Hepatitis C Virus: Therapeutic Targets and New Drugs

Abstract

The viral and patient factors affecting the efficacy of therapy were discussed. The modern data on the molecular mechanism of action of main drugs for hepatitis c therapy were presented. New antiviral drugs (protease inhibitors) and pharmacological substances under development targeted against viral polymerase and protein NS5A were considered.

Full Text

Вирус гепатита С (ВГС) - представитель семейства Flaviviridae рода Hepacivirus [40]. Это сферический оболочечный вирус размером около 55 нм [17, 35, 50]. Под оболочкой вируса находится нуклеокап-сид, диаметром около 45 нм, в который упакован геном ВГС - одноцепочечная линейная РНК. Вирусная РНК имеет положительную полярность и содержит около 9600 нуклеотидных остатков. В ней выявлена одна открытая рамка считывания, ограниченная с 5'-и 3'-концов нетранслируемыми областями (см. рисунок). Геном кодирует крупный белок-предшественник полипротеин, из которого с участием клеточных и вирусных ферментов образуются все 10 полипептидов ВГС. Структурные белки вируса, формирующие вири-он, представлены нуклеокапсидным (core) протеином и двумя оболочечными гликопротеинами (Е1 и Е2). К неструктурным полипептидам ВГС, которые участвуют в процессах репликации, трансляции и инициации сборки вируса, относятся: виропорин (р7), Ш2-протеаза, сериновая протеаза-хеликаза (NS3), кофактор сериновой протеазы (NS4А), компоненты репликативного комплекса (NS4B и №5А) и РНК-зависимая РНК-полимераза (NS5B). Для ВГС характерна генетическая неоднородность (полиморфизм), из-за которой вирус классифицируют по генетическим параметрам на 6 генотипов и около 80 подтипов (или субтипов) [45]. Помимо этого в каждом инфицированном пациенте вирус представлен набором близкородственных генетических вариантов. ВГС - этиологический агент распространенного инфекционного заболевания, гепатита С, называемого ранее гепатитом ни А, ни В с парентеральной передачей. Острый гепатит С в 70-85% случаев переходит в хроническую форму, которая при естественном течении неуклонно прогрессирует, приводя к развитию фиброза, у 30% больных к циррозу печени и почти у 5% пациентов - к гепатоцеллюлярной карциноме [24]. В нашей стране с 2001 г. отмечается тенденция к снижению заболеваемости острым гепатитом С. Однако сохраняются высокими показатели регистрации случаев впервые выявленного хронического гепатита С (ХГС). Прогнозируется неблагоприятная эпидемиологическая ситуации по вирусному гепатиту С до 2020-х годов [1]. Терапия гепатита С базируется на комбинации препаратов пегилированного интерферона-a2a или интерферона-а2Ь и рибавирина (пегИФН/Р). У пациентов, инфицированных вирусом генотипа 1, такая терапия позволяет достичь устойчивого вирусологического ответа (УВО) почти в 50% случаев, у хронически инфицированных ВГС генотипа 2 или 3 -почти в 80% [20, 42]. Однако у 15-25% пациентов после терапии пегИФН/Р наблюдается рецидив. Поскольку главное место в оценке эффективности терапии отводится обнаружению РНК ВГС в крови, этот тест должен обладать высокой чувствительностью, не менее 10-15 МЕ/мл [13]. Если лечение начато в острой фазе инфекции, то вероятность достичь УВО существенно выше - до 90%. Неудача при противовирусной терапии (ПВТ) связана как с ВГС, так и с организмом самого пациента. К вирусным факторам относят генотип, набор вариантов вируса, вирусную нагрузку, кинетику снижения РНК ВГС при терапии; к факторам пациента - возраст, пол, длительность заболевания, стадию фиброза, сопутствующие заболевания, этническую принадлежность и генетический полиморфизм генов. Терапия пегИФН и рибавирином В современной ПВТ гепатита С используют конъюгированный с полиэтиленгликолем (пегилированный) ИФН-а в комбинации с рибавирином. ИФН-а - это цитокин, компонент врожденной иммунной системы человека. После подкожного введения больному молекула ИФН-а постепенно высвобождается из комплекса с полиэтиленгликолем и связывается специфически со своим рецептором IFNAR, который присутствует на поверхности гепатоцитов и ряда других клетках. Процесс связывания завершается передачей сигнала на два ассоциированных с рецептором внутриклеточных белка - тирозиновые киназы Jak1 и Tyk2. Они фосфорилируются и активируют компоненты передачи сигнала и активации транскрипции, называемые STAT1 и STAT2, входящие в сигнальный путь Jak-STAT. Активированные STAT1 и STAT2 переносятся в ядро, где специфически связываются с промоторными элементами почти сотни ИФН-стимулируемых генов. Продукты этих генов оказывают антивирусное, иммуномодулирующее и антипролиферативное действие. Они влияют на апоптоз инфицированной клетки, метаболизм липидов, синтез и деградацию белков и реакцию клетки на чужеродные молекулы. Наиболее известные белки, кодируемые ИФН-стимулируемыми генами, - это 2'-5' олигоаденилатсинтетаза (2'-5'ОАS), протеинкиназа R (PKR), активируемая двуцепочечной РНК, и Мх-белки [12]. ИФН-а действует как на инфицированные клетки, так и на иммунную систему в целом: регулирует экспрессию МНС класса II и привлечение иммунных клеток, стимулирует секрецию цитокинов и деление иммунных клеток. Как показано в экспериментах in vivo, рибавирин (нуклеозидный аналог) функционирует как легкий ингибитор репликации ВГС, но он эффективно предотвращает рецидив после терапии пегИФН/Р [13, 37]. Дискуссии о молекулярном механизме действия рибавирина продолжаются. Выдвинуто несколько гипотез: участие в усилении ответа Т-хелперов 1-го типа, в ингибировании инозитолмонофосфатдегидро-геназы (что приводит к снижению в клетке пула гуа-нозинтрифосфатов и дезоксигуанозинтрифосфатов), прямое ингибирование активности РНК-зависимой РНК-полимеразы и усиление внутриклеточных эффектов ИФН-а [23]. Вероятно, скоро вместо рибавирина будет использоваться другой препарат (tagybavi-rin), который дает минимальные побочные эффекты. Факторы ВГС, влияющие на эффективность лечения Важный вирусный фактор, влияющий на эффективность пегИФН/Р, - генотип ВГС. Лечение завершается безуспешно почти у 50% пациентов, инфицированных ВГС генотипа 1 или 4, и у 20% больных, инфицированных вирусом генотипа 2 или 3 [20, 42]. Для пациентов, инфицированных вирусом генотипа 1 или 4, снижение вирусной РНК в процессе лечения наступает позже, чем в случае вирусов генотипа 2 или 3. Причины этого еще не установлены. Еще один вирусный компонент, влияющий на эффективность ПВТ, - отдельные вирусные белки, точнее их участки, где возможны неблагоприятные мутации. Такие мутации выявлены в белках NS5A, Е2, NS3 и нуклеокапсидном протеине. Как впервые установили N. Enomoto и соавт. [14], мутации в участке ISDR (регион, определяющий чувствительность к ИФН, расположен в белке NS5A), предсказывают исход терапии у пациентов из Японии и Азии. Однако у пациентов из Европы и Америки такая зависимость не наблюдается [9, 25, 51]. Еще одна более протяженная зона, частично перекрывающаяся с участком ISDR, в белке NS5A может блокировать действие ИФН-а. Это участок PKR-BD, который способен связывать ИФН-индуцируемую и РНК-активируемую PKR, нарушая тем самым существенный компонент антивирусной защиты [33]. Мутации в этой зоне достоверно чаще обнаруживают у пациентов с УВО. Относительно роли еще одного участка этого же белка, петли V3, однозначное мнение отсутствует [33, 51]. Две мутации в зоне нуклеокапсидного белка, которые приводят к замене в 70-й и 91-й аминокислотных позициях этого протеина, влияют на эффективность терапии пегИФН/Р у японских больных ХГС, инфицированных вирусом субтипа 1b [2, 3]. Для европейских пациентов более значима мутация в 70 позиции нуклеокапсидного белка. Остаток аргинина в этом положении достоверно чаще выявляли у пациентов с УВО, и у них наблюдалось более быстрое снижение РНК ВГС в первые 8 нед лечения [4]. В СООН-концевой части белка Е2 расположен участок, называемый PePHD, гомологичный по структуре фрагменту киназы PKR, индуцированной ИФН, и рибосомальному фактору eIF2a. Из-за этого сходства нарушается фосфорилирование киназы и останавливается антивирусный эффект, проявляющийся на уровне регуляции активности рибосом [48]. Однако относительно влияния мутаций в этом регионе на эффективность терапии до сих продолжаются дискуссии [7, 48]. Возможно, еще в одном белке NS3 существуют мутации, влияющие на эффективность терапии пегИФН/Р на уровне регуляции компонента STAT1 [36, но этот аспект недостаточно изучен. Молекулярно-генетические факторы пациента, влияющие на результат терапии Среди наиболее значимых генетических факторов пациентов, влияющих на эффективность терапии, следует отметить полиморфизм гена интерферон-Х3 (ИФН-Х3). В 2009 г. три независимые группы исследователей, проводя полногеномные сравнения по многочисленным группам пациентов, достигших или не достигших УВО, показали, что однонуклеотидный полиморфизм (ОНП) около гена !Ь-28В ассоциирован с высокой вероятностью успеха терапии [18, 46, 47]. Ген !Ь-28В кодирует недавно открытый ИФН-Х3, аллельные варианты влияют и на вероятность самопроизвольной элиминации ВГС в острой фазе инфекции [49]. Выявлено 4 ОНП около гена IL-28B, но лишь для трех показана достоверная взаимосвязь с эффективностью ПВТ. Пока как предикторы чаще изучаются 2 ОНП в локусах rs12979860 и rs8099917 в разных этнических группах больных гепатитом С. Молекулярный механизм действия этих полиморфизмов на вероятность достижения УВО пациентами при ПВТ не установлен. Есть предположение, что эти ОНП около гена IL-28B влияют на продукцию мРНК ИФН-Х3 [46, 47]. Как все интерфероны, ИФН-Х3 оказывает антивирусный и иммуномодулирующий эффект. Хотя молекулярный механизм антивирусного действия ИФН-Х3 при ВГС-инфекции еще не установлен, этот интерферон удачно дополняет и, возможно, усиливает антивирусные эффекты ИНФ-а. Если у пациента выявлены аллельные вариант С/С в локусе rs12979860 и вариант Т/Т в локусе rs8099917 по полиморфизму гена ^-28В, вероятность достичь УВО высока (7090%) [18, 46, 47]. Как установлено недавно, дисбаланс в экспрессии генов в гепатоцитах может быть связан с эффективностью ПВТ [43]. Было обнаружено, что еще до начала терапии уровень экспрессии некоторых ИФН-стимулируемых генов был повышен только у пациентов, у которых ПВТ закончилась безуспешно. Удалось идентифицировать 2 гена IFI27 и CXLC9, экспрессия которых в гепатоцитах с большой вероятностью (около 100%) предсказывают неуспех ПВТ и с меньшей вероятностью достижение УВО (70%) [5]. Аналогичные данные были получены при анализе мРНК в мо-нонуклеарных клетках периферической крови и макрофагах печени [32]. Отсутствие мРНК белка МхА в макрофагах печени является с высокой вероятностью (до 98%) предиктором невозможности достичь УВО. В экспрессии генов еще одной группы биологически важных веществ - хемокинов обнаружены различия у пациентов, достигших и не достигших УВО. Хемокины являются пептидными регуляторами процесса воспаления [10, 26]. Установлено, что у больных, которые не могут достичь УВО, повышен уровень мРНК хемокина СХ^10, называемого также IP-10 (ИФН-у-индуцируемый белок 10). При этом в крови присутствует укороченный вариант IP-10, который функционирует как антагонист полноразмерной формы хемокина и не может обеспечить привлечение Т-лимфоцитов в зону воспаления [11]. Это приводит к нарушению Т-клеточного звена, выполняющего важную роль в ограничении вирусной инфекции в печени. Недавно выявлена взаимосвязь между отдельными аллельными формами гена IL-28B и содержанием IP-10 [28]. Повышенное содержание в крови хемокина IP-10 достоверно чаще выявлялось у пациентов с неблагоприятными аллельными формами гена IL-28B. Ингибиторы протеазы как препараты направленного действия В 2011 г. стала возможной новая терапия для пациентов, инфицированных вирусом генотипа 1, предусматривающая сочетание трех препаратов -пегИФН, рибавирина и телапревира или боцепревира. Это принципиально новая схема лечения, поскольку в ней появляется ингибитор вирусной сериновой протеазы - ключевого ферменты нарезания почти всех неструктурных белков вируса. Результаты III фазы клинических испытаний этой тройной терапии, показали, что около 65-75% ранее не леченых пациентов и 40-50% больных, безуспешно завершивших терапию пегИФН/Р, могут достичь УВО благодаря новой терапии [38]. Разработка ингибиторов протеазы длилась долго - с 90-х годов прошлого века. Одним из первых препаратов, показавших эффективность применения ингибиторов протеазы, было вещество BILN 2061 (фирма- разработчик «Boehring-er Ingelheim»), которое снижало вирусную нагрузку в 100-1000 раз после 2 дней применения у пациентов, инфицированных ВГС генотипа 1 [22]. Однако препарат не прошел клинические испытания из-за выраженной кардиотоксичности. Телапревир (разработчик «Vertex/Tibotec») и боце-превир (разработчик «Merck») прошли клинические испытания в США, Канаде и Европе и разрешены к применению. В США и Канаде телапревил имеет другое торговое название Incivektm, в Европе -Incivotm. По структуре оба препарата представаляют собой ингибиторы-пептидомиметики, которые выполняют роль ложного субстрата для NSS-протеазы. Телапревир по строению молекулы напоминает линейный тетрапептид с активной кетоамидной группой, которая реагирует с каталитическим серином вирусной протеазы с формированием ковалентного комплекса. В процессе применения телапревира возможно накопление устойчивых мутантных вариантов вируса. Однако в большинстве случаев эти резистентные формы ВГС уже присутствуют до лечения как минорные варианты вирусной популяции, составляя 0,3-2% [6, 40]. Выявлены аминокислотные остатки протеазы, замены в которых влияют на чувствительность к ингибиторам (см. таблицу). Как установлено, резистентные к телапревиру варианты ВГС имеют низкую скорость репликации и сохраняют чувствительность к пегИФН и рибавирину. Поэтому тройная терапия позволяет достичь УВО у 31-84% больных, в зависимости от того, как был завершен предыдущий курс лечения пегИФН/Р: без УВО либо с частичным ответом или с рецидивом [38]. Большинством пациентов телапревир хорошо переносится, но возможны побочные проявления в виде зуда, диареи, сыпи и анемии. Чаще всего отмечается кожный зуд. Боцепревир-кетоамидный пептидомиметик, который связывается обратимо с активным центром протеазы. У резистентных вариантов ВГС обнаружены замены по отдельным аминокислотным остаткам, что представлено в таблице [27]. Наиболее значимые побочные эффекты - это анемия и нарушения вкуса. В стадии изучения находятся следующие перспективные препараты: данопревир («Intermune», «Roche») и препарат ТМС435 («Medavir Incorporated»). Установлены аминокислотные остатки ^3-протеазы, которые приводят к нечувствительности к этим препаратам (см. таблицу). Разработка ингибиторов вирусной полимеразы Для ингибирования активности РНК-зависимой РНК-полимеразы ВГС создаются нуклеозидные (НА) и ненуклеозидные аналоги (ННА). Один из представителей НА - препарат RG7128, который является ци-тидиновым аналогом, напоминающим естественный субстрат полимеразы [19]. Он связывается с активным центром полимеразы и встраивается в растущую цепь РНК, приводя к терминации. Структура активного центра полимеразы ВГС консервативна, поэтому препарат эффективен для всех генотипов вируса. На фоне применения RG7128 редко образуются мутантные резистентные варианты. При тройной терапии пегИФН/Р и Аминокислотные замены в сериновой протеазе ВГС, обнаруженные у резистентных к терапии ингибиторами вариантов вирус Препарат Варианты и позиции аминокислотных остатков протеазы NS3, с которыми связана резистентность к ингибиторам [27] Телапревир A156V/T, V36M/A+R155K/T, V36M/A+A156V/T, V36M/A, T54A, R155K/T, A156S Боцепревир V36M, T54S, R155K, T54A, V55A, R155T, A156S, V158I, V170A, V36A, V36L, I170T Данопревир R155K ТМС435 80, 155, 156, 158 BI201335 155, 156, 168 препаратом RG7128 у 85% ранее не леченых пациентов с вирусом генотипа 1 достигался ранний вирусологический ответ [29]. Применение этого препарата в течение 4 нед одновременно с пегИФН/Р у больных, которые были инфицированы вирусом генотипа 2 или 3 и ранее завершили ПВТ безуспешно, показало возможность получить УВО в 63-67% случаев. Побочные эффекты от применения RG7128 умеренно выражены, клинические испытания препарата продолжаются. Недавно была продемонстрирована высокая эффективность совместного применения двух ингибиторов ВГС: для вирусной полимеразы RG7128 и для сериновой протеазы RG2772 [15]. В течение 2 нед терапии у ранее не леченых больных с вирусом генотипа 1 удалось снизить содержание РНК ВГС почти на 5 логарифмов. При увеличении длительности приема этих ингибиторов до 24 нед вирусная РНК не определялась у всех пациентов. Продолжаются исследования по разработке схем лечения больных ХГС только ингибиторами протеазы и полимеразы с учетом ОНП гена IL-28B. В стадии изучения находятся ННА к разным ал-лостерическим (влияющим на активность) участкам полимеразы. Применение такого типа ингибиторов чаще, чем в случае НА, приводит к формированию резистентных вариантов фермента. К 1-му участку полимеразы разработан ингибитор МК-3281 [8]. При 7-дневной монотерапии у больных с ВГС генотипами 1 (лучше при субтипе 1b) или 3 отмечено быстрое и значительное снижение вирусной РНК без серьезных побочных эффектов. Ко 2-му участку полимеразы одним из перспективных препаратов является VX-222, который проходит клинические испытания [41]. Монотерапия этим препаратом в течение 3 дней снижала вирусную нагрузку на 3 порядка, включая пациентов с генотипом 1 ВГС. Отмечены побочные эффекты в виде диареи, головной боли, которые были незначительно выражены. Как ингибитор 3-го участка исследуется препарат ANA-598, который планируется к использованию совместно с пегИФН/Р [30]. К 4-му участку одним из наиболее перспективных ингибиторов является компонент GS-9190 (тегобувир), которой находится в фазе клинических испытаний. Он планируется для применения в комбинированной терапии одновременно с пегИФН/Р [44]. Создание препаратов, направленных на вирусный белок NS5A Вирусный белок №5А выполняет много функций, но наиболее важная - сборка репликативного комплекса ВГС. Поэтому этот протеин является важной мишенью для терапии направленного действия. Один из перспективных ингибиторов белка №5А - препарат BMS-790052 [16]. Клинические испытания по применению этого препарата одновременно с пегИФН/Р у пациентов, инфицированных вирусом генотипа 1, позволили получить первичный (по окончанию ПВТ) вирусологический ответ у 83% больных [34]. Изучение препарата продолжается. В стадии клинических испытаний находится еще один подобный препарат GS-5885, который, возможно, будут применять без ИФН/Р [31]. Заключение В настоящее время для больных вирусным гепатитом С возможна тройная комбинированная терапия, когда помимо традиционных пегИФН/Р используется ингибитор протеазы телапревир или боцепревир. С этих препаратов начинается терапия нового уровня, при которой мишенью для лекарственных препаратов становятся ключевые белки ВГС. Впереди перспективные разработки, которые позволят надеяться на успешный результат даже у больных, не достигших УВО при существующей тройной терапии. Перспективные исследования направлены на создание веществ, нарушающих функциональную активность вирусной полимеразы и белка NS5A. Набор препаратов-ингибиторов для разных белков ВГС позволит подойти к специальной схеме лечения пациентов с ХГС, которым противопоказан ИФН-а.