Effect of a combination of glutamyl-tryptophan and glycyrrhizic acid on the course of acute infection caused by influenza (H3H2) virus in mice

Full Text

Каждый год вирусы гриппа вызывают массовые вспышки заболеваний во всех регионах планеты. Наиболее восприимчивая часть населения - дети школьного возраста. Одновременно с этим грипп является причиной дополнительной смертности среди пожилых людей в эпидемическом сезоне [7]. Имеется достаточно данных, свидетельствующих о связи между вспышкой гриппа и количеством больных, госпитализированных или умерших от острой пневмонии или хронических сердечно-легочных болезней и других состояний, которые могут быть следствием заболевания гриппом [10, 11]. Противогриппозная вакцинация представляет собой оптимальный метод повышения устойчивости к инфекции, однако она эффективна только против штамма вируса с конкретным антигенным составом [9]. Несмотря на развитую систему мониторинга гриппа, не исключена возможность появления и быстрого распространения разновидности вируса, не соответствующей штаммовому составу вакцины. Не менее важное значение имеет химиотерапия гриппа. Этиотропные фармакологические препараты - ремантадин, озельтамивир и рибавирин - могут снизить интенсивность и продолжительность инфекции, однако они обладают токсичностью и дают ряд побочных эффектов [2, 14]. Кроме того, вирусы гриппа способны вырабатывать резистентность к таким наиболее распространенным противовирусным препаратам, как производные адамантана (амантадин и ремантадин) и озельтамивир [12]. Таким образом, для контроля гриппозной инфекции необходимы новые противовирусные стратегии. Одним из подобных направлений является применение препаратов иммуномодулирующей природы [4, 8]. К числу соединений, применявшихся для профилактики и лечения гриппа, относятся, в частности, дипептид глутамил-триптофан (EW), более известный как тимоген [6], бендазол и комбинированный препарат Цитовир-3 [4, 5], многочисленные индукторы интерферона [1], моноклональные антитела разной специфичности [8], а также экстракты солодки и их производные [15]. Имеющиеся данные [4] свидетельствуют о том, что значительная часть этих средств наиболее эффективна в качестве мер экстренной профилактики, применяемых либо в инкубационном периоде, либо в первые часы после инфицирования. По мере формирования клинической картины гриппа эффективность препаратов снижается, хотя даже в этой ситуации риск развития постинфекционных осложнений достоверно уменьшается. Сравнительные исследования эффективности тимогена, бендазола и их комбинации показали, что комбинированный препарат существенно превосходит по эффективности каждый из входящих в него компонентов [4]. Эти результаты согласуются с существующим мнением о том, что сочетание в одной композиции соединений, модулирующих разные иммунные реакции, более эффективно, чем каждый из образующих ее компонентов [8]. В связи с этим очевидный интерес представляет сочетание тимомиметика EW, предположительно являющегося агонистом метаботропного глутаматного рецептора, и глицирризиновой кислоты, подавляющей экспрессию провоспалительных цитокинов за счет ингибирования активности Толл-подобных рецепторов TLR-3 и TLR-4 [13]. Способность каждого из этих соединений уменьшать тяжесть течения экспериментальной гриппозной инфекции хорошо документирована [4, 15]. В связи с изложенным представляет несомненный интерес исследование проти-воинфекционных свойств глицирризиновой кислоты тринатриевой соли (ГКТС), EW и их комбинации в отношении вируса гриппа in vivo на модели летальной гриппозной пневмонии у животных при введении в период манифестации инфекционного процесса (лечебная схема применения). Материалы и методы Препараты. В работе использовали ГКТС, глутамил-триптофана (EW) натриевую соль (ЗАО «МБНПК “Цитомед”», Санкт-Петербург). В качестве референс-препарата применяли ремантадин (а-метил- 1-адамантил-метиламина гидрохлорид, «Aldrich Chem. Co.”, Milw., Wl, cat. # 39.059-3). Вирус. Использовали адаптированный к мышам вирус гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2). Вирус пассировали в аллантоисной полости 10-12-дневных куриных эмбрионов в течение 48 ч при 36°C. Животные. Белых беспородных мышей (самки) массой 12-16 г получали из питомника «Рапполово» (Ленинградская обл.) и содержали на стандартном рационе в условиях вивария НИИ гриппа РАМН. Подбор животных в группы опыта проводили методом случайной выборки. До начала испытаний животные находились под наблюдением в течение 1 нед. Экспериментальная гриппозная инфекция. Для заражения животных была использована вируссодержащая аллантоисная жидкость куриных эмбрионов. Из нее готовили серию 10-кратных разведений на физиологическом растворе, после чего инфекционную активность вируса в заражающем материале определяли в отдельном эксперименте при помощи титрования по летальности на животных. Титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча. Исследуемые препараты вводили животным вну-трибрюшинно в объеме 0,2 мл по лечебной схеме (1 раз в сутки в течение 5 дней, начиная с 1-х суток после инфицирования). Препарат сравнения применяли по той же схеме. Дозы препаратов: ГКТС - 10 мг на 1 кг массы животных, EW - 1000, 10 и 0,1 мг/кг, ремантадин - 50 мг/кг. В качестве плацебо животным контрольной группы вводили физиологический фосфатный буфер. В качестве отрицательного контроля использовали интактных животных, которые содержались в тех же условиях, что и опытные группы. Вирусы вводили животным интраназально под легким эфирным наркозом по 1 LD50 (25 мышей на группу) и 10 LD50 (20 мышей на группу). На 3-й день после заражения 10 животных из каждой группы умерщвляли, вскрывали и изолировали легкие. Из этих 10 легких 5 использовали для выделения вируса (замораживали и хранили при -20°C до постановки соответствующих экспериментов), оставшиеся 5 легких фиксировали 10% забуференным формалином и использовали для гистологического анализа (см. ниже). Легкие животных, инфицированных вирусом в дозе 10 LD50, использовали только для выделения вируса. Наблюдение за оставшимися животными осуществляли в течение 14 дней, т. е. срока, на протяжении которого ежедневно фиксировали массу и смертность животных в контрольных и опытных группах. На основании полученных показателей смертности в каждой группе рассчитывали процент смертности (М), индекс защиты (IP) и среднюю продолжительность жизни животных (MDD) из расчета 14 дней наблюдения в соответствии со следующими формулами: MDD = (I N • D)/Nt, где N - количество животных, проживших D дней, Nt - общее число животных в группе; M = M/Nt, где M - число животных в группе, павших в течение 14 дней после заражения; IP = ((Mc - Me)/Mc) • 100%, где Mc и Me - смертность (в %) в контрольной и опытной группах соответственно. Титрование вируса в легочной ткани. Для определения инфекционного титра вируса гриппа в легочной ткани животных легкие мышей, извлеченные на 3-и сутки после инфицирования, гомогенизировали в 10-кратном объеме стерильного физиологического фосфатного буфера и готовили из гомогенатов серии 10-кратных разведений на том же буфере. При определении титра вируса гриппа использовали культуру клеток MDCK (ATCC # CCL-34), выращенных на 96-луночных панелях на среде МЕМ. Клетки заражали серийными 10-кратными разведениями легочного го-могената от 10 до 10-7 и инкубировали в термостате в течение 48 ч. По окончании срока инкубации культуральную жидкость переносили в лунки планшета для иммунологических реакций, после чего добавляли равный объем 1% суспензии куриных эритроцитов в физиологическом растворе. Уровень репродукции вируса в лунках панели оценивали по реакции гемагглютинации (РГА) эритроцитов. За титр вируса принимали величину, противоположную десятичному логарифму наибольшего разведения вируса, способного вызывать положительную реакцию гемагглютинации, и выражали в логарифмах 50% экспериментальной инфекционной дозы вируса (lg ЭИД50). Гистологический анализ. Для морфологического исследования легкие фиксировали 10% формалином на фосфатном буфере, затем готовили препараты по стандартной методике с заливкой в парафин. Депа-рафинированные срезы окрашивали гематоксилином и эозином. В полученных препаратах оценивали интенсивность и клеточный состав воспалительного инфильтрата в очагах пневмонии и определяли степень дегенеративных и пролиферативных процессов в ткани легких. Проявления бронхиолита и отека легких оценивали в окрашенных срезах легких полуколичественно по следующим критериям: 0 - клетки занимают от 0 до 25% поля зрения (что характерно для структуры интактных легких), 1 - 25-50% (умеренный отек), 2 -50-75% (выраженный отек), 3 - 75-100% (тотальный отек легких). В каждой группе препараты просматривали в 10-20 полях зрения. Статистическая обработка данных. Статистическую обработку результатов (расчет средних значений и стандартных отклонений) проводили при помощи программы Microsoft Excel. Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента. Различия между группами считали достоверными, если значение p не превышало 0,05. Результаты Протективная активность препаратов в опытах на животных. В ходе опыта не зарегистрирована неспецифическая смертность в контрольной группе интактных животных. Клинические признаки заболевания были типичными для гриппозной инфекции: затрудненное дыхание, атаксия, тремор, снижение потребления корма и воды. Данные о динамике смертности животных в контрольных и опытных группах, уровне репродукции вируса в ткани легких и влиянии препаратов на степень воспалительных процессов и отека легких суммированы в таблице. Инфицирование животных вирусом приводило к дозозависимой смертности в группах опыта, начиная с 6-х суток после инфицирования. Применение препаратов ГКТС и EW и ремантадина приводило к снижению смертности и повышению продолжительности жизни животных. В наибольшей степени эффект был выражен при введении EW в максимальной дозе (1 мг/кг) и комплекса EW и ГКТС (индексы защиты 41 и 77% соответственно). В последнем случае защитный эффект препаратов превосходил таковой ремантадина. Влияние препаратов на репродукцию вируса. В ткани легких модельный вирус размножался до титров 6,9-7,3 lg ЭИД50/20 мг ткани в зависимости от инфицирующей дозы. Применение ГКТС не влияло на репродукцию вируса в ткани, однако использование EW приводило к достоверному снижению инфекционной активности вируса в легких, причем ингибирующий эффект не зависел от наличия в смеси ГКТС. Это относилось как к малой, так и к высокой инфицирующей дозе вируса. Морфологический анализ. У зараженных мышей, не получавших лечение, морфологические изменения легочной ткани на 6-е сутки после инфицирования характеризовались скоплением нейтрофилов и клеточного детрита в просветах крупных бронхов, вирусспецифи-ческим поражением клеток бронхиального эпителия с формированием в них вирусных включений и отторжением пораженных клеток в просвет бронха, интенсивным серозным интерстициальным отеком, очагами геморрагического отека, нейтрофильной инфильтрацией и распадом клеток в респираторных отделах, расширением сосудов и спадением альвеол (рис. 1, см. 2-ю полосу обложки). Значительная часть нейтрофилов при этом находилась в стадии распада. Перечисленные явления типичны для интенсивно протекающей вирусной пневмонии, и степень их выраженности может служить критерием для оценки тяжести процесса. При введении исследуемых препаратов морфологическая структура легких животных, прошедших лечение, была сходной с таковой у контрольных животных. Основное отличие от животных, не получавших лечения, заключалось в резком ограничении признаков вирусспецифического и реактивного поражения ткани легких в острой стадии гриппозной пневмонии. Так, на 6-е сутки после инфицирования клетки бронхиального эпителия выглядели сохранными (рис. 2, а; см. 2-ю полосу обложки) в отличие от разрушенных клеток с многочисленными вирусными включениями у контрольных животных. Сами очаги воспаления занимали меньшую по сравнению с контролем площадь (рис. 2, б). Согласно полученным данным наиболее выраженное восстановление структуры ткани легких наблюдалось на фоне Препарат Доза вируса, LD50 MDD, сут Смертность, % Индекс защиты, % Увеличение MDD, сут Титр вируса на 3-и сутки, lg ЭИД50/20 мг ткани Степень отека легких, баллы EW, 0,1 мкг/кг 10 8,4 93,3 0,0 -0,3 6,5 ± 0,3 н/о 1 11,9 46,7 12,5 0,5 5,2 ± 1,2 1,7 ± 0,2 (p = 0,002) EW, 10 мкг/кг 10 9,8 80,0 14,3 1,1 2,7 ± 1,0 н/о 1 12,3 46,7 12,5 0,9 0,9 ± 0,3 3,2 ± 0,2 (p = 0,092) EW, 1000 10 11,5 60,0 35,7 2,9 2,3 ± 0,9 н/о мкг/кг 1 13,4 26,7 50,0 2,1 1,8 ± 1,0 1,1 ± 0,2 (p = 0,000) ГКТС, 10 мг/кг 10 9,9 80,0 14,3 1,3 7,0 ± 0,2 н/о 1 12,0 53,3 0,0 0,7 5,8 ± 1,0 2,1 ± 0,2 (p = 0,073) ГКТС + EW, 0,1 10 9,9 86,7 7,1 1,2 6,9 ± 0,3 н/о мкг/кг 1 12,2 53,3 0,0 0,9 5,6 ± 1,3 1,0 ± 0,2 (p = 0,000) ГКТС + EW, 10 10 12,1 53,3 42,9 3,4 2,0 ± 1,3 н/о мкг/кг 1 12,5 33,3 37,5 1,2 1,5 ± 1,3 2,2 ± 0,2 (p = 0,112) ГКТС + EW, 1000 10 13,9 20,0 78,6 5,2 1,4 ± 0,5 н/о мкг/кг 1 14,1 13,3 75,0 2,7 1,6 ± 0,9 0,9 ± 0,1 (p = 0,002) Ремантадин, 50 10 13,0 26,7 71,4 4,3 2,2 ± 0,8 н/о мг/кг 1 13,9 13,3 75,0 2,6 2,3 ± 0,9 0,9 ± 0,2 (p = 0,000) Контроль вируса 10 8,7 93,3 - 0,0 7,3 ± 0,2 н/о 1 11,3 53,3 - 0,0 6,9 ± 0,4 2,7 ± 0,2 (p = 1,000) Примечание. деляли. Жирным шрифтом выделены значения, отличающиеся от контрольных при уровне достоверности 95%; н/о - не опре- EW (1000 мкг/кг) в комбинации его с ГКТС (рис. 3, а; см. 2-ю полосу обложки). В данном случае активность этой комбинации была сопоставима с активностью ремантадина (рис. 3, б). Остальные сочетания препаратов оказывали сходное или меньшее влияние на морфологию легких при гриппозной пневмонии. Количественно степень поражения легочной ткани животных контрольных и опытных групп была также оценена при микроскопическом исследовании легких. Было установлено (см. таблицу), что наибольшее влияние на отек и воспалительную инфильтрацию легких отмечалось при использовании ГКТС в комбинации с EW (1000 мкг/кг), что хорошо коррелирует с результатами вышеописанных тестов. Обсуждение Полученные результаты доказали правомерность первоначальной гипотезы относительно более высокой эффективности комбинированного препарата, состоящего из EW и ГКТС, в сравнении с каждым из компонентов по отдельности. При использовании комбинированного препарата, содержащего 10 мг/кг ГКТС и 1 мг/кг EW, выживаемость инфицированных животных была несколько выше, чем животных, получавших ремантадин. Увеличение выживаемости на фоне введения исследованной комбинации сопровождалось отчетливой тенденцией к снижению титра вируса в легких и соответственно нормализации гистологической картины легких. Дипептидные производные активно разрабатываются в последнее время в качестве противовирусных препаратов. Наиболее интересными среди них являются дипептиды, имеющие клеточные мишени и воздействующие на патологический процесс при вирусной инфекции опосредованно - через иммуномодуляцию, индукцию интерферона и т. п. [3]. Эти соединения не проявляют выраженные противовирусные свойства в клеточных культурах, однако имеют высокую активность при экспериментах на животных, что обусловлено взаимодействием многих клеточных популяций в процессе реализации механизма их действия. В этом смысле EW, использованный в данном исследовании, можно отнести к группе препаратов, эффективность которых обусловлена взаимодействием с системой врожденного иммунитета. С этой позиции сочетание EW с ГКТС полностью оправдано, поскольку производные солодки также реализуют свои свойства преимущественно через паттерн-распознающие рецепторы, но иного типа, чем EW. Таким образом, комбинация этих двух соединений позволяет в максимальной степени мобилизовать систему врожденного иммунитета на защиту от патогенного вируса. Полученные результаты позволяют рассматривать комбинацию ГКТС + EW как перспективное средство для лечения гриппа.

References

Supplementary files