Detection of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus RNA in the Hyalomma marginatum ticks taken from bitten people

Full Text

Семейство иксодовых клещей (Ixodidae) - переносчиков вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки (ККГЛ) насчитывает около 30 видов и подвидов, относящихся к 6 родам. Во всех эндемичных регионах основное значение в передаче вируса имеют взрослые особи клещей рода Hyalomma: в европейских очагах - главным образом H. marginatum, в среднеазиатских - H. anatolicum, а также H. asiati-cum, H. turanicum и H. detritum [1]. По данным вирусологического обследования, средние показатели зараженности вирусом ККГЛ H. marginatum составляют 1:900 (0,1%), H. anatolicum - 1:3500 - 1:7700 (0,03-0,01%) [3]. В Астраханской области в 19671969 гг. методом заражения новорожденных белых мышей было обследовано 817 экземпляров имаго H. marginatum и выделен 1 (0,1%) штамм вируса. В Ростовской области из 1429 особей клещей трех видов на нем было изолировано 14 (1,0%) штаммов: 4 (0,3%) из H. marginatum, 9 (0,6%) из Rhipicephalus rossicus и 1 (0,1%) из Dermacentor marginatus [1]. Методом ОТ-ПЦР среди 207 пулов иксодовых клещей, собранных в Астраханской области, РНК вируса ККГЛ была обнаружена в 5 (2,4%) пробах, положительных также по данным ИФА [6]. В Ростовской области среди 295 суспензий иксодовых клещей (28 537 экземпляров) методом ИФА антиген вируса ККГЛ был выявлен в 33 (1,1%) пробах, из которых 26 (0,9%) были собраны с крупного рогатого скота (КРС) и 7 (0,2%) - в природных станциях при учетах “на флаг”. Вирусофорность H. marginatum и Rh. rossicus, снятых с КРС, оставила соответственно 2,3 и 1,5%, у D. marginatus, H. marginatum и Rh. rossicus, собранных “на флаг” - соответственно 0,9, 0,8 и 0,6%. В 66,7% случаев результаты ИФА были подтверждены в ОТ-ПЦР [5]. На территории Астраханской области зарегистрировано 13 видов иксодовых клещей, относящихся к 4 родам. Род Hyalomma насчитывает 6 или 7 видов: H. marginatum, H. scupense, H. dromedarii, H. detritum, H. asiaticum, H. daghestanicus. В течение 7 лет (19631969) обнаруживали H. impressum, появившихся, очевидно, в результате заноса мигрирующими птицами из Африки. Род Dermacentor представлен видом D. marginatus. Из клещей рода Rhipicephalus встречаются Rh. shulzei, Rh. pumillio, Rh. rossicus и Rh. sanguineus. Контактная информация: Бутенко Александр Михайлович, д-р биол. наук, проф., зав. отд.; e-mail:arboelisa@mail.ru В 1994 г. были обнаружены клещи Boophilus calcara-tus. Численность H. marginatum - основного переносчика вируса ККГЛ - ежегодно составляет 70-80% в общих сборах иксодовых клещей [2]. Среди клещей, снятых с жителей Астраханской области в 1995-1999 гг., вид H. marginatus встречался в 33% случаев - немного реже, чем Rh. pumillio (35,5%) [4]. Настоящая работа посвящена изучению видового состава, зараженности вирусом ККГЛ клещей, напавших на людей и питавшихся на них, а также определению вероятности заболевания крымской геморрагической лихорадкой (КГЛ) лиц, покусанных инфицированными особями H. marginatum. Материалы и методы Иксодовые клещи В 2006-2010 гг. в отделении генной диагностики Отдела особо опасных инфекций Центра гигиены и эпидемиологии (ЦГиЭ) Астраханской области методом ОТ-ПЦР на наличие РНК вируса ККГЛ было обследовано 1100 экземпляров иксодовых клещей, снятых с покусанных людей после присасывания, - все в стадии имаго, из них 275 (25%) самок и 825 (75%) самцов. В 2006, 2007, 2008, 2009 и 2010 гг. было обследовано соответственно 67, 255, 202, 267 и 309 экземпляров. Клещей исследовали индивидуально. Каждого клеща помещали в пробирку типа Эппендорф, добавляли 1 мл 95% этанола и встряхивали на вортексе. Пробирку центрифугировали в течение 3-5 с при 5 000 об/мин на микроцентрифуге для удаления капель с внутренней поверхности крышки пробирки, после чего жидкость удаляли с помощью вакуумного насоса. Затем в эту же пробирку с клещом добавляли 1 мл физиологического раствора (0,15 М раствора хлорида натрия), встряхивали на вортексе, центрифугировали для удаления капель с внутренней поверхности крышки пробирки, после чего жидкость удаляли с помощью вакуумного насоса. Для приготовления клещевых суспензий использовали стерильные фарфоровые ступки и пестики. В случае гомогенизации напитавшегося клеща его предварительно прокалывали стерильной одноразовой иглой в нескольких местах для выхода крови. Клеща растирали в 500 мкл физиологического раствора. Полученную суспензию центрифугировали в течение 1 мин при 13 000 об/мин и отбирали 150 мкл надосадочной жидкости для выделения РНК. Выделение РНК из суспензий клещей проводили методом сорбции на силикагеле с предшествующим ли-зированием пробы в растворе, содержащем гуанидин тиоцианат, с использованием набора “РИБО-сорб” (при исследовании голодных клещей), а при исследовании напитавшихся клещей - с помощью набора “Рибозоль” в сочетании с “РИБО-сорб” производства ЦНИИЭ (в соответствии с инструкцией производителя). ПЦР проводили в объеме 25 мкл на амплификаторе Gene-Amp-2700 (“Applied Biosystems”) по стандартным методикам с использованием специфических праймеров, входящих в состав набора реагентов для амплификации кДНК вируса ККГЛ производства ЦНИИЭ. Анализ продуктов ПЦР осуществляли методом гель-электрофореза в 2% агарозном геле с окраской фрагментов кДНК этидия бромидом и визуализацией в УФ-свете. Метод ИФА-IgM. Специфические IgM в сыворотках крови больных КГЛ определяли методом MAC-ELISA. В лунках полистиролового планшета сорбировали козьи IgG (фирмы “Sigma”, США) к ц-цепи Ig человека. Затем последовательно вносили обследуемые сыворотки, сахарозоацетоновый антиген вируса ККГЛ (или нормальный контрольный антиген из мозга неинфицированных новорожденных белых мышей) и мышиные моноклональные антитела к вирусу ККГЛ (ГЕМА-12), меченные пероксидазой хрена. На каждом этапе постановки ИФА-IgM реакционные компоненты инкубировали в течение 1 ч при 37°C, затем смесь тщательно промывали 0,01 М фосфатнобуферным раствором (ФБР) с pH 7,4 с добавлением 0,15 М NaCl и 0,05% твина-20. Субстрат-индикаторной системой служил раствор тетраметилбензидина с 0,006% перекиси водорода (H2O2). Реакцию останавливали 2 N раствором серной кислоты. Результаты реакции учитывали по величине оптической плотности (ОП) при длине волны 450 нм. В каждом опыте использовали гетерологич-ные или нормальные контрольные антигены, а также контрольные, позитивные на IgM сыворотки больных КГЛ. Реакцию считали положительной, если отношение экстинкции опытных и контрольных образцов составляло не менее 3,0 (при ОП 450 нм не ниже 0,3 для опытных образцов и не выше 0,1 в контроле). Метод ИФА-IgG. Реакцию также проводили в 96-луночных полистироловых планшетах с сорбированными поликлональными мышиными IgG к вирусу ККГЛ. Остальные реагенты вносили в следующей последовательности: блокирующий раствор 1% бычьего сывороточного альбумина, специфичный вирусный антиген (или нормальный контрольный антиген), обследуемые сыворотки и мышиные антитела к IgG человека, меченные пероксидазой хрена (НИИ иммунологии РАН, Москва). Результаты реакции учитывали так же, как при постановке MAC-ELISA. Результаты Среди 1100 клещей, снятых с людей после присасывания, было 1076 экземпляров имаго H. marginatum, 23 H. niveus и 1 D. marginatus. Нападение и присасывание клещей происходило на дачных и приусадебных участках (46,4%), при уходе за домашними животными (23,6%), выполнении сельскохозяйственных работ в поле (14,9%), во время поездок на рыбалку и отдых (11%) и других поездок за город (5,1%). Продолжительность присасывания клещей в момент их удаления с покусанных людей составляла от 1,5-2 ч до 10 дней. Результаты обследования в ОТ-ПЦР 23 клещей H. niveus и 1 экземпляра D. marginatus оказались отрицательными. Среди 1076 имаго H. marginatum было выявлено 10 (0,9%) особей, содержащих РНК вируса ККГЛ: в 2007 г. 6 (2,5%), в 2008 г. 2 (1%), в 2009 г. 1 (0,4%) и в 2010 г. 1 (0,3%). Результаты обследования 67 экземпляров H. marginatum в 2006 г. оказались негативными. Зараженность клещей этого вида, снятых в 2006-2010 гг. с покусанных людей, составила 0,9% (см. таблицу). Из 10 человек, покусанных клещами, которые по данным ОТ-ПЦР содержали РНК вируса ККГЛ, диагноз КГЛ был подтвержден у трех при обследовании сывороток крови в ОТ-ПЦР и ИФА. Больной X., 56 лет, 10 июня 2007 г. в течение дня находился на дачном участке. Вечером возвратился в Астрахань, где при осмотре у него обнаружили присо- Результаты обследования клещей H. marginatum, снятых с покусанных людей в 2006--2010 гг., на наличие РНк вируса ккГЛ методом ОТ-ПЦР Годы Число обследованных клещей Число положительных результатов Положительных результаты, % 2006 67 0 0 2007 235 6 2,5 2008 199 2 1,0 2009 266 1 0,4 2010 309 1 0,3 Всего... 1076 10 0,9 савшегося клеща. 13 июня почувствовал недомогание. Появилась ломота в теле, боли в животе, температура поднялась до 38,9°C. Госпитализирован в областную инфекционную клиническую больницу (ОИКБ) с предварительным диагнозом “вирусная инфекция неясной этиологии” (ВИНЭ). В лаборатории особо опасных инфекций ЦГиЭ клещ, снятый 10 июня, был идентифицирован как самец H. marginatum. Продолжительность его присасывания составляла от 1,5 до 2 ч. В клеще методом ОТ-ПЦР была обнаружена высокая концентрация РНК вируса ККГЛ. Результат обследования в ОТ-ПЦР сыворотки крови, взятой у больного 27 июня, оказался отрицательным при наличии специфических IgM в титре > 1:800 и IgG в титре 1:400. Окончательный диагноз: КГЛ средней тяжести без геморрагического синдрома. Инкубационный период заболевания - 4 дня. Больной В., 53 лет, был укушен клещом (самец H. marginatum) 21 июня 2008 г. Заболел 24 июня, когда температура тела поднялась до 39,2°C. Появилось недомогание, слабость, головная боль, боли в икроножных мышцах. Количество лейкоцитов 1800, тромбоцитов 130 500. В суспензии клеща, снятого 22 июня, методом ОТ-ПЦР обнаружена РНК вируса ККГЛ, как и в сыворотке крови больного, взятой 23 июня. Сыворотка крови, взятая 30 июня, по данным ИФА, содержала специфические IgM к вирусу ККГЛ в титре 1:3200. Окончательный диагноз: КГЛ с геморрагическим синдромом без полостных кровотечений. В данном случае присосавшийся инфицированный клещ находился на теле пациента около 1 сут, инкубационный период болезни составил 4 дня. Больной А., 39 лет, 18 июня 2010 г. работал в поле. Вечером того же дня при осмотре в подлопаточной области у него был обнаружен присосавшийся клещ (самка H. marginatum). 24 июня температура тела поднялась до 40°C и появился жидкий стул (5-6 раз в сутки) и рвота. В течение 2 дней с высокой температурой находился дома. 25 июня был госпитализирован в ЦРБ, откуда 26 июня переведен в ОИКБ с температурой 39°C, головной болью, выраженность слабостью. Количество тромбоцитов: 25 июня 83 000, 26 июня 61 000, 28 июня 118 000. В суспензии клеща, снятого 18 июня, как и в сыворотке крови больного, взятой 28 июня (на 5-й день заболевания), методом ОТ-ПЦР обнаружена специфическая РНК вируса ККГЛ. Сыворотка крови, взятая 1 июля, содержала специфические IgM в титре 1:204 800 при отсутствии антител класса G. Инкубационный период болезни составил 7 дней. Окончательный диагноз: КГЛ без геморрагического синдрома, среднетяжелая форма. Двое больных после укусов клещей, содержащих РНК вируса ККГЛ, были госпитализированы с острыми лихорадочными заболеваниями, но обследование их сывороток крови в ОТ-ПЦР, ИФА-IgM и ИФА-IgG не проводилось, поэтому этиологическая связь этих случаев с вирусом ККГЛ достоверно не установлена. Больной С., 71 год, 18 мая 2008 г. был на дачном участке. 21 мая почувствовал сильное недомогание. Сутки пролежал дома с высокой температурой. 22 мая с предварительным диагнозом ОИНЭ госпитализирован в ОИКБ, где в области подмышки у него был обнаружен присосавшийся клещ (самец H. marginatum), который находился на теле в течение 4 дней. Результат обследования клеща в ОТ-ПЦР на РНК вируса ККГЛ оказался положительным. Больная К., 70 лет, вечером 10 июня 2009 г. после однодневного пребывания на дачном участке обнаружила и сняла с себя клеща (самец H. marginatum). На 3-и сутки после укуса у нее поднялась температура, появилось общее недомогание, боли в горле и мышцах. 15 июня госпитализирована в ОИКБ с диагнозом ОИНЭ. По данным ОТ-ПЦР, снятый клещ содержал высокую концентрацию РНК вируса ККГЛ. Обсуждение По данным обследования методом ОТ-ПЦР, 1076 экземпляров H. marginatum, снятых с покусанных людей в Астраханской области, показатели зараженности этого вида составляли: в 2007 г. 2,5%, в 2008 г. 1%, в 2009 г. 0,4%, в 2010 г. 0,3%. Результаты обследования 67 особей H. marginatum в 2006 г. оказались отрицательными. В 2006 г. в области было зарегистрировано 16 лабораторно подтвержденных случаев КГЛ, в 2007 г. 20, в 2008 г. 5, в 2009 г. 6, в 2010 г. 7. Наши данные о зараженности имаго H. marginatum, представленные в этой статье, совпадают с предшествующей информацией ряда авторов. Так, по суммарным результатам вирусологического обследования в европейских очагах КГЛ, вирусофорность этого вида составляла 0,1% [3], в Астраханской области - 0,1%, в Ростовской области - 0,8-1,3% [1, 5, 6]. Среди 1076 имаго H. marginatum, снятых с покусанных людей в Астраханской области, 10 (0,9%) клещей содержали РНК вируса ККГЛ. Из 10 человек, покусанных инфицированными клещами, трем на основании клинических данных и результатов обследования с помощью ОТ-ПЦР, ИФА-IgM и ИФА-IgG, был поставлен диагноз КГЛ. У двух других наблюдались острые лихорадочные заболевания, но обследование их сывороток в ОТ-ПЦР и ИФА не было проведено, поэтому этиологическая связь этих случаев с вирусом КГЛ достоверно не установлена. Таким образом, в 2006-2010 гг. из 1076 лиц, покусанных клещами H. marginatum, заболели 3 или 5 человек. Учитывая относительно низкий процент зараженности H. marginatum вирусом ККГЛ (0,9%), расчетные показатели инфицирования покусанных лиц, выражающиеся в развитии клинически выраженных случаев КГЛ, составляют 0,3-0,4%. При дальнейшем изучении возможных последствий укусов клещей в очагах КГЛ необходимо определить вероятность инаппарантных, стертых или атипичных случаев этой инфекции как при положительных, так и при отрицательных результатах обследования клещей в ОТ-ПЦР на наличие РНК вируса КГЛ.

References

Supplementary files