Влияние комбинации глутамил-триптофана с глицирризиновой кислотой на течение острой инфекции у мышей, вызванной вирусом гриппа (H3N2)

Полный текст

Каждый год вирусы гриппа вызывают массовые вспышки заболеваний во всех регионах планеты. Наиболее восприимчивая часть населения - дети школьного возраста. Одновременно с этим грипп является причиной дополнительной смертности среди пожилых людей в эпидемическом сезоне [7]. Имеется достаточно данных, свидетельствующих о связи между вспышкой гриппа и количеством больных, госпитализированных или умерших от острой пневмонии или хронических сердечно-легочных болезней и других состояний, которые могут быть следствием заболевания гриппом [10, 11]. Противогриппозная вакцинация представляет собой оптимальный метод повышения устойчивости к инфекции, однако она эффективна только против штамма вируса с конкретным антигенным составом [9]. Несмотря на развитую систему мониторинга гриппа, не исключена возможность появления и быстрого распространения разновидности вируса, не соответствующей штаммовому составу вакцины. Не менее важное значение имеет химиотерапия гриппа. Этиотропные фармакологические препараты - ремантадин, озельтамивир и рибавирин - могут снизить интенсивность и продолжительность инфекции, однако они обладают токсичностью и дают ряд побочных эффектов [2, 14]. Кроме того, вирусы гриппа способны вырабатывать резистентность к таким наиболее распространенным противовирусным препаратам, как производные адамантана (амантадин и ремантадин) и озельтамивир [12]. Таким образом, для контроля гриппозной инфекции необходимы новые противовирусные стратегии. Одним из подобных направлений является применение препаратов иммуномодулирующей природы [4, 8]. К числу соединений, применявшихся для профилактики и лечения гриппа, относятся, в частности, дипептид глутамил-триптофан (EW), более известный как тимоген [6], бендазол и комбинированный препарат Цитовир-3 [4, 5], многочисленные индукторы интерферона [1], моноклональные антитела разной специфичности [8], а также экстракты солодки и их производные [15]. Имеющиеся данные [4] свидетельствуют о том, что значительная часть этих средств наиболее эффективна в качестве мер экстренной профилактики, применяемых либо в инкубационном периоде, либо в первые часы после инфицирования. По мере формирования клинической картины гриппа эффективность препаратов снижается, хотя даже в этой ситуации риск развития постинфекционных осложнений достоверно уменьшается. Сравнительные исследования эффективности тимогена, бендазола и их комбинации показали, что комбинированный препарат существенно превосходит по эффективности каждый из входящих в него компонентов [4]. Эти результаты согласуются с существующим мнением о том, что сочетание в одной композиции соединений, модулирующих разные иммунные реакции, более эффективно, чем каждый из образующих ее компонентов [8]. В связи с этим очевидный интерес представляет сочетание тимомиметика EW, предположительно являющегося агонистом метаботропного глутаматного рецептора, и глицирризиновой кислоты, подавляющей экспрессию провоспалительных цитокинов за счет ингибирования активности Толл-подобных рецепторов TLR-3 и TLR-4 [13]. Способность каждого из этих соединений уменьшать тяжесть течения экспериментальной гриппозной инфекции хорошо документирована [4, 15]. В связи с изложенным представляет несомненный интерес исследование проти-воинфекционных свойств глицирризиновой кислоты тринатриевой соли (ГКТС), EW и их комбинации в отношении вируса гриппа in vivo на модели летальной гриппозной пневмонии у животных при введении в период манифестации инфекционного процесса (лечебная схема применения). Материалы и методы Препараты. В работе использовали ГКТС, глутамил-триптофана (EW) натриевую соль (ЗАО «МБНПК “Цитомед”», Санкт-Петербург). В качестве референс-препарата применяли ремантадин (а-метил- 1-адамантил-метиламина гидрохлорид, «Aldrich Chem. Co.”, Milw., Wl, cat. # 39.059-3). Вирус. Использовали адаптированный к мышам вирус гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2). Вирус пассировали в аллантоисной полости 10-12-дневных куриных эмбрионов в течение 48 ч при 36°C. Животные. Белых беспородных мышей (самки) массой 12-16 г получали из питомника «Рапполово» (Ленинградская обл.) и содержали на стандартном рационе в условиях вивария НИИ гриппа РАМН. Подбор животных в группы опыта проводили методом случайной выборки. До начала испытаний животные находились под наблюдением в течение 1 нед. Экспериментальная гриппозная инфекция. Для заражения животных была использована вируссодержащая аллантоисная жидкость куриных эмбрионов. Из нее готовили серию 10-кратных разведений на физиологическом растворе, после чего инфекционную активность вируса в заражающем материале определяли в отдельном эксперименте при помощи титрования по летальности на животных. Титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча. Исследуемые препараты вводили животным вну-трибрюшинно в объеме 0,2 мл по лечебной схеме (1 раз в сутки в течение 5 дней, начиная с 1-х суток после инфицирования). Препарат сравнения применяли по той же схеме. Дозы препаратов: ГКТС - 10 мг на 1 кг массы животных, EW - 1000, 10 и 0,1 мг/кг, ремантадин - 50 мг/кг. В качестве плацебо животным контрольной группы вводили физиологический фосфатный буфер. В качестве отрицательного контроля использовали интактных животных, которые содержались в тех же условиях, что и опытные группы. Вирусы вводили животным интраназально под легким эфирным наркозом по 1 LD50 (25 мышей на группу) и 10 LD50 (20 мышей на группу). На 3-й день после заражения 10 животных из каждой группы умерщвляли, вскрывали и изолировали легкие. Из этих 10 легких 5 использовали для выделения вируса (замораживали и хранили при -20°C до постановки соответствующих экспериментов), оставшиеся 5 легких фиксировали 10% забуференным формалином и использовали для гистологического анализа (см. ниже). Легкие животных, инфицированных вирусом в дозе 10 LD50, использовали только для выделения вируса. Наблюдение за оставшимися животными осуществляли в течение 14 дней, т. е. срока, на протяжении которого ежедневно фиксировали массу и смертность животных в контрольных и опытных группах. На основании полученных показателей смертности в каждой группе рассчитывали процент смертности (М), индекс защиты (IP) и среднюю продолжительность жизни животных (MDD) из расчета 14 дней наблюдения в соответствии со следующими формулами: MDD = (I N • D)/Nt, где N - количество животных, проживших D дней, Nt - общее число животных в группе; M = M/Nt, где M - число животных в группе, павших в течение 14 дней после заражения; IP = ((Mc - Me)/Mc) • 100%, где Mc и Me - смертность (в %) в контрольной и опытной группах соответственно. Титрование вируса в легочной ткани. Для определения инфекционного титра вируса гриппа в легочной ткани животных легкие мышей, извлеченные на 3-и сутки после инфицирования, гомогенизировали в 10-кратном объеме стерильного физиологического фосфатного буфера и готовили из гомогенатов серии 10-кратных разведений на том же буфере. При определении титра вируса гриппа использовали культуру клеток MDCK (ATCC # CCL-34), выращенных на 96-луночных панелях на среде МЕМ. Клетки заражали серийными 10-кратными разведениями легочного го-могената от 10 до 10-7 и инкубировали в термостате в течение 48 ч. По окончании срока инкубации культуральную жидкость переносили в лунки планшета для иммунологических реакций, после чего добавляли равный объем 1% суспензии куриных эритроцитов в физиологическом растворе. Уровень репродукции вируса в лунках панели оценивали по реакции гемагглютинации (РГА) эритроцитов. За титр вируса принимали величину, противоположную десятичному логарифму наибольшего разведения вируса, способного вызывать положительную реакцию гемагглютинации, и выражали в логарифмах 50% экспериментальной инфекционной дозы вируса (lg ЭИД50). Гистологический анализ. Для морфологического исследования легкие фиксировали 10% формалином на фосфатном буфере, затем готовили препараты по стандартной методике с заливкой в парафин. Депа-рафинированные срезы окрашивали гематоксилином и эозином. В полученных препаратах оценивали интенсивность и клеточный состав воспалительного инфильтрата в очагах пневмонии и определяли степень дегенеративных и пролиферативных процессов в ткани легких. Проявления бронхиолита и отека легких оценивали в окрашенных срезах легких полуколичественно по следующим критериям: 0 - клетки занимают от 0 до 25% поля зрения (что характерно для структуры интактных легких), 1 - 25-50% (умеренный отек), 2 -50-75% (выраженный отек), 3 - 75-100% (тотальный отек легких). В каждой группе препараты просматривали в 10-20 полях зрения. Статистическая обработка данных. Статистическую обработку результатов (расчет средних значений и стандартных отклонений) проводили при помощи программы Microsoft Excel. Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента. Различия между группами считали достоверными, если значение p не превышало 0,05. Результаты Протективная активность препаратов в опытах на животных. В ходе опыта не зарегистрирована неспецифическая смертность в контрольной группе интактных животных. Клинические признаки заболевания были типичными для гриппозной инфекции: затрудненное дыхание, атаксия, тремор, снижение потребления корма и воды. Данные о динамике смертности животных в контрольных и опытных группах, уровне репродукции вируса в ткани легких и влиянии препаратов на степень воспалительных процессов и отека легких суммированы в таблице. Инфицирование животных вирусом приводило к дозозависимой смертности в группах опыта, начиная с 6-х суток после инфицирования. Применение препаратов ГКТС и EW и ремантадина приводило к снижению смертности и повышению продолжительности жизни животных. В наибольшей степени эффект был выражен при введении EW в максимальной дозе (1 мг/кг) и комплекса EW и ГКТС (индексы защиты 41 и 77% соответственно). В последнем случае защитный эффект препаратов превосходил таковой ремантадина. Влияние препаратов на репродукцию вируса. В ткани легких модельный вирус размножался до титров 6,9-7,3 lg ЭИД50/20 мг ткани в зависимости от инфицирующей дозы. Применение ГКТС не влияло на репродукцию вируса в ткани, однако использование EW приводило к достоверному снижению инфекционной активности вируса в легких, причем ингибирующий эффект не зависел от наличия в смеси ГКТС. Это относилось как к малой, так и к высокой инфицирующей дозе вируса. Морфологический анализ. У зараженных мышей, не получавших лечение, морфологические изменения легочной ткани на 6-е сутки после инфицирования характеризовались скоплением нейтрофилов и клеточного детрита в просветах крупных бронхов, вирусспецифи-ческим поражением клеток бронхиального эпителия с формированием в них вирусных включений и отторжением пораженных клеток в просвет бронха, интенсивным серозным интерстициальным отеком, очагами геморрагического отека, нейтрофильной инфильтрацией и распадом клеток в респираторных отделах, расширением сосудов и спадением альвеол (рис. 1, см. 2-ю полосу обложки). Значительная часть нейтрофилов при этом находилась в стадии распада. Перечисленные явления типичны для интенсивно протекающей вирусной пневмонии, и степень их выраженности может служить критерием для оценки тяжести процесса. При введении исследуемых препаратов морфологическая структура легких животных, прошедших лечение, была сходной с таковой у контрольных животных. Основное отличие от животных, не получавших лечения, заключалось в резком ограничении признаков вирусспецифического и реактивного поражения ткани легких в острой стадии гриппозной пневмонии. Так, на 6-е сутки после инфицирования клетки бронхиального эпителия выглядели сохранными (рис. 2, а; см. 2-ю полосу обложки) в отличие от разрушенных клеток с многочисленными вирусными включениями у контрольных животных. Сами очаги воспаления занимали меньшую по сравнению с контролем площадь (рис. 2, б). Согласно полученным данным наиболее выраженное восстановление структуры ткани легких наблюдалось на фоне Препарат Доза вируса, LD50 MDD, сут Смертность, % Индекс защиты, % Увеличение MDD, сут Титр вируса на 3-и сутки, lg ЭИД50/20 мг ткани Степень отека легких, баллы EW, 0,1 мкг/кг 10 8,4 93,3 0,0 -0,3 6,5 ± 0,3 н/о 1 11,9 46,7 12,5 0,5 5,2 ± 1,2 1,7 ± 0,2 (p = 0,002) EW, 10 мкг/кг 10 9,8 80,0 14,3 1,1 2,7 ± 1,0 н/о 1 12,3 46,7 12,5 0,9 0,9 ± 0,3 3,2 ± 0,2 (p = 0,092) EW, 1000 10 11,5 60,0 35,7 2,9 2,3 ± 0,9 н/о мкг/кг 1 13,4 26,7 50,0 2,1 1,8 ± 1,0 1,1 ± 0,2 (p = 0,000) ГКТС, 10 мг/кг 10 9,9 80,0 14,3 1,3 7,0 ± 0,2 н/о 1 12,0 53,3 0,0 0,7 5,8 ± 1,0 2,1 ± 0,2 (p = 0,073) ГКТС + EW, 0,1 10 9,9 86,7 7,1 1,2 6,9 ± 0,3 н/о мкг/кг 1 12,2 53,3 0,0 0,9 5,6 ± 1,3 1,0 ± 0,2 (p = 0,000) ГКТС + EW, 10 10 12,1 53,3 42,9 3,4 2,0 ± 1,3 н/о мкг/кг 1 12,5 33,3 37,5 1,2 1,5 ± 1,3 2,2 ± 0,2 (p = 0,112) ГКТС + EW, 1000 10 13,9 20,0 78,6 5,2 1,4 ± 0,5 н/о мкг/кг 1 14,1 13,3 75,0 2,7 1,6 ± 0,9 0,9 ± 0,1 (p = 0,002) Ремантадин, 50 10 13,0 26,7 71,4 4,3 2,2 ± 0,8 н/о мг/кг 1 13,9 13,3 75,0 2,6 2,3 ± 0,9 0,9 ± 0,2 (p = 0,000) Контроль вируса 10 8,7 93,3 - 0,0 7,3 ± 0,2 н/о 1 11,3 53,3 - 0,0 6,9 ± 0,4 2,7 ± 0,2 (p = 1,000) Примечание. деляли. Жирным шрифтом выделены значения, отличающиеся от контрольных при уровне достоверности 95%; н/о - не опре- EW (1000 мкг/кг) в комбинации его с ГКТС (рис. 3, а; см. 2-ю полосу обложки). В данном случае активность этой комбинации была сопоставима с активностью ремантадина (рис. 3, б). Остальные сочетания препаратов оказывали сходное или меньшее влияние на морфологию легких при гриппозной пневмонии. Количественно степень поражения легочной ткани животных контрольных и опытных групп была также оценена при микроскопическом исследовании легких. Было установлено (см. таблицу), что наибольшее влияние на отек и воспалительную инфильтрацию легких отмечалось при использовании ГКТС в комбинации с EW (1000 мкг/кг), что хорошо коррелирует с результатами вышеописанных тестов. Обсуждение Полученные результаты доказали правомерность первоначальной гипотезы относительно более высокой эффективности комбинированного препарата, состоящего из EW и ГКТС, в сравнении с каждым из компонентов по отдельности. При использовании комбинированного препарата, содержащего 10 мг/кг ГКТС и 1 мг/кг EW, выживаемость инфицированных животных была несколько выше, чем животных, получавших ремантадин. Увеличение выживаемости на фоне введения исследованной комбинации сопровождалось отчетливой тенденцией к снижению титра вируса в легких и соответственно нормализации гистологической картины легких. Дипептидные производные активно разрабатываются в последнее время в качестве противовирусных препаратов. Наиболее интересными среди них являются дипептиды, имеющие клеточные мишени и воздействующие на патологический процесс при вирусной инфекции опосредованно - через иммуномодуляцию, индукцию интерферона и т. п. [3]. Эти соединения не проявляют выраженные противовирусные свойства в клеточных культурах, однако имеют высокую активность при экспериментах на животных, что обусловлено взаимодействием многих клеточных популяций в процессе реализации механизма их действия. В этом смысле EW, использованный в данном исследовании, можно отнести к группе препаратов, эффективность которых обусловлена взаимодействием с системой врожденного иммунитета. С этой позиции сочетание EW с ГКТС полностью оправдано, поскольку производные солодки также реализуют свои свойства преимущественно через паттерн-распознающие рецепторы, но иного типа, чем EW. Таким образом, комбинация этих двух соединений позволяет в максимальной степени мобилизовать систему врожденного иммунитета на защиту от патогенного вируса. Полученные результаты позволяют рассматривать комбинацию ГКТС + EW как перспективное средство для лечения гриппа.

Список литературы

Дополнительные файлы