрасте 3-14 лет. У этих детей так же часто, как и в Москве, обнаруживали антитела к вирусам Коксаки А типов 9, 14 и 16. Значительно чаще, чем в Москве, выявляли антитела к вирусам Коксаки А типов 15 и 24. В то же время антитела к вирусам Коксаки А типов 2, 10 и 18 обнаруживали значительно реже, чем в Москве. Одинаково редко обследованные дети имели антитела к вирусам Коксаки А типов 3, 7, 11, 13, 20 и 21 (см. табл. 5). Для выяснения широты циркуляции вирусов Коксаки A среди населения были проведены исследования на наличие антител к этим вирусам в 10 сериях противокоре-вого гамма-глобулина, изготовленного в Москве, Казани, Хабаровске и Швеции (табл. 6). Во всех исследованных препаратах обнаружены практически те же серотипы антител, что и в сыворотках детей. Число различных се-ротипов антител в одном препарате колебалось от 5-6 в одном московском, двух казанских, одном хабаровском и двух шведских препаратах, до 7-9 серотипов - в трех московских и одном хабаровском препаратах. Среди исследованных серий гамма-глобулина наиболее высокие титры антител обнаружены к вирусам Коксаки А типов 2 и 14. Антитела к этим типам вируса выявлены во всех обследованных сериях гамма-глобулина. Антитела к вирусам Коксаки А типов 9, 16 и 18 также отмечены во всех обследованных сериях, но в более низких титрах. Во всех сериях гамма-глобулина отсутствовали антитела к вирусам Коксаки A типов 3, 11, 13, 15 и 24. Спектр обнаруженных антител и величины титров антител в гамма-глобулине являются косвенными показателями широты циркуляции этих вирусов в популяции. Сравнение результатов обследования детей из Москвы и Московской области с результатами обследования гамма-глобулина, изготовленного в Москве, демонстрируют полное совпадение данных о циркуляции вирусов Коксаки А в городе. Изучение 8 серий российского гамма-глобулина показало, что вирусы Коксаки А типов 2, 9, 14, 16 и 18 циркулируют практически по всей стране - в центре, Поволжье, на Дальнем Востоке. В то же время вирусы Коксаки А типов 7, 20 и 21 циркулируют, вероятно, не так широко и встречаются на ограниченной территории, а вирусы Коксаки А типов 3, 11, 13, 15 и 24 в предыдущие годы либо не циркулировали в России, либо циркулировали крайне ограниченно. Исследование гамма-глобулина из Швеции показало ограниченную циркуляцию этих вирусов в стране. Обсуждение На протяжении многих десятилетий вирусологические и серологические исследования заболеваний, вызванные вирусами Коксаки A, и их циркуляции в природе оставались крайне ограниченными из-за необходимости проведения всех работ на лабораторных животных. Таблица 6 Результаты титрования антител к вирусам коксаки А в коммерческом гамма-глобулине Место из- Титр антител к вирусам Коксаки А, тип: готовления гаммаглобулина 2 7 9 10 14 16 18 20 21 Москва 128* 16 64 16 128 32 16 8 8 " 256 32 32 8 64 32 32 8 8 " 128 32 32 64 8 8 16 " 64 32 64 8 8 8 Казань 256 8 8 16 8 8 " 256 32 8 128 32 32 Хабаровск 128 64 16 128 16 32 " 256 64 32 16 64 16 16 Швеция 64 8 16 16 16 16 " 256 128 16 32 32 П р и м е ч а н и е . * - обратная величина титра В настоящее время в результате адаптации 17 из 23 серо-типов вируса к культуре клеток RD серологические исследования стали доступными, что позволяет проводить массовое обследование как больных, так и здорового населения. Это может играть большую роль как для диагностики заболеваний, так и для эпидемиологического анализа. Проведенные исследования показали, что частота обнаружения отдельных типов антител к вирусам Коксаки A у людей существенно различается, а, следовательно, существенно различается и циркуляция этих вирусов в популяции. Определенный интерес представляет динамика частоты обнаружения антител к отдельным типам вирусов Коксаки А. В Караганде в 1952 г. во время эпидемической вспышки полиомиелита от 6 больных были выделены 3 штамма вирусов - АБ-IV, ГЗ-IV и МК-IV Штамм АБ-IV был выделен от 2 детей с синдромом тяжелого бульбоспинального полиомиелита. Этот штамм был идентифицирован как прото-типный штамм вируса полиомиелита IV типа. Значительно позже было установлено, что эти штаммы являются вирусами Коксаки А-7. В 50-60-х годах ХХ века этот вирус был причиной обширных вспышек полиомиелитоподобных заболеваний в СССР, Шотландии, Швеции и Швейцарии. При обследовании в 1959 г. 678 сывороток детей из Москвы было установлено, что антитела к этому вирусу имеют в зависимости от возраста от 59 до 77% обследованных детей. Гамма-глобулин, приготовленный в конце 50-х годов ХХ века в Москве, Казани и других городах страны, содержал антитела к вирусу Коксаки А-7 во всех сериях в высоком титре [1]. Наши исследования показали, что в Москве антитела к этому вирусу имели 8,3% из 543 обследованных детей. В коммерческом гамма-глобулине антитела к этому вирусу в невысоком титре обнаружены в 4 препаратах из 10 обследованных. Это убедительно свидетельствует о резком сокращении циркуляции вируса за минувшие десятилетия. Широкое использование культуральных вариантов вирусов Коксаки A в лабораторной практике позволит значительно расширить наши знания о вирусах этой группы. Выводы 1. Проведена адаптация штаммов 17 серотипов вируса Коксаки A 2-4, 7, 9-18, 20, 21 и 24 к культуре клеток RD и 8 типов Коксаки А 7, 9, 10, 14, 16, 18, 20 и 21 к культуре клеток Vero. 2. Показана возможность использовать культуральные варианты 9 типов вируса Коксаки A для иммунизации кроликов и получения типоспецифических сывороток. 3. В настоящее время на основании адаптированных к культуре клеток RD штаммов вирусов Коксаки A типов 2, 4, 7, 9 и 10 налажено серийное производство диагностических сывороток. 4. Продемонстрирована возможность использования культуральных вариантов 14 типов вируса Коксаки A для массового серологического исследования сывороток детей в реакции нейтрализации. 5. На основании результатов серологических исследований показаны широкая циркуляция отдельных серотипов вируса Коксаки A среди детей Москвы и Московской области и резкое сокращение циркуляции вируса Коксаки А-7 в последние десятилетия.

References

Supplementary files