Dynamics of Changes in the Composition of Leukocyte Population of Peripheral Blood during the African Swine Fever

Full Text

Африканская чума свиней (АЧС), или восточноафриканская лихорадка, - высококонтагиозное заболевание, которое вызывает крупный оболочечный вирус, содержащий двуспиральную ДНК. Он является единственным представителем семейства Asfarviridae (Dixon et al., 2005) и обладает высокой вирулентностью. Репродукция вируса происходит в лимфоидной и миелоидной тканях органов иммунной системы, эндотелиальных клетках кровеносных и лимфатических сосудов, но прежде всего в клетках моноцитарно-макрофагального ряда (Mebus, 1987; Gomez et al., 1999) и сопровождается цитопатическим действием на лимфоциты, макрофаги и эндотелиальные клетки. Это приводит к лейкопении и резкому ослаблению противовирусных иммунных механизмов, т. е. к иммунодефициту и смертельному исходу. Основы биологии патологических изменений лимфоидной ткани, вызываемых АЧС, непонятны до сегодняшнего дня, однако неоспорима ключевая роль моноцитарно-макрофагальной системы и продукция ею провоспалительных цитокинов (Whittall, Park-house, 1997; Gomez et al, 1999). Ранее в условиях in vitro в костном мозге нами было продемонстрировано возникновение атипичных Контактная информация: Каралян Завен Александрович; e-mail:zkaralyan@yahoo.com клеток под воздействием вируса АЧС (Каралова Е. М. и соавт., 2011). В связи с этим представлялось важным изучение динамики изменений в популяционном составе нейтрофилов, возможного появления их атипичных форм в периферической крови свиней при экспериментально вызванной острой форме АЧС, чему и посвящено настоящее исследование. Материалы и методы Работу проводили на 3 здоровых и 6 зараженных вирусом АЧС свиней с массой тела около 40 кг. Исследовали динамику изменений популяционного состава лейкоцитов периферической крови свиней при экспериментально вызванной внутримышечным введением вируса АЧС с 3-х по 7-е сутки развития болезни. В работе использовали вирус АЧС генотипа II, поразивший Грузию, а затем и соседние страны, в том числе Армению [3, 13]. Инфекционный титр вируса АЧС определяли методом гемадсорбции [16]. Доза вируса АЧС, используемая в опытах на свиньях, составляла 104 гемадсорбирующих единиц (ГАЕ50/мл). Периферическую кровь для приготовления мазков брали из уха здоровых и зараженных вирусом свиней. Мазки фиксировали в 96% этиловом спирте и окра 27 шивали азур-эозином по Романовскому-Гимзе [12]. Подсчитывали процентное соотношение всех нейтро-филов крови, а также клеток, выявленных при патологии. Весь материал статистически обрабатывали и с помощью t-критерия оценивали значимость различий между полученными сравниваемыми значениями. Результаты Течение экспериментальной инфекции не отличалось от описанного в приведенных источниках. Инфекция достигала агональной стадии к концу 6-х или на 7-е сутки с момента заражения [4, 9]. В первые 2 сут после заражения симптомы практически отсутствовали, несмотря на виремию, наблюдаемую со 2-х суток (до 4-5 ГАЕ/мл). С 3-4-х суток наблюдали гипертермию, потерю аппетита, затем быстрое нарастание основной симптоматики, выражающееся в подъеме температуры тела до 40-42oC, снижении активности, затруднении дыхания. На 5-6-е сутки у некоторых животных обнаруживали кровь в фекалиях. Симптоматика нарастала, и на терминальной стадии (начало 7-х суток) животных умерщвляли согласно протоколу. Изучали 12 видов клеток, из которых у здоровых свиней встречается 8 видов лейкоцитов. Из них более 60% составляют лимфоциты. Лимфобласты, эритро-бласты, атипичные и разрушенные клетки полностью отсутствовали. Начиная с 3-х суток от начала опыта, в крови появляются лимфобласты, количество которых составляет около 3% клеток крови. По мере удлинения сроков заболевания их количество увеличивалось более чем в 3 раза, достигая к моменту гибели животных 10% популяции (рис. 1). Атипичные лимфоциты также были обнаружены на 3-и сутки заболевания и, незначительно меняясь, сохранялись на всем протяжении болезни, в среднем составляя около 5% популяции. Количество эри-тробластов на 3-4-е сутки составляло 6% популяции, а уже на 4-е сутки удваивалось, сохраняясь на 5-е сутки, а затем постепенно уменьшалось и к моменту гибели составляло 3% популяции, что, вероятнее всего, связано с массовой гибелью всех клеток периферической крови, достигающей к 7-м суткам 60% популяции. Гибель всех видов лейкоцитов начиналась с 3-х суток заболевания и, постоянно нарастая, к 7-м суткам уменьшалась более чем в 3 раза (см. таблицу). Количество моноцитов крови зараженных свиней вплоть до 6-х суток изменялось незначительно по сравнению со здоровыми свиньями, а затем недостоверно снижалось. Как и в контроле, нами не были обнаружены юные нейтрофилы, а палочкоядерные и сегментоядерные формы, составляющие в контрольной группе животных 25% популяции, в течение болезни вели себя по-разному. Если количество сегментоядерных нейтро-филов на всем протяжении болезни достоверно уменьшалось и к 7-м суткам составляло всего 0,3% клеток Рис. 1. Разные типы клеток периферической крови свиней при африканской чуме. Слева - клетки, окрашенные по Гимзе (ув. 1000); справа - ядра аналогичных клеток, окрашенные реактивом Шиффа по Фельгену; А, Б, В, Г - лимфобласты, Д, Е - пролимфоциты, Ж, З - лимфоциты, И, К - оксифильные эритробласты периферической крови. 28 Изменение количества (в %) разных видов клеток периферической крови в норме и в различные сроки после заражения свиней вирусом АЧС Виды клеток Сроки после начала инфекции (периферическая т с ь) в о кро контроль 3-и 4-е 5-е 6-е 7-е Лимфобласты 0 3,0 ± 1,1 3,5 ± 0,9 2,0 ± 0,5 9,0 ± 4,1 10,0 ± 4,0 Малые лимфоциты 45,0 ± 1,7 27,0 ± 1,8 31,0 ± 2,2 22,0 ± 1,8 19,0 ± 2,6* 11,0 ± 2,0* Средние лимфоциты 18,0 ± 2,2 14,0 ± 1,0 15,0 ± 2,8 14,0 ± 1,9 14,0 ± 1,3 5,0 ± 1,5* Крупные лимфоциты 4,0 ± 0,6 7,0 ± 1,4 6,0 ± 1,2 6,0 ± 1,0 7,0 ± 1,3 2,0 ± 0,7 Моноциты 6,0 ± 0,5 8,0 ± 0,7 7,0 ± 0,7 7,0 ± 0,8 7,0 ± 1,3 3,0 ± 1,2 Эозинофилы 5,0 ± 0,9 2,0 ± 0,2 2,0 ± 0,1 2,0 ± 0,4 3,0 ± 0,9 0,5 ± 0,3* Базофильные гранулоциты 2,0 ± 0,6 1,0 ± 0,2 1,0 ± 0,1 1,0 ± 0,4 1,0 ± 0,6 0,25 ± 0,3 Нейтрофилы палочкоядерные 6,0 ± 0,8 13,0 ± 1,8** 5,0 ± 0,5 8,0 ± 1,9 4,0 ± 1,5* 1,0 ± 1,0* Нейтрофилы сегментоядерные 13,0 ± 1,6 7,0 ± 1,0* 2,0 ± 0,6* 2,0 ± 0,4* 2,0 ± 0,7* 0,25 ± 0,3* Эритробласты 0 6,0 ± 1,1** 13,0 ± 2,2** 13,0 ± 2,0** 8,0 ± 1,2** 3,0 ± 1,0** Атипичные лимфоциты 0 4,0 ± 1,0** 2,5 ± 0,8** 6,0 ± 1,2** 5,0 ± 1,2** 5,0 ± 1,5** Разрушенные клетки 0 8,0 ± 2,0** 12,0 ± 3,7** 17,0 ± 3,1** 21,0 ± 4,5** 59,0 ± 5,6** Некроз 0 5,0 ± 0,8** 5,0 ± 1,1** 8,0 ± 1,5** 10,0 ± 2,1** 37,0 ± 3,8** Апоптоз 0 3,0 ± 0,6** 7,0 ± 1,9** 9,0 ± 1,8** 11,0 ± 2,3** 22,0 ± 2,0** Примечание. * - достоверно ниже по сравнению с контролем (p < 0,05-p < 0,01); ** - достоверно выше по сравнению с контролем (p < 0,05-p < 0,01). периферической крови зараженных свиней, то количество палочкоядерных нейтрофилов на 3-и сутки болезни достоверно увеличивалось (p < 0,001), затем на 5-е сутки резко и достоверно уменьшалось, приближаясь к количеству палочкоядерных нейтрофилов в контроле, и держалось на этом уровне вплоть до 6-х суток, недостоверно отличаясь от количества палочкоядерных нейтрофилов в периферической крови здоровых свиней, а затем на 7-е сутки достоверно уменьшалось. Количество эозинофильных и базофильных грану-лоцитов, постоянно и неуклонно уменьшаясь, к 7-м суткам оказывалось достоверно ниже, чем в контроле. Процент моноцитов крови недостоверно снижался лишь на 7-е сутки (p < 0,01). Известно, что в норме в периферической крови половозрелых млекопитающих подавляющее количество клеток красной крови составляют эритроциты с небольшой долей поли- и оксифильных ретикулоцитов. При АЧС уже на 3-и сутки заболевания в периферической крови обнаруживали около 6% эритробластов, количество которых удваивалось к 4-м суткам, сохраняясь на 5-е сутки, но уже на 6-е сутки уменьшалось, а к 7-м суткам составляло 3% популяции. Важно отметить, что уже на 3-и сутки заболевания отмечена гибель всех видов исследованных клеток вследствие как некроза, так и апоп-тоза. При этом на протяжении всего исследования вплоть до 6-х суток включительно клетки гибли примерно одинаково обоими путями, на 7-е сутки гибель клеток вследствие некроза достоверно превосходила их гибель вследствие апоптоза. Более 20% всех клеток гибло от апоптоза. Таким образом, можно считать, что при действии вируса чумы свиней в первую очередь поражаются лимфоциты и нейтрофилы. Для действия вируса характерно также появление в значительном количество атипичных лимфобластов и лимфоцитов, у большинства из них обнаружены дополнительные ядра, образование которых происходит в результате фрагментации ядра или дополнительного синтеза ДНК. Обсуждение Полученные нами данные демонстрируют сдвиг лейкоформулы влево. Уже с 3-х суток появляются лимфобласты, а также большое количество малосег-ментированных палочкоядерных нейтрофилов. Для острых форм АЧС характерны лимфопения, нейтро-филия [5]. Подобные изменения начинаются примерно на 2—4-е сутки от начала заболевания [15]. Это совпадает с полученными нами данными, свидетельствующими о выраженной лейкопении уже с 3-х суток, когда среднее количество лимфоцитов уменьшалось на 30%, а к моменту гибели животных - примерно на 75%. Молекулярные механизмы столь выраженного и быстро развивающегося патогенеза не совсем ясны, однако высокий процент гибнущих клеток отмечали уже на 3-и сутки. Постоянно нарастая, этот показатель к моменту гибели животных достигал более 65% популяции. Важно отметить, что достоверное количество разрушенных лимфоцитов погибает вследствие апоптоза [9, 11]. Патогенез иммунокомпетентных клеток при АЧС в целом хорошо описан. Так, возникновение лимфо-пении при АЧС сравнимо с начальной стадией некоторых форм инфекционно-токсического процесса и связано с миграцией лимфоидных клеток из сосудов в ткани к очагам воспаления. Несомненно, лимфо-пения связана также с разрушением некоторой части лимфоидных клеток вследствие репликации вируса [9]. Нейтрофилия с выраженным сдвигом влево характерна для обширного воспаления, являющегося основной патологией при острой форме АЧС. Однако все эти проявления относятся к неспецифическим изменениям в составе крови. Более важным представляется регулярное обнаружение атипичных форм лимфоцитов и лимфобластов (рис. 2), начиная с 3-х суток заболевания, что характерно для ряда вирусных инфекций [14]. Наиболее известны атипичные формы лимфоцитов при различных герпесвирусных инфекциях, прежде всего при инфекционном моно- 29 нуклеозе. Необходимо отметить, что в атипичных лимфоцитах часто встречаются дополнительные ядра, образующиеся как в результате фрагментации ядер, так и, возможно, в результате синтеза ДНК и/или РНК [6, 11]. Часто именно синтез ДНК приводит к альтерациям клеточного ядра, что является одной из наиболее характерных черт атипичных лимфоцитов [14]. Другая особенность АЧС - относительно малоинформативные показатели клеточного состава периферической крови в течение первых 2 сут с момента инфицирования, когда полученные данные практически не отличались от контрольных. Интересным представляется также обнаружение нами эритробластов в периферической крови уже на 3-и сутки заболевания. Пик их численности приходится на 4-5-е сутки. Эритробласты появляются в периферической крови млекопитающих при ряде заболеваний, в том числе при гемолитических анемиях [1, 2], что обусловлено гемолизом большого количества эритроцитов, в результате чего увеличивается скорость их образования. При АЧС гемолиз эритроцитов, вероятно, связан с ассоциацией вируса с последними и выявленный нами эри-тробластоз я

References

Supplementary files