Ingavirin treatment of experimental parainfluenza pneumonia in Syrian hamsters

Full Text

Респираторные вирусные инфекции человека занимают ведущее место в инфекционной патологии, несмотря на очевидные успехи в области вакцинации, химиопрофилактики и химиотерапии. Значительную долю респираторных инфекций, помимо гриппа, составляют заболевания, вызванные вирусами других семейств - корона-, адено- и парамиксовирусами (респираторно-синцитиальный вирус и вирус парагриппа), а также метапневмовирусами и бокавируса-ми, роль которых в развитии поражений респираторного тракта определена недавно [14]. Выделяют 4 серотипа, вирусов парагриппа, вызывающих поражения верхних дыхательных путей у лиц всех возрастных групп, при этом наибольшая тяжесть заболевания отмечается у детей в возрасте от 6 мес до 3 лет [12]. Обычно подъем заболеваемости приходится на октябрь-декабрь. Нозологические формы парагриппозной инфекции со стороны респираторного тракта включают ларинготрахеобронхиты, бронхиолиты и пневмонии. Иногда вирусы парагриппа обусловливают развитие острого респираторного дистресс-синдрома, миокардита, цистического фиброза, гепатита и ряда неврологических заболеваний, таких как рассеянный склероз и подострый склерози-рующий панэнцефалит [12]. Контактная информация: Зарубаев Владимир Викторович, канд. биол. наук, зав. лаб.; e-mail:zarubaev@influenza.spb.ru Выбор препаратов для лечения парагриппозной инфекции весьма скуден. В то же время разработка эти-отропных препаратов, как специфических в отношении вируса парагриппа, так и обладающих широким спектром противовирусной активности, является актуальной задачей как медицинской науки, так и практического здравоохранения, особенно с учетом той опасности, которую представляют эти вирусы для пациентов с иммунодефицитами - реципиентов костного мозга и донорских органов, ВИЧ-инфицированных, пациентов, проходящих курс химио- и лучевой терапии при лечении онкологических заболеваний и т. п. Основным противовирусным средством сегодня является рибавирин, активный в отношении многих РНК-геномных вирусов человека. Рибавирин, представляющий собой аналог нуклео-зидов, несмотря на низкую токсичность в опытах in vitro, приводит к анемии и угнетению кроветворения [10]. Препараты интерферона и его индукторы эффективны исключительно при профилактическом применении и не могут считаться основным средством терапии при тяжелых случаях инфекции. Более того, вирусы парагриппа способны подавлять интерферо-ниндуцированную передачу сигнала, приводящую к развитию противовирусного ответа [15], поэтому они устойчивы к действию интерферона и его индукторов. В то же время сочетанная иммуностимуляция и коррекция воспалительных процессов препаратами стероидов эффективны на модели парагриппозной инфекции у животных [13]. Таким образом, проблема поиска и разработки новых эффективных и безопасных противовирусных препаратов широкого спектра действия по-прежнему является весьма актуальной. Ранее была изучена активность препарата Ингавирин® (2-(имидазол-4-ил)этанамид пентандиовой-1,5 кислоты) в отношении вируса гриппа. Ингавирин® является низкомолекулярным аналогом эндогенного пептидоамина, выделенного из морского моллюска Aplysia californica. В опытах как in vitro [6], так и in vivo на модели гриппозной инфекции [5] было показано, что препарат способен ограничивать репликацию вируса в культуре клеток, а также обладает высокой протективной активностью при экспериментальном гриппе у мышей [1]. Кроме того, в опытах in vitro и in vivo была показана эффективность Ингавирина® в отношении аденовируса человека [3, 4, 7], а также вируса парагриппа в культуре клеток [2]. В качестве продолжения ранее проведенных экспериментов мы определили цель настоящего исследования - оценка противовирусных свойств Ингавирина® в отношении вируса парагриппа на модели вирусной пневмонии у животных. Материалы и методы Препараты. В работе использовали препарат Ингавирин® производства ОАО «ВалентаФарм». Аликвоты препарата разводили в среде Игла МЕМ для клеточных культур (“БиолоТ”, Санкт-Петербург, кат.# 1.3.3). Из полученного раствора были приготовлены необходимые разведения на среде МЕМ для экспериментов на животных. В качестве референс-препарата использовали риба-вирин (виразол, “ICN Pharmaceuticals”, США). Исследуемые препараты вводили животным перорально через желудочный зонд в объеме 0,2 мл по лечебной схеме (1 раз в сутки в течение 3 или 5 дней начиная с 1-х суток после инфицирования животных). Исходя из ранее полученных результатов [1], использовали следующие дозы препаратов: Ингави-рин® - 30, 30/15 и 45 мг/кг (при дозировке 30/15 мг/ кг животные получали 2 порции препарата из расчета 30 мг/кг, затем - 3 порции из расчета 15 мг/кг), рибавирин - 50 мг/кг. В качестве плацебо животным контрольной группы вводили физиологический фосфатный буфер. В качестве отрицательного контроля использовали интактных животных, которые содержались в тех же условиях, что и опытные группы. Вирусы. В работе был использован вирус парагриппа человека типа 3 (штамм HA1) из коллекции вирусных штаммов НИИ гриппа РАМН. Вирус пассировали в клетках Hep-2 при 36oC в атмосфере 5% CO2. Животные. Новорожденных сирийских хомяков, полученных от половозрелых родителей, содержали на стандартном рационе в регламентированных условиях вивария НИИ гриппа РАМН до достижения ими массы тела 60-80 г. Подбор животных в группы опыта проводили методом случайной выборки. Экспериментальная парагриппозная инфекция. Вирус вводили животным интраназально под легким эфирным наркозом в объеме 50 мкл в дозе 104 ТЦИД50. В каждую группу наблюдения включали 10-14 хомяков. На 3-и и 7-е сутки после заражения животных из каждой группы умерщвляли, вскрывали и изолировали легкие. Органы, полученные на 3-и сутки, использовали для выделения вируса (замораживали и хранили при -20oC до постановки соответствующих экспериментов), полученные на 7-е сутки - фиксировали 10% забуференным формалином и использовали для гистологического анализа (см. ниже). Титрование вируса в легочной ткани. Для определения инфекционного титра вируса парагриппа в органах животных легкие, извлеченные на 3-и сутки после инфицирования, гомогенизировали в 10-кратном объеме стерильного физиологического фосфатного буфера и готовили из гомогенатов серию 10-кратных разведений на том же буфере. При определении титра вируса использовали культуру клеток МА-104, выращенных на 96-луночных панелях на среде МЕМ. Клетки заражали серийными 10-кратными разведениями гомогенатов от 10-1 до 10-5 и инкубировали в термостате в течение 72 ч. По окончании срока инкубации клетки промывали 2 раза нейтральным фосфатным буфером, фиксировали в течение 10 мин при 4oC 80% ацетоном, промывали 5 мин дистиллированной водой и высушивали на воздухе. Первичные типоспецифические антитела против вируса парагриппа типа 3 (ООО “ППДП”, Санкт-Петербург) растворяли в фосфатном буфере с добавлением 5% обезжиренного сухого молока (для блокирования сайтов неспецифического связывания антител с белковыми детерминантами) до концентрации 5 мкг/мл и инкубировали с фиксированными клетками в течение 1 ч при 37oC (0,1 мл на лунку). Клетки промывали 3 раза по 0,1 мл на лунку фосфатного буфера и инкубировали с раствором антимышиного иммуноглобулина, меченного пероксидазой (“Sigma”, Cat.# A2304), в разведении 1:10 000 (0,1 мл на лунку) в течение 1 ч при 37oC. Несвязавшиеся антитела отмывали 3 раза по 0,1 мл на лунку фосфатного буфера и проводили цветную реакцию с раствором 3,3,5,5-тетраметилбензидина с добавлением 0,03% перекиси водорода в ацетатном буфере при рН 5,0 (0,1 мл на лунку). Реакцию останавливали 2N серной кислотой (0,1 мл на лунку) и измеряли оптическую плотность в ячейках при длине волны 450 нм на микропланшет-ном ридере Victor 1420 (“Wallac”, Финляндия). Реакцию считали положительной, если оптическая плотность в ячейках в 2 раза и более превышала фоновые значения для интактных клеток (такую дозу вируса принимали за 50% экспериментальную инфекционную дозу, ЭИД50). За титр вируса принимали величину, противоположную десятичному логарифму наибольшего разведения вируса, способного вызвать положительную реакцию в лунке, и выражали в логарифмах 50% ЭИД (lg ЭИД50). О вирусингибирующем действии соединений судили по снижению титра вируса в присутствии препаратов по сравнению с соответствующими контрольными лунками без препаратов. Гистологический анализ. Для морфологического исследования органы фиксировали 10% формалином на фосфатном буфере, отмывали в проточной воде в Препарат p (КВ) 3,0 - 0,018 0,016 0,001 1,000 Рибавирин Ингавирин 30 Ингавирин 30/15 Рис. 2. Проводящие и респираторные отделы легких интактных сирийских хомяков. Окраска гематоксилином и эозином. х240. течение ночи, дегидратировали в этаноле нарастающей концентрации, проводили через хлороформ, заливали в парафин и готовили из полученных блоков срезы толщиной 4 мкм. Срезы освобождали от парафина ксилолом, регидратировали в этаноле убывающей концентрации, окрашивали гематоксилином и эозином, дифференцировали в подкисленном спирте, окончательно обезвоживали в спиртах нарастающей концентрации, проводили через 2 смены ксилола и заключали в бальзам. Полученные препараты исследовали под световым микроскопом Leica DM1000. Качественно оценивали интенсивность и клеточный состав воспалительного инфильтрата в очагах пневмонии, а также степень дегенеративных и пролифера-тивных процессов в ткани легких. Проявления бронхиолита и отека легких в стадии острой гриппозной инфекции оценивали полуколиче-ственно при ув. 20 х объектива по следующим критериям: 0 - клетки занимают от 0 до 25% поля зрения (что характерно для структуры интактных легких), 1 - 25-50% (умеренный отек), 2 - 50-75% (выраженный отек), 3 - 75-100% (тотальный отек легких). В каждой группе опыта просматривали по 10-20 полей зрения. Статистическая обработка данных. Статистическую обработку результатов (расчет средних значений и стандартных отклонений) проводили при помощи программы Microsoft Excel. Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента. Значимыми считали различия между группами, если значение р не превышало 0,05. Результаты и обсуждение Влияние Ингавирина® на репродукцию вируса парагриппа в респираторном тракте животных. В ходе опыта по определению протекторной активности Ингавирина® у животных не была отмечена неспецифическая смертность в контрольной группе ин-тактных животных. На первом этапе исследования изучали влияние Ингавирина® на репликативную активность вируса парагриппа типа 3 в ткани легких инфицированных животных. С этой целью из легких животных на 3-и сутки после заражения были приготовлены го-могенаты, в которых затем определяли инфекционный титр вируса в культуре клеток. Данные об уровне репликации модельного вируса парагриппа в организме животных приведены в табл. 1 и на рис. 1. Как видно из приведенных результатов, модельный вирус размножался в легочной ткани животных до титров 3,8 lg ЭИД/20 мг Ингавирин, 30 мг/кг 3,2 ± 0,2 Ингавирин 30/15 мг/кг 2,7 ± 0,3 Рибавирин 50 мг/кг 2,3 ± 0,3 Контроль вируса 3,8 ± 0,2 Инфекционный титр вируса, lg ЭИД50/20 мг ткани Инфекционная активность вируса парагриппа типа 3 в ткани легких сирийских хомяков на 3-и сутки после инфицирования в условиях применения химиопрепаратов Рис. 1. Инфекционная активность вируса парагриппа типа 3 в ткани легких сирийских хомяков на 3-и сутки после инфицирования в условиях применения химиопрепаратов (в мг/кг). ткани. Как Ингавирин®, так и препарат сравнения рибавирин достоверно снижали инфекционные титры вируса в ткани легких. Наибольшую активность Ингавирин® проявил в дозах 30/15 мг/кг, при этом его активность была сопоставима с активностью ри-бавирина. Влияние Ингавирина® на морфогенез экспериментальной парагриппозной инфекции у сирийских хомяков. На следующем этапе исследований были изучены особенности морфогенеза парагриппозной инфекции в организме животных в условиях применения Инга-вирина®. В легких интактных животных не обнаружены макроскопические признаки воспаления. Крупные бронхи были выстланы однослойным эпителием, клетки его выглядели интактными - в них отсутствовали признаки вакуолизации, конденсации или фрагментации ядер, а также внутриядерные или цитоплазматические включения. В просветах бронхов не отмечали экссудат и клеточный детрит, характерные для деструктивных процессов в ткани. Респираторные отделы выглядели воздушными, альвеолярные стенки не были утолщены, из клеток инфильтрата в легочной паренхиме обнаружены отдельные альвеолярные мап-^-1 Контроль вируса 9 ш О) <0 о >. о. 5 Ш Q. I- 5 2,0 9 3,5 - 2,5 s*j Рис. 3. Парагриппозная пневмония в легких сирийских хомяков на 7-е сутки после инфицирования без применения химиопрепаратов. а - общий вид легочной ткани. Утолщение и отек межальвеолярных перегородок, интенсивная воспалительная инфильтрация стромы легких, клеточный детрит в просвете бронха; б - сосочковые разрастания бронхиального эпителия, клеточный детрит и воспалительный инфильтрат в просвете бронха, перибронхиальная воспалительная круглоклеточная инфильтрация; в - очаг парагриппозной пневмонии в респираторных отделах легкого. Окраска гематоксилином и эозином; х240 (а), х400 (б, в). крофаги. Признаки серозного или геморрагического экссудата в альвеолярных полостях не обнаружены (рис. 2). У зараженных животных, не получавших лечения, морфологические изменения легочной ткани на 7-е сутки после инфицирования проявлялись поражениями в виде интерстициального отека и утолщения межальвеолярных перегородок (рис. 3, а). В бронхах отмечались типичные для парагриппозной инфекции сосочковые разрастания бронхиального эпителия, слабо выраженная деструкция эпителиальных клеток, в просветах обнаруживались скопления клеточного детрита (рис. 3, а, б). В респираторных отделах легких присутствовали многочисленные очаги пневмонии из инфицированных клеток и окружающих их клеток воспалительного инфильтрата, продуктов деградации клеток и полиморфно-ядерных лейкоцитов (рис. 3, в). Перечисленные явления типичны для интенсивно протекающей вирусной пневмонии, и степень их выраженности может служить критерием оценки тяжести процесса. Использование как Ингавирина®, так и препарата сравнения рибавирина приводило к ослаблению всех вирусиндуцированных процессов. Так, легкие животных, получавших Ингавирин®, выглядели воздушными, межальвеолярные перегородки были тонкими или умеренно отечными (рис. 4, а, см. 3-ю полосу обложки). Очаги пневмонии в респираторных отделах встречались редко и имели минимальный размер (рис. 4, в). Бронхиальный эпителий выглядел интактным, очаги вирусиндуцированной избыточной пролиферации эпителиоцитов, формирующие типичные сосочковые разрастания, встречались реже и были выражены слабее по сравнению с контролем (рис. 4, б). Клеточный детрит в просвете бронхов отсутствовал, перибронхиальная воспалительная инфильтрация была выражена слабо. Применение рибавирина приводило к сходной нормализации структуры ткани легких, снижая проявления отека легочной стромы, воспалительной инфильтрации и патологической пролиферации бронхиального эпителия (рис. 5, а—в см. 3-ю полосу обложки). Для оценки активности изученных препаратов был проведен полуколичественный морфометрический анализ легочной ткани. Полученные данные суммированы в табл. 2. Как видно из представленных результатов, инфицирование животных вирусом парагриппа приводило к развитию отека легких средней интенсивности (2,1 балла). Применение Ингавирина® и рибавирина достоверно снижало этот показатель при всех изученных дозах. Наибольшую эффективность Ингавирин® проявлял при дозе 30/15 мг/кг, достигая при этом показателей активности, равных таковым для рибавири-на. Дополнительные данные о механизмах противовирусной активности Ингавирина® были получены в ходе изучения инфекционности вирусного потомства, сформированного в его присутствии. Для этого в от- Влияние химиопрепаратов на проявления альвеолита и отека легких при парагриппозной пневмонии у сирийских хомяков Степень отека легких, баллы Препарат p (КВ) Ингавирин 30 мг/кг Ингавирин 30/15 мг/кг Рибавирин 50 мг/кг Контроль вируса 1,43 ± 0,25 1.31 ± 0,21 1.32 ± 0,22 2,10 ± 0,2 0,049 0,013 0,016 Влияние Ингавирина® на инфекционную активность вируса парагриппа человека дельной серии опытов in vitro был определен титр вируса парагриппа, культивированного в среде с препаратом или без него. Данные о влиянии Ингавирина® на репликативную активность вирусного потомства суммированы в табл. 3. Как следует из полученных результатов, применение Ингавирина®, как и в случае гриппозной инфекции [5], приводило к снижению инфекционной активности вирусного потомства. Достоверная разница между значениями титров вируса в опыте и контроле достигалась при меньшей инфицирующей дозе вируса (1 ТЦИД50/0,2 мл). Таким образом, в опытах in vitro была подтверждена способность Ингавирина® снижать инфекционность вирусного потомства в случае парагриппозной инфекции. Несмотря на систематические сообщения об ингибирующей активности синтетических и природных соединений самых разных групп [8, 9], в отношении вируса парагриппа, на сегодняшний день не существует официально рекомендованное эффективное и безопасное средство для лечения этой инфекции. Противовирусная активность была продемонстрирована для аналогов нуклеозидов, антиоксидантов, ингибиторов слияния мембран, в том числе аналогов си-аловой кислоты, ингибирующих вирусную нейрами-нидазу, и др. [9]. В настоящее время ни одно из этих соединений не проходит клинические испытания и не разрешено для лечения парагриппа [15]. В данном исследовании проведено доклиническое изучение активности Ингавирина® на модели экспериментальной парагриппозной пневмонии у сирийских хомяков. Следует отметить, что характеристики использованной модели вирусной инфекции, в том числе уровень репликации вируса в легких, в целом хорошо соотносятся с параметрами, описанными ранее [11]. Исключение составила инфицирующая доза вируса (106,5 ТЦИД50 в ранее описанных опытах и 104 ТЦИД50 в нашем случае), что может объясняться особенностями использованных вирусов и разной адаптацией их к животным. В ходе опытов Таблица 3 Доза вируса, Инфекционный титр вирусного потомства при концентрации Ингавирина, мкг/мл ТЦИД50/0,2 мл 10 1 0(контроль вируса) 10 5,0 ± 0,2 6,0 ± 0,0 5,8 ± 0,3 1 3,8 ± 0,1 5,7 ± 0,1 5,0 ± 0,2 Примечание. Жирным шрифтом выделены значения, отличающиеся от контрольных при p < 0,05. показано, что Ингавирин® приводит к ограничению инфекционного процесса в ткани легких животных. Это ограничение проявлялось снижением инфекционного титра вируса парагриппа в легочной ткани, степени отека легких и клеточной инфильтрации ткани, а также уменьшением вирусспецифическо-го поражения клеток бронхиального эпителия. Как и в случае гриппозной пневмонии, эффект Ингави-рина®, по-видимому, обусловлен сочетанием его противовирусного, противовоспалительного и цито-протекторного действия, что является несомненным достоинством этого препарата. Полученные данные позволяют рассматривать Инга-вирин® как перспективный противовирусный препарат, активный в отношении парагриппозной инфекции.

References

Supplementary files