Вирус гепатита С: мишени для терапии и новые лекарственные препараты

Аннотация

Обсуждены факторы вируса и пациента, влияющие на эффективность лечения. Представлены современные данные о молекулярном механизме действия основных препаратов для терапии вирусного гепатита С. Рассмотрены новые антивирусные препараты, ингибиторы протеазы, и фармакологические вещества, находящиеся в разработке и направленные против полимеразы вируса и белка NS5А.

Полный текст

Вирус гепатита С (ВГС) - представитель семейства Flaviviridae рода Hepacivirus [40]. Это сферический оболочечный вирус размером около 55 нм [17, 35, 50]. Под оболочкой вируса находится нуклеокап-сид, диаметром около 45 нм, в который упакован геном ВГС - одноцепочечная линейная РНК. Вирусная РНК имеет положительную полярность и содержит около 9600 нуклеотидных остатков. В ней выявлена одна открытая рамка считывания, ограниченная с 5'-и 3'-концов нетранслируемыми областями (см. рисунок). Геном кодирует крупный белок-предшественник полипротеин, из которого с участием клеточных и вирусных ферментов образуются все 10 полипептидов ВГС. Структурные белки вируса, формирующие вири-он, представлены нуклеокапсидным (core) протеином и двумя оболочечными гликопротеинами (Е1 и Е2). К неструктурным полипептидам ВГС, которые участвуют в процессах репликации, трансляции и инициации сборки вируса, относятся: виропорин (р7), Ш2-протеаза, сериновая протеаза-хеликаза (NS3), кофактор сериновой протеазы (NS4А), компоненты репликативного комплекса (NS4B и №5А) и РНК-зависимая РНК-полимераза (NS5B). Для ВГС характерна генетическая неоднородность (полиморфизм), из-за которой вирус классифицируют по генетическим параметрам на 6 генотипов и около 80 подтипов (или субтипов) [45]. Помимо этого в каждом инфицированном пациенте вирус представлен набором близкородственных генетических вариантов. ВГС - этиологический агент распространенного инфекционного заболевания, гепатита С, называемого ранее гепатитом ни А, ни В с парентеральной передачей. Острый гепатит С в 70-85% случаев переходит в хроническую форму, которая при естественном течении неуклонно прогрессирует, приводя к развитию фиброза, у 30% больных к циррозу печени и почти у 5% пациентов - к гепатоцеллюлярной карциноме [24]. В нашей стране с 2001 г. отмечается тенденция к снижению заболеваемости острым гепатитом С. Однако сохраняются высокими показатели регистрации случаев впервые выявленного хронического гепатита С (ХГС). Прогнозируется неблагоприятная эпидемиологическая ситуации по вирусному гепатиту С до 2020-х годов [1]. Терапия гепатита С базируется на комбинации препаратов пегилированного интерферона-a2a или интерферона-а2Ь и рибавирина (пегИФН/Р). У пациентов, инфицированных вирусом генотипа 1, такая терапия позволяет достичь устойчивого вирусологического ответа (УВО) почти в 50% случаев, у хронически инфицированных ВГС генотипа 2 или 3 -почти в 80% [20, 42]. Однако у 15-25% пациентов после терапии пегИФН/Р наблюдается рецидив. Поскольку главное место в оценке эффективности терапии отводится обнаружению РНК ВГС в крови, этот тест должен обладать высокой чувствительностью, не менее 10-15 МЕ/мл [13]. Если лечение начато в острой фазе инфекции, то вероятность достичь УВО существенно выше - до 90%. Неудача при противовирусной терапии (ПВТ) связана как с ВГС, так и с организмом самого пациента. К вирусным факторам относят генотип, набор вариантов вируса, вирусную нагрузку, кинетику снижения РНК ВГС при терапии; к факторам пациента - возраст, пол, длительность заболевания, стадию фиброза, сопутствующие заболевания, этническую принадлежность и генетический полиморфизм генов. Терапия пегИФН и рибавирином В современной ПВТ гепатита С используют конъюгированный с полиэтиленгликолем (пегилированный) ИФН-а в комбинации с рибавирином. ИФН-а - это цитокин, компонент врожденной иммунной системы человека. После подкожного введения больному молекула ИФН-а постепенно высвобождается из комплекса с полиэтиленгликолем и связывается специфически со своим рецептором IFNAR, который присутствует на поверхности гепатоцитов и ряда других клетках. Процесс связывания завершается передачей сигнала на два ассоциированных с рецептором внутриклеточных белка - тирозиновые киназы Jak1 и Tyk2. Они фосфорилируются и активируют компоненты передачи сигнала и активации транскрипции, называемые STAT1 и STAT2, входящие в сигнальный путь Jak-STAT. Активированные STAT1 и STAT2 переносятся в ядро, где специфически связываются с промоторными элементами почти сотни ИФН-стимулируемых генов. Продукты этих генов оказывают антивирусное, иммуномодулирующее и антипролиферативное действие. Они влияют на апоптоз инфицированной клетки, метаболизм липидов, синтез и деградацию белков и реакцию клетки на чужеродные молекулы. Наиболее известные белки, кодируемые ИФН-стимулируемыми генами, - это 2'-5' олигоаденилатсинтетаза (2'-5'ОАS), протеинкиназа R (PKR), активируемая двуцепочечной РНК, и Мх-белки [12]. ИФН-а действует как на инфицированные клетки, так и на иммунную систему в целом: регулирует экспрессию МНС класса II и привлечение иммунных клеток, стимулирует секрецию цитокинов и деление иммунных клеток. Как показано в экспериментах in vivo, рибавирин (нуклеозидный аналог) функционирует как легкий ингибитор репликации ВГС, но он эффективно предотвращает рецидив после терапии пегИФН/Р [13, 37]. Дискуссии о молекулярном механизме действия рибавирина продолжаются. Выдвинуто несколько гипотез: участие в усилении ответа Т-хелперов 1-го типа, в ингибировании инозитолмонофосфатдегидро-геназы (что приводит к снижению в клетке пула гуа-нозинтрифосфатов и дезоксигуанозинтрифосфатов), прямое ингибирование активности РНК-зависимой РНК-полимеразы и усиление внутриклеточных эффектов ИФН-а [23]. Вероятно, скоро вместо рибавирина будет использоваться другой препарат (tagybavi-rin), который дает минимальные побочные эффекты. Факторы ВГС, влияющие на эффективность лечения Важный вирусный фактор, влияющий на эффективность пегИФН/Р, - генотип ВГС. Лечение завершается безуспешно почти у 50% пациентов, инфицированных ВГС генотипа 1 или 4, и у 20% больных, инфицированных вирусом генотипа 2 или 3 [20, 42]. Для пациентов, инфицированных вирусом генотипа 1 или 4, снижение вирусной РНК в процессе лечения наступает позже, чем в случае вирусов генотипа 2 или 3. Причины этого еще не установлены. Еще один вирусный компонент, влияющий на эффективность ПВТ, - отдельные вирусные белки, точнее их участки, где возможны неблагоприятные мутации. Такие мутации выявлены в белках NS5A, Е2, NS3 и нуклеокапсидном протеине. Как впервые установили N. Enomoto и соавт. [14], мутации в участке ISDR (регион, определяющий чувствительность к ИФН, расположен в белке NS5A), предсказывают исход терапии у пациентов из Японии и Азии. Однако у пациентов из Европы и Америки такая зависимость не наблюдается [9, 25, 51]. Еще одна более протяженная зона, частично перекрывающаяся с участком ISDR, в белке NS5A может блокировать действие ИФН-а. Это участок PKR-BD, который способен связывать ИФН-индуцируемую и РНК-активируемую PKR, нарушая тем самым существенный компонент антивирусной защиты [33]. Мутации в этой зоне достоверно чаще обнаруживают у пациентов с УВО. Относительно роли еще одного участка этого же белка, петли V3, однозначное мнение отсутствует [33, 51]. Две мутации в зоне нуклеокапсидного белка, которые приводят к замене в 70-й и 91-й аминокислотных позициях этого протеина, влияют на эффективность терапии пегИФН/Р у японских больных ХГС, инфицированных вирусом субтипа 1b [2, 3]. Для европейских пациентов более значима мутация в 70 позиции нуклеокапсидного белка. Остаток аргинина в этом положении достоверно чаще выявляли у пациентов с УВО, и у них наблюдалось более быстрое снижение РНК ВГС в первые 8 нед лечения [4]. В СООН-концевой части белка Е2 расположен участок, называемый PePHD, гомологичный по структуре фрагменту киназы PKR, индуцированной ИФН, и рибосомальному фактору eIF2a. Из-за этого сходства нарушается фосфорилирование киназы и останавливается антивирусный эффект, проявляющийся на уровне регуляции активности рибосом [48]. Однако относительно влияния мутаций в этом регионе на эффективность терапии до сих продолжаются дискуссии [7, 48]. Возможно, еще в одном белке NS3 существуют мутации, влияющие на эффективность терапии пегИФН/Р на уровне регуляции компонента STAT1 [36, но этот аспект недостаточно изучен. Молекулярно-генетические факторы пациента, влияющие на результат терапии Среди наиболее значимых генетических факторов пациентов, влияющих на эффективность терапии, следует отметить полиморфизм гена интерферон-Х3 (ИФН-Х3). В 2009 г. три независимые группы исследователей, проводя полногеномные сравнения по многочисленным группам пациентов, достигших или не достигших УВО, показали, что однонуклеотидный полиморфизм (ОНП) около гена !Ь-28В ассоциирован с высокой вероятностью успеха терапии [18, 46, 47]. Ген !Ь-28В кодирует недавно открытый ИФН-Х3, аллельные варианты влияют и на вероятность самопроизвольной элиминации ВГС в острой фазе инфекции [49]. Выявлено 4 ОНП около гена IL-28B, но лишь для трех показана достоверная взаимосвязь с эффективностью ПВТ. Пока как предикторы чаще изучаются 2 ОНП в локусах rs12979860 и rs8099917 в разных этнических группах больных гепатитом С. Молекулярный механизм действия этих полиморфизмов на вероятность достижения УВО пациентами при ПВТ не установлен. Есть предположение, что эти ОНП около гена IL-28B влияют на продукцию мРНК ИФН-Х3 [46, 47]. Как все интерфероны, ИФН-Х3 оказывает антивирусный и иммуномодулирующий эффект. Хотя молекулярный механизм антивирусного действия ИФН-Х3 при ВГС-инфекции еще не установлен, этот интерферон удачно дополняет и, возможно, усиливает антивирусные эффекты ИНФ-а. Если у пациента выявлены аллельные вариант С/С в локусе rs12979860 и вариант Т/Т в локусе rs8099917 по полиморфизму гена ^-28В, вероятность достичь УВО высока (7090%) [18, 46, 47]. Как установлено недавно, дисбаланс в экспрессии генов в гепатоцитах может быть связан с эффективностью ПВТ [43]. Было обнаружено, что еще до начала терапии уровень экспрессии некоторых ИФН-стимулируемых генов был повышен только у пациентов, у которых ПВТ закончилась безуспешно. Удалось идентифицировать 2 гена IFI27 и CXLC9, экспрессия которых в гепатоцитах с большой вероятностью (около 100%) предсказывают неуспех ПВТ и с меньшей вероятностью достижение УВО (70%) [5]. Аналогичные данные были получены при анализе мРНК в мо-нонуклеарных клетках периферической крови и макрофагах печени [32]. Отсутствие мРНК белка МхА в макрофагах печени является с высокой вероятностью (до 98%) предиктором невозможности достичь УВО. В экспрессии генов еще одной группы биологически важных веществ - хемокинов обнаружены различия у пациентов, достигших и не достигших УВО. Хемокины являются пептидными регуляторами процесса воспаления [10, 26]. Установлено, что у больных, которые не могут достичь УВО, повышен уровень мРНК хемокина СХ^10, называемого также IP-10 (ИФН-у-индуцируемый белок 10). При этом в крови присутствует укороченный вариант IP-10, который функционирует как антагонист полноразмерной формы хемокина и не может обеспечить привлечение Т-лимфоцитов в зону воспаления [11]. Это приводит к нарушению Т-клеточного звена, выполняющего важную роль в ограничении вирусной инфекции в печени. Недавно выявлена взаимосвязь между отдельными аллельными формами гена IL-28B и содержанием IP-10 [28]. Повышенное содержание в крови хемокина IP-10 достоверно чаще выявлялось у пациентов с неблагоприятными аллельными формами гена IL-28B. Ингибиторы протеазы как препараты направленного действия В 2011 г. стала возможной новая терапия для пациентов, инфицированных вирусом генотипа 1, предусматривающая сочетание трех препаратов -пегИФН, рибавирина и телапревира или боцепревира. Это принципиально новая схема лечения, поскольку в ней появляется ингибитор вирусной сериновой протеазы - ключевого ферменты нарезания почти всех неструктурных белков вируса. Результаты III фазы клинических испытаний этой тройной терапии, показали, что около 65-75% ранее не леченых пациентов и 40-50% больных, безуспешно завершивших терапию пегИФН/Р, могут достичь УВО благодаря новой терапии [38]. Разработка ингибиторов протеазы длилась долго - с 90-х годов прошлого века. Одним из первых препаратов, показавших эффективность применения ингибиторов протеазы, было вещество BILN 2061 (фирма- разработчик «Boehring-er Ingelheim»), которое снижало вирусную нагрузку в 100-1000 раз после 2 дней применения у пациентов, инфицированных ВГС генотипа 1 [22]. Однако препарат не прошел клинические испытания из-за выраженной кардиотоксичности. Телапревир (разработчик «Vertex/Tibotec») и боце-превир (разработчик «Merck») прошли клинические испытания в США, Канаде и Европе и разрешены к применению. В США и Канаде телапревил имеет другое торговое название Incivektm, в Европе -Incivotm. По структуре оба препарата представаляют собой ингибиторы-пептидомиметики, которые выполняют роль ложного субстрата для NSS-протеазы. Телапревир по строению молекулы напоминает линейный тетрапептид с активной кетоамидной группой, которая реагирует с каталитическим серином вирусной протеазы с формированием ковалентного комплекса. В процессе применения телапревира возможно накопление устойчивых мутантных вариантов вируса. Однако в большинстве случаев эти резистентные формы ВГС уже присутствуют до лечения как минорные варианты вирусной популяции, составляя 0,3-2% [6, 40]. Выявлены аминокислотные остатки протеазы, замены в которых влияют на чувствительность к ингибиторам (см. таблицу). Как установлено, резистентные к телапревиру варианты ВГС имеют низкую скорость репликации и сохраняют чувствительность к пегИФН и рибавирину. Поэтому тройная терапия позволяет достичь УВО у 31-84% больных, в зависимости от того, как был завершен предыдущий курс лечения пегИФН/Р: без УВО либо с частичным ответом или с рецидивом [38]. Большинством пациентов телапревир хорошо переносится, но возможны побочные проявления в виде зуда, диареи, сыпи и анемии. Чаще всего отмечается кожный зуд. Боцепревир-кетоамидный пептидомиметик, который связывается обратимо с активным центром протеазы. У резистентных вариантов ВГС обнаружены замены по отдельным аминокислотным остаткам, что представлено в таблице [27]. Наиболее значимые побочные эффекты - это анемия и нарушения вкуса. В стадии изучения находятся следующие перспективные препараты: данопревир («Intermune», «Roche») и препарат ТМС435 («Medavir Incorporated»). Установлены аминокислотные остатки ^3-протеазы, которые приводят к нечувствительности к этим препаратам (см. таблицу). Разработка ингибиторов вирусной полимеразы Для ингибирования активности РНК-зависимой РНК-полимеразы ВГС создаются нуклеозидные (НА) и ненуклеозидные аналоги (ННА). Один из представителей НА - препарат RG7128, который является ци-тидиновым аналогом, напоминающим естественный субстрат полимеразы [19]. Он связывается с активным центром полимеразы и встраивается в растущую цепь РНК, приводя к терминации. Структура активного центра полимеразы ВГС консервативна, поэтому препарат эффективен для всех генотипов вируса. На фоне применения RG7128 редко образуются мутантные резистентные варианты. При тройной терапии пегИФН/Р и Аминокислотные замены в сериновой протеазе ВГС, обнаруженные у резистентных к терапии ингибиторами вариантов вирус Препарат Варианты и позиции аминокислотных остатков протеазы NS3, с которыми связана резистентность к ингибиторам [27] Телапревир A156V/T, V36M/A+R155K/T, V36M/A+A156V/T, V36M/A, T54A, R155K/T, A156S Боцепревир V36M, T54S, R155K, T54A, V55A, R155T, A156S, V158I, V170A, V36A, V36L, I170T Данопревир R155K ТМС435 80, 155, 156, 158 BI201335 155, 156, 168 препаратом RG7128 у 85% ранее не леченых пациентов с вирусом генотипа 1 достигался ранний вирусологический ответ [29]. Применение этого препарата в течение 4 нед одновременно с пегИФН/Р у больных, которые были инфицированы вирусом генотипа 2 или 3 и ранее завершили ПВТ безуспешно, показало возможность получить УВО в 63-67% случаев. Побочные эффекты от применения RG7128 умеренно выражены, клинические испытания препарата продолжаются. Недавно была продемонстрирована высокая эффективность совместного применения двух ингибиторов ВГС: для вирусной полимеразы RG7128 и для сериновой протеазы RG2772 [15]. В течение 2 нед терапии у ранее не леченых больных с вирусом генотипа 1 удалось снизить содержание РНК ВГС почти на 5 логарифмов. При увеличении длительности приема этих ингибиторов до 24 нед вирусная РНК не определялась у всех пациентов. Продолжаются исследования по разработке схем лечения больных ХГС только ингибиторами протеазы и полимеразы с учетом ОНП гена IL-28B. В стадии изучения находятся ННА к разным ал-лостерическим (влияющим на активность) участкам полимеразы. Применение такого типа ингибиторов чаще, чем в случае НА, приводит к формированию резистентных вариантов фермента. К 1-му участку полимеразы разработан ингибитор МК-3281 [8]. При 7-дневной монотерапии у больных с ВГС генотипами 1 (лучше при субтипе 1b) или 3 отмечено быстрое и значительное снижение вирусной РНК без серьезных побочных эффектов. Ко 2-му участку полимеразы одним из перспективных препаратов является VX-222, который проходит клинические испытания [41]. Монотерапия этим препаратом в течение 3 дней снижала вирусную нагрузку на 3 порядка, включая пациентов с генотипом 1 ВГС. Отмечены побочные эффекты в виде диареи, головной боли, которые были незначительно выражены. Как ингибитор 3-го участка исследуется препарат ANA-598, который планируется к использованию совместно с пегИФН/Р [30]. К 4-му участку одним из наиболее перспективных ингибиторов является компонент GS-9190 (тегобувир), которой находится в фазе клинических испытаний. Он планируется для применения в комбинированной терапии одновременно с пегИФН/Р [44]. Создание препаратов, направленных на вирусный белок NS5A Вирусный белок №5А выполняет много функций, но наиболее важная - сборка репликативного комплекса ВГС. Поэтому этот протеин является важной мишенью для терапии направленного действия. Один из перспективных ингибиторов белка №5А - препарат BMS-790052 [16]. Клинические испытания по применению этого препарата одновременно с пегИФН/Р у пациентов, инфицированных вирусом генотипа 1, позволили получить первичный (по окончанию ПВТ) вирусологический ответ у 83% больных [34]. Изучение препарата продолжается. В стадии клинических испытаний находится еще один подобный препарат GS-5885, который, возможно, будут применять без ИФН/Р [31]. Заключение В настоящее время для больных вирусным гепатитом С возможна тройная комбинированная терапия, когда помимо традиционных пегИФН/Р используется ингибитор протеазы телапревир или боцепревир. С этих препаратов начинается терапия нового уровня, при которой мишенью для лекарственных препаратов становятся ключевые белки ВГС. Впереди перспективные разработки, которые позволят надеяться на успешный результат даже у больных, не достигших УВО при существующей тройной терапии. Перспективные исследования направлены на создание веществ, нарушающих функциональную активность вирусной полимеразы и белка NS5A. Набор препаратов-ингибиторов для разных белков ВГС позволит подойти к специальной схеме лечения пациентов с ХГС, которым противопоказан ИФН-а.