Детекция РНК вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки в клещах Hyalomma marginatum, снятых с покусанных людей


Цитировать

Полный текст

Аннотация

Среди 1076 клещей имаго Hyalomma marginatum, снятых с покусанных людей в Астраханской области в 2006-2010 гг., 10 (0,9%) клещей по данным ОТ-ПЦР содержали РНК вируса ККГЛ. Из 10 человек, покусанных инфицированными клещами, трем на основании клинических данных и результатов обследования сывороток крови в ОТ-ПЦР, ИФА-IgM и ИФА-IgG был поставлен диагноз КГЛ. У двух других наблюдались острые лихорадочные заболевания, но их обследование в ОТ-ПЦР и ИФА не проводилось, поэтому этиологическая связь этих случаев с вирусом ККГЛ достоверно не установлена.

Полный текст

Семейство иксодовых клещей (Ixodidae) - переносчиков вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки (ККГЛ) насчитывает около 30 видов и подвидов, относящихся к 6 родам. Во всех эндемичных регионах основное значение в передаче вируса имеют взрослые особи клещей рода Hyalomma: в европейских очагах - главным образом H. marginatum, в среднеазиатских - H. anatolicum, а также H. asiati-cum, H. turanicum и H. detritum [1]. По данным вирусологического обследования, средние показатели зараженности вирусом ККГЛ H. marginatum составляют 1:900 (0,1%), H. anatolicum - 1:3500 - 1:7700 (0,03-0,01%) [3]. В Астраханской области в 19671969 гг. методом заражения новорожденных белых мышей было обследовано 817 экземпляров имаго H. marginatum и выделен 1 (0,1%) штамм вируса. В Ростовской области из 1429 особей клещей трех видов на нем было изолировано 14 (1,0%) штаммов: 4 (0,3%) из H. marginatum, 9 (0,6%) из Rhipicephalus rossicus и 1 (0,1%) из Dermacentor marginatus [1]. Методом ОТ-ПЦР среди 207 пулов иксодовых клещей, собранных в Астраханской области, РНК вируса ККГЛ была обнаружена в 5 (2,4%) пробах, положительных также по данным ИФА [6]. В Ростовской области среди 295 суспензий иксодовых клещей (28 537 экземпляров) методом ИФА антиген вируса ККГЛ был выявлен в 33 (1,1%) пробах, из которых 26 (0,9%) были собраны с крупного рогатого скота (КРС) и 7 (0,2%) - в природных станциях при учетах “на флаг”. Вирусофорность H. marginatum и Rh. rossicus, снятых с КРС, оставила соответственно 2,3 и 1,5%, у D. marginatus, H. marginatum и Rh. rossicus, собранных “на флаг” - соответственно 0,9, 0,8 и 0,6%. В 66,7% случаев результаты ИФА были подтверждены в ОТ-ПЦР [5]. На территории Астраханской области зарегистрировано 13 видов иксодовых клещей, относящихся к 4 родам. Род Hyalomma насчитывает 6 или 7 видов: H. marginatum, H. scupense, H. dromedarii, H. detritum, H. asiaticum, H. daghestanicus. В течение 7 лет (19631969) обнаруживали H. impressum, появившихся, очевидно, в результате заноса мигрирующими птицами из Африки. Род Dermacentor представлен видом D. marginatus. Из клещей рода Rhipicephalus встречаются Rh. shulzei, Rh. pumillio, Rh. rossicus и Rh. sanguineus. Контактная информация: Бутенко Александр Михайлович, д-р биол. наук, проф., зав. отд.; e-mail:arboelisa@mail.ru В 1994 г. были обнаружены клещи Boophilus calcara-tus. Численность H. marginatum - основного переносчика вируса ККГЛ - ежегодно составляет 70-80% в общих сборах иксодовых клещей [2]. Среди клещей, снятых с жителей Астраханской области в 1995-1999 гг., вид H. marginatus встречался в 33% случаев - немного реже, чем Rh. pumillio (35,5%) [4]. Настоящая работа посвящена изучению видового состава, зараженности вирусом ККГЛ клещей, напавших на людей и питавшихся на них, а также определению вероятности заболевания крымской геморрагической лихорадкой (КГЛ) лиц, покусанных инфицированными особями H. marginatum. Материалы и методы Иксодовые клещи В 2006-2010 гг. в отделении генной диагностики Отдела особо опасных инфекций Центра гигиены и эпидемиологии (ЦГиЭ) Астраханской области методом ОТ-ПЦР на наличие РНК вируса ККГЛ было обследовано 1100 экземпляров иксодовых клещей, снятых с покусанных людей после присасывания, - все в стадии имаго, из них 275 (25%) самок и 825 (75%) самцов. В 2006, 2007, 2008, 2009 и 2010 гг. было обследовано соответственно 67, 255, 202, 267 и 309 экземпляров. Клещей исследовали индивидуально. Каждого клеща помещали в пробирку типа Эппендорф, добавляли 1 мл 95% этанола и встряхивали на вортексе. Пробирку центрифугировали в течение 3-5 с при 5 000 об/мин на микроцентрифуге для удаления капель с внутренней поверхности крышки пробирки, после чего жидкость удаляли с помощью вакуумного насоса. Затем в эту же пробирку с клещом добавляли 1 мл физиологического раствора (0,15 М раствора хлорида натрия), встряхивали на вортексе, центрифугировали для удаления капель с внутренней поверхности крышки пробирки, после чего жидкость удаляли с помощью вакуумного насоса. Для приготовления клещевых суспензий использовали стерильные фарфоровые ступки и пестики. В случае гомогенизации напитавшегося клеща его предварительно прокалывали стерильной одноразовой иглой в нескольких местах для выхода крови. Клеща растирали в 500 мкл физиологического раствора. Полученную суспензию центрифугировали в течение 1 мин при 13 000 об/мин и отбирали 150 мкл надосадочной жидкости для выделения РНК. Выделение РНК из суспензий клещей проводили методом сорбции на силикагеле с предшествующим ли-зированием пробы в растворе, содержащем гуанидин тиоцианат, с использованием набора “РИБО-сорб” (при исследовании голодных клещей), а при исследовании напитавшихся клещей - с помощью набора “Рибозоль” в сочетании с “РИБО-сорб” производства ЦНИИЭ (в соответствии с инструкцией производителя). ПЦР проводили в объеме 25 мкл на амплификаторе Gene-Amp-2700 (“Applied Biosystems”) по стандартным методикам с использованием специфических праймеров, входящих в состав набора реагентов для амплификации кДНК вируса ККГЛ производства ЦНИИЭ. Анализ продуктов ПЦР осуществляли методом гель-электрофореза в 2% агарозном геле с окраской фрагментов кДНК этидия бромидом и визуализацией в УФ-свете. Метод ИФА-IgM. Специфические IgM в сыворотках крови больных КГЛ определяли методом MAC-ELISA. В лунках полистиролового планшета сорбировали козьи IgG (фирмы “Sigma”, США) к ц-цепи Ig человека. Затем последовательно вносили обследуемые сыворотки, сахарозоацетоновый антиген вируса ККГЛ (или нормальный контрольный антиген из мозга неинфицированных новорожденных белых мышей) и мышиные моноклональные антитела к вирусу ККГЛ (ГЕМА-12), меченные пероксидазой хрена. На каждом этапе постановки ИФА-IgM реакционные компоненты инкубировали в течение 1 ч при 37°C, затем смесь тщательно промывали 0,01 М фосфатнобуферным раствором (ФБР) с pH 7,4 с добавлением 0,15 М NaCl и 0,05% твина-20. Субстрат-индикаторной системой служил раствор тетраметилбензидина с 0,006% перекиси водорода (H2O2). Реакцию останавливали 2 N раствором серной кислоты. Результаты реакции учитывали по величине оптической плотности (ОП) при длине волны 450 нм. В каждом опыте использовали гетерологич-ные или нормальные контрольные антигены, а также контрольные, позитивные на IgM сыворотки больных КГЛ. Реакцию считали положительной, если отношение экстинкции опытных и контрольных образцов составляло не менее 3,0 (при ОП 450 нм не ниже 0,3 для опытных образцов и не выше 0,1 в контроле). Метод ИФА-IgG. Реакцию также проводили в 96-луночных полистироловых планшетах с сорбированными поликлональными мышиными IgG к вирусу ККГЛ. Остальные реагенты вносили в следующей последовательности: блокирующий раствор 1% бычьего сывороточного альбумина, специфичный вирусный антиген (или нормальный контрольный антиген), обследуемые сыворотки и мышиные антитела к IgG человека, меченные пероксидазой хрена (НИИ иммунологии РАН, Москва). Результаты реакции учитывали так же, как при постановке MAC-ELISA. Результаты Среди 1100 клещей, снятых с людей после присасывания, было 1076 экземпляров имаго H. marginatum, 23 H. niveus и 1 D. marginatus. Нападение и присасывание клещей происходило на дачных и приусадебных участках (46,4%), при уходе за домашними животными (23,6%), выполнении сельскохозяйственных работ в поле (14,9%), во время поездок на рыбалку и отдых (11%) и других поездок за город (5,1%). Продолжительность присасывания клещей в момент их удаления с покусанных людей составляла от 1,5-2 ч до 10 дней. Результаты обследования в ОТ-ПЦР 23 клещей H. niveus и 1 экземпляра D. marginatus оказались отрицательными. Среди 1076 имаго H. marginatum было выявлено 10 (0,9%) особей, содержащих РНК вируса ККГЛ: в 2007 г. 6 (2,5%), в 2008 г. 2 (1%), в 2009 г. 1 (0,4%) и в 2010 г. 1 (0,3%). Результаты обследования 67 экземпляров H. marginatum в 2006 г. оказались негативными. Зараженность клещей этого вида, снятых в 2006-2010 гг. с покусанных людей, составила 0,9% (см. таблицу). Из 10 человек, покусанных клещами, которые по данным ОТ-ПЦР содержали РНК вируса ККГЛ, диагноз КГЛ был подтвержден у трех при обследовании сывороток крови в ОТ-ПЦР и ИФА. Больной X., 56 лет, 10 июня 2007 г. в течение дня находился на дачном участке. Вечером возвратился в Астрахань, где при осмотре у него обнаружили присо- Результаты обследования клещей H. marginatum, снятых с покусанных людей в 2006--2010 гг., на наличие РНк вируса ккГЛ методом ОТ-ПЦР Годы Число обследованных клещей Число положительных результатов Положительных результаты, % 2006 67 0 0 2007 235 6 2,5 2008 199 2 1,0 2009 266 1 0,4 2010 309 1 0,3 Всего... 1076 10 0,9 савшегося клеща. 13 июня почувствовал недомогание. Появилась ломота в теле, боли в животе, температура поднялась до 38,9°C. Госпитализирован в областную инфекционную клиническую больницу (ОИКБ) с предварительным диагнозом “вирусная инфекция неясной этиологии” (ВИНЭ). В лаборатории особо опасных инфекций ЦГиЭ клещ, снятый 10 июня, был идентифицирован как самец H. marginatum. Продолжительность его присасывания составляла от 1,5 до 2 ч. В клеще методом ОТ-ПЦР была обнаружена высокая концентрация РНК вируса ККГЛ. Результат обследования в ОТ-ПЦР сыворотки крови, взятой у больного 27 июня, оказался отрицательным при наличии специфических IgM в титре > 1:800 и IgG в титре 1:400. Окончательный диагноз: КГЛ средней тяжести без геморрагического синдрома. Инкубационный период заболевания - 4 дня. Больной В., 53 лет, был укушен клещом (самец H. marginatum) 21 июня 2008 г. Заболел 24 июня, когда температура тела поднялась до 39,2°C. Появилось недомогание, слабость, головная боль, боли в икроножных мышцах. Количество лейкоцитов 1800, тромбоцитов 130 500. В суспензии клеща, снятого 22 июня, методом ОТ-ПЦР обнаружена РНК вируса ККГЛ, как и в сыворотке крови больного, взятой 23 июня. Сыворотка крови, взятая 30 июня, по данным ИФА, содержала специфические IgM к вирусу ККГЛ в титре 1:3200. Окончательный диагноз: КГЛ с геморрагическим синдромом без полостных кровотечений. В данном случае присосавшийся инфицированный клещ находился на теле пациента около 1 сут, инкубационный период болезни составил 4 дня. Больной А., 39 лет, 18 июня 2010 г. работал в поле. Вечером того же дня при осмотре в подлопаточной области у него был обнаружен присосавшийся клещ (самка H. marginatum). 24 июня температура тела поднялась до 40°C и появился жидкий стул (5-6 раз в сутки) и рвота. В течение 2 дней с высокой температурой находился дома. 25 июня был госпитализирован в ЦРБ, откуда 26 июня переведен в ОИКБ с температурой 39°C, головной болью, выраженность слабостью. Количество тромбоцитов: 25 июня 83 000, 26 июня 61 000, 28 июня 118 000. В суспензии клеща, снятого 18 июня, как и в сыворотке крови больного, взятой 28 июня (на 5-й день заболевания), методом ОТ-ПЦР обнаружена специфическая РНК вируса ККГЛ. Сыворотка крови, взятая 1 июля, содержала специфические IgM в титре 1:204 800 при отсутствии антител класса G. Инкубационный период болезни составил 7 дней. Окончательный диагноз: КГЛ без геморрагического синдрома, среднетяжелая форма. Двое больных после укусов клещей, содержащих РНК вируса ККГЛ, были госпитализированы с острыми лихорадочными заболеваниями, но обследование их сывороток крови в ОТ-ПЦР, ИФА-IgM и ИФА-IgG не проводилось, поэтому этиологическая связь этих случаев с вирусом ККГЛ достоверно не установлена. Больной С., 71 год, 18 мая 2008 г. был на дачном участке. 21 мая почувствовал сильное недомогание. Сутки пролежал дома с высокой температурой. 22 мая с предварительным диагнозом ОИНЭ госпитализирован в ОИКБ, где в области подмышки у него был обнаружен присосавшийся клещ (самец H. marginatum), который находился на теле в течение 4 дней. Результат обследования клеща в ОТ-ПЦР на РНК вируса ККГЛ оказался положительным. Больная К., 70 лет, вечером 10 июня 2009 г. после однодневного пребывания на дачном участке обнаружила и сняла с себя клеща (самец H. marginatum). На 3-и сутки после укуса у нее поднялась температура, появилось общее недомогание, боли в горле и мышцах. 15 июня госпитализирована в ОИКБ с диагнозом ОИНЭ. По данным ОТ-ПЦР, снятый клещ содержал высокую концентрацию РНК вируса ККГЛ. Обсуждение По данным обследования методом ОТ-ПЦР, 1076 экземпляров H. marginatum, снятых с покусанных людей в Астраханской области, показатели зараженности этого вида составляли: в 2007 г. 2,5%, в 2008 г. 1%, в 2009 г. 0,4%, в 2010 г. 0,3%. Результаты обследования 67 особей H. marginatum в 2006 г. оказались отрицательными. В 2006 г. в области было зарегистрировано 16 лабораторно подтвержденных случаев КГЛ, в 2007 г. 20, в 2008 г. 5, в 2009 г. 6, в 2010 г. 7. Наши данные о зараженности имаго H. marginatum, представленные в этой статье, совпадают с предшествующей информацией ряда авторов. Так, по суммарным результатам вирусологического обследования в европейских очагах КГЛ, вирусофорность этого вида составляла 0,1% [3], в Астраханской области - 0,1%, в Ростовской области - 0,8-1,3% [1, 5, 6]. Среди 1076 имаго H. marginatum, снятых с покусанных людей в Астраханской области, 10 (0,9%) клещей содержали РНК вируса ККГЛ. Из 10 человек, покусанных инфицированными клещами, трем на основании клинических данных и результатов обследования с помощью ОТ-ПЦР, ИФА-IgM и ИФА-IgG, был поставлен диагноз КГЛ. У двух других наблюдались острые лихорадочные заболевания, но обследование их сывороток в ОТ-ПЦР и ИФА не было проведено, поэтому этиологическая связь этих случаев с вирусом КГЛ достоверно не установлена. Таким образом, в 2006-2010 гг. из 1076 лиц, покусанных клещами H. marginatum, заболели 3 или 5 человек. Учитывая относительно низкий процент зараженности H. marginatum вирусом ККГЛ (0,9%), расчетные показатели инфицирования покусанных лиц, выражающиеся в развитии клинически выраженных случаев КГЛ, составляют 0,3-0,4%. При дальнейшем изучении возможных последствий укусов клещей в очагах КГЛ необходимо определить вероятность инаппарантных, стертых или атипичных случаев этой инфекции как при положительных, так и при отрицательных результатах обследования клещей в ОТ-ПЦР на наличие РНК вируса КГЛ.
×

Список литературы

  1. Бутенко А. М. Крымская геморрагическая лихорадка // Покровский В. И., Онищенко Г. Г., Черкасский Б. Л. Эволюция инфекционных болезней в России в XX веке. - М.: Медицина, 2003. - С. 365-376.
  2. Зимина Ю. В., Куликова А. И., Салько В. Н., Ковтунов А. И. Иксодовые клещи Астраханской области, их роль в формировании природных очагов и передачи арбовирусов человеку // Вопросы риккетсиологии и вирусологии: Сборник науч. трудов. - Астрахань; М., 1996. - С. 58-59.
  3. Львов Д. К., Бутенко А. М. Крымская геморрагическая лихорадка // Арбовирусы и арбовирусные инфекции. - М., 1989. - С. 236.
  4. Малеев В. В., Галимзянов Х. М., Бутенко А. М., Чернов И. В. Крымская геморрагическая лихорадка. - М.; Астрахань, 2003.
  5. Москвитина Э. А., Водяницкая С. Ю., Ломов Ю. М. и др. Современное состояние природного очага крымской геморрагической лихорадки в Ростовской области // Арбовирусы и арбовирусные инфекции: Материалы пленума проблемной комиссии «Арбовирусы» и науч.-практ. конф. «Арбовирусы и арбовирусные инфекции», Астрахань, 17-20 октября 2006 г. - М., 2007. - С. 128-132.
  6. Топорков А. В., Кабин В. В., Тарасов М. А. и др. Организационнометодические аспекты обследования сочетанных очагов особо опасных арбовирусных и бактериальных инфекций (на примере Среднего и Нижнего Поволжья) // Арбовирусы и арбовирусные инфекции: Материалы пленума проблемной комиссии «Арбовирусы» и науч.-практ. конф. «Арбовирусы и арбовирусные инфекции», Астрахань, 17-20 октября 2006 г. - М., 2007. - С. 147-149.
  7. CCHF morbidity rates among persons bitten by infected ticks

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML

© Путилина Н.Г., Мальков П.М., Куликова Л.Н., Азарян А.Р., Трусова И.Н., Гришанова А.П., Ковтунов А.И., Шендо Г.Л., Джаркенов А.Ф., Самарина О.Ю., Аршба Т.Е., Бутенко А.М., 2012

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.

СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС77-77676 от 29.01.2020.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах