Том 67, № 6 (2022)
- Год: 2022
- Дата публикации: 07.12.2022
- Статей: 8
- URL: https://virusjour.crie.ru/jour/issue/view/59
Весь выпуск
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Генетический полиморфизм сибирских изолятов коронавируса крупного рогатого скота (Coronaviridae: Betacoronavirus-1: Bovine-Like coronaviruses)
Аннотация
Введение. Коронавирусы крупного рогатого скота (BCoV) – причина диарей, респираторных болезней телят и зимней дизентерии коров. Актуально изучение генетического разнообразия этих вирусов.
Цель работы – изучение генетического полиморфизма изолятов BCoV, циркулирующих среди молочного скота в Сибири.
Материалы и методы. В работе использован биоматериал, взятый у падших или вынужденно забитых животных до начала исследования. Мишень для амплификации – нуклеотидные последовательности участков генов S и N. Филогенетические дендрограммы строили с использованием метода максимального правдоподобия в программе MEGA 7.0.
Результаты. По результатам ОТ-ПЦР геном вируса присутствовал в пробах биоматериала от телят с диарейным (16,3%) и респираторным (9,9%) синдромами. Первичные нуклеотидные последовательности участка гена S определили для 18, а гена N – для 12 изолятов. На основе гена S изоляты разделились на две клады с двумя подкладами в каждой. В первую подкладу первой клады (европейская линия) вошли 11 изолятов. Во вторую подкладу, включающую классические штаммы Квебек и Мёбус, исследуемые изоляты не входили. В первой подкладе второй клады (американо-азиатская линия) оказались 6 исследованных изолятов. Ко второй подкладе (смешанная линия) отнесли один изолят. На основе гена N получили две клады, одна из которых включала две подклады. В первую подкладу первой клады вошли 3 изолята (американо-азиатская линия), а во вторую – один (смешанная линия). Во второй кладе (смешанная) оказались 8 изолятов. Различий между диарейными и респираторными изолятами, а также зависимости от их географического местоположения не установили.
Заключение. Исследованная популяция изолятов BCoV носит неоднородный характер. Анализ нуклеотидных последовательностей является полезным инструментом для изучения молекулярной эпизоотологии коронавирусных инфекций и решения вопроса о применении вакцин в конкретном регионе.
465-474
Вариабельность генов неструктурных белков ротавируса А (Reoviridae: Rotavirus: Rotavirus A) генотипа G9P[8] в период доминирования на территории Нижнего Новгорода (центральная часть России) (2011–2020)
Аннотация
Введение. В России ротавирус А является основной причиной тяжёлого гастроэнтерита вирусной этиологии у детей раннего возраста. Молекулярные особенности, позволяющие ротавирусу того или иного генотипа получить эволюционное преимущество, остаются неясны, поэтому изучение генетического разнообразия ротавирусов на основе генов, кодирующих неструктурные белки, ответственных за репродукцию вируса в клетке, является актуальной задачей.
Цель работы – изучение генетического разнообразия ротавирусов генотипа G9P[8], доминировавшего в Нижнем Новгороде в 2011–2020 гг., на основе генов, кодирующих неструктурные белки.
Материалы и методы. Ротавирус-положительные образцы стула детей исследовали методами ПЦР-генотипирования и секвенирования нуклеотидных последовательностей генов NSP1–NSP5. Филогенетический анализ проводили в программе MEGA X.
Результаты. В период 2011–2020 гг. в Нижнем Новгороде происходила коциркуляция ротавирусов G9P[8], имеющих четыре варианта гена NSP2. Новые аллели были отмечены в 2012 (N1-a-III), 2016 (N1-a-IV) и 2019 гг. (N1-a-II). Появление новых вариантов других генов произошло в 2014 (Е1-3, NSP4), 2018 (T1-a3-III, NSP3) и 2019 гг. (A1-b-II, NSP1). Наиболее вариабельным по аминокислотной последовательности был NSP2 (16 замен), для NSP1, NSP3 и NSP4 было показано от 2 до 7 замен, NSP5 был консервативен.
Обсуждение. Полученные результаты согласуются с данными литературы и свидетельствуют об участии генов NSP в поддержании гетерогенности популяции ротавирусов.
Заключение. До 2018 г. генетическое разнообразие ротавирусов в Нижнем Новгороде определялось коциркуляцией штаммов, несущих несколько аллелей гена NSP2, и консервативными генами NSP1, NSP3– NSP5. К концу изучаемого периода в популяции сформировались новые варианты генотипа G9P[8], несущие ранее не встречавшиеся комбинации аллелей неструктурных генов.
475-486
Молекулярно-генетическая характеристика многокомпонентного флавиподобного вируса Kindia tick virus (Flaviviridae), обнаруженного в иксодовых клещах на территории Гвинейской Республики
Аннотация
Введение. Иксодовые клещи – переносчики возбудителей многих инфекционных болезней. Недавно при исследовании клещей Rhipicephalus geigyi, собранных с домашнего скота в Гвинейской Республике, обнаружен новый многокомпонентный флавиподобный РНК-содержащий вирус, получивший название Kindia tick virus (KITV), с необычным механизмом реализации генетической информации.
Цель работы – обнаружение и исследование генетического разнообразия KITV в иксодовых клещах, собранных на территории провинции Киндиа Гвинейской Республики.
Материалы и методы. В 2021 г. с крупного рогатого скота собрано 324 экземпляра клещей видов Amblyomma variegatum, Rh. geigyi, Rh. annulatus, Rh. decoloratus, Rh. senegalensis. Детекция вирусной РНК проводилась в индивидуальных образцах клещей методом ОТ-ПЦР с последующим определением нуклеотидной последовательности и проведением филогенетического анализа.
Результаты и обсуждение. Инфицированность KITV клещей вида Rh. geigyi составила 12,2%, Rh. annulatus – 4,4%, Rh. decoloratus – 3,3%. Однако генетический материал KITV в клещах Am. variegatum, являющихся одним из доминирующих видов в Западной Африке, выявлен не был. Для всех изолятов вируса определена частичная нуклеотидная последовательность каждого из четырёх вирусных сегментов (GenBank, OK345271–OK345306), филогенетический анализ которых показал высокий уровень их тождественности (98,5–99,8%) по каждому из четырёх сегментов вирусного генома с ранее обнаруженными в Гвинейской Республике. Полученные изоляты KITV наиболее генетически близки к Mogiana tick virus, который ранее был обнаружен в Южной Америке в клещах Rh. microplus, и существенно отличаются от других многокомпонентных вирусов, циркулирующих в странах Европы и Азии, в том числе и в Российской Федерации.
Заключение. Генетический материал KITV обнаружен в трёх видах иксодовых клещей, собранных с домашнего скота ряда префектур Гвинейской Республики. Уровень инфицированности клещей составил 3,3–12,2%. Актуальным остаётся продолжение исследований в данном направлении.
487-495
Молекулярно-эпидемиологический анализ геновариантов SARS-CoV-2 на территории Москвы и Московской области
Аннотация
Введение. SARS-CoV-2 – вирус, вызывающий тяжёлое острое респираторное заболевание, появившийся в Китае в конце 2019 г., – продолжает быстро распространяться по всему миру, накапливая мутации и тем самым вызывая серьёзные опасения. В настоящее время уже известно о пяти вариантах вируса, вызывающих озабоченность (variant of concern – VOC): альфа (линия B.1.1.7), бета (B.1.351), гамма (P.1), дельта (B.1.617.2) и омикрон (B.1.1.529). В этой работе мы провели молекулярно-эпидемиологический анализ геновариантов вируса, наиболее часто циркулирующих в Москве и Московской области.
Цель работы – оценить распространение различных вариантов SARS-CoV-2 на территории Москвы и Московской области.
Материалы и методы. Использовали 227 последовательностей генома SARS-CoV-2. Выделение вируса SARS-CoV-2 производили в культуре клеток Vero E6. Секвенирование проводили по методу Сэнгера. Биоинформационный анализ проводили с помощью пакетов программ MAFFT, IQ-TREE v1.6.12, jModelTest 2.1.7, Nextstrain, Auspice v2.34.
Результаты. В результате филогенетического анализа мы выявили основные циркулирующие в России варианты вируса, вызывающие озабоченность на протяжении всего времени существования пандемии, а именно: вариант B.1.1.7, составивший 30% (9/30), AY.122 – 16,7% (5/30), BA.1.1 – 20% (6/30) и B.1.1 – 33,3% (10/30). При исследовании московских образцов на наличие мутаций в структурных белках SARS-CoV-2 разных геновариантов зафиксирована значительная доля наиболее часто встречающихся замен: S-белок – D614G (86,7%), P681H/R (63,3%), E-белок – T9I (20,0%); M-белок – I82T (30,0%), D3G (20,0%), Q19E (20,0%) и, наконец, N-белок – R203K/M (90,0%), G204R/P (73,3%).
Заключение. Изучение частоты и влияния мутаций, а также анализ наиболее часто циркулирующих вариантов вируса важны для разработки и совершенствования вакцин для профилактики COVID-19. Следовательно, необходимо постоянно проводить молекулярно-эпидемиологические исследования, поскольку эти данные представляют важную информацию об изменениях в геноме циркулирующих вариантов SARS-CoV-2.
496-505
Противовирусная и вирулицидная активность дезоксирибонуклеата натрия и его комплекса с железом в отношении вирусов разных царств и семейств
Аннотация
Введение. Актуальнейшей проблемой современной медицины является борьба с острыми респираторными вирусными инфекциями (ОРВИ), для которой необходимы лекарства широкого противовирусного спектра действия, а также средства, повышающие защитные функции иммунного ответа. Подобным эффектом обладают дезоксирибонуклеат натрия (ДНК-Na) и его комплекс с железом (ДНК-Na-Fe), созданные на основе двухнитевой ДНК природного происхождения.
Цель исследования – изучение противовирусной и вирулицидной активности ДНК-Na и ДНК-Na-Fe в отношении вирусов разных царств и семейств.
Материалы и методы. На модели культур клеток, инфицированных вирусами, изучена противовирусная и вирулицидная активность ДНК-Na и ДНК-Na-Fe.
Результаты и обсуждение. Показано, что ДНК-Na и ДНК-Na-Fe обладали противовирусной активностью в отношении аденовируса в концентрациях 250–1000 мкг/мл при профилактической и лечебной схеме введения препаратов. Противовирусный эффект не был обнаружен в случае вируса полиомиелита ни при какой схеме введения обоих препаратов. ДНК-Na и ДНК-Na-Fe обладали противовирусной активностью в отношении коронавируса при всех схемах введения. ЭК50 для ДНК-Na – ~ 2500 мкг/мл, для ДНК-Na-Fe – ~ 1000 мкг/мл. В клетках, обработанных ДНК-Na-Fe, обнаружена секреция цитокинов: провоспалительных – ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-18, ИФН-α, ИФН-γ и противовоспалительных – ИЛ-4, ИЛ-10, антагониста рецептора ИЛ-1. Очевидно, что ДНК-Na и ДНК-Na-Fe обладают противовирусным эффектом, однако механизм действия, по-видимому, не связан со специфическим воздействием на репликацию вирусов. Установлено наличие вирулицидной активности препаратов в отношении представителей семейств Coronaviridaе, Adenoviridae, Picornaviridae, Retroviridae, Herpesviridae в суспензионном тесте in vitro при концентрации 1000 мкг/мл в пределах 1,0–3,0 lg ТЦИД50.
Заключение. Наличие у ДНК-Na и ДНК-Na-Fe одновременно противовирусной и вирулицидной активности в отношении адено- и коронавирусов позволяет рассчитывать на их перспективность в профилактике и лечении ОРВИ.
506-515
Адъювантное действие дисперсного фуллерена С60 на иммунный ответ против конструкций, имитирующих аминокислотные и нуклеотидные последовательности неструктурного белка NS5B вируса гепатита С
Аннотация
Введение. Вакцина против гепатита С пока не разработана. Рекомбинантные белки и плазмиды, кодирующие белки вируса гепатита С (ВГС), – компоненты кандидатных вакцин – индуцируют слабый иммунный ответ и требуют использования адъювантов.
Цель работы – изучить адъювантную способность водного раствора фуллерена С60 при иммунизации мышей рекомбинантным белком NS5B (rNS5B) ВГС – РНК-зависимой РНК-полимеразой, а также плазмидой pcNS5B, экспрессирующей этот белок.
Материалы и методы. Водный раствор дисперсного фуллерена (dnC60) получен методом ультрафильтрации. Мышей C57BL/6 иммунизировали rNS5B подкожно, pcNS5B – внутримышечно в смеси с разными дозами dnC60 трёхкратно, затем оценивали гуморальный и клеточный ответ на ВГС.
Результаты. Показано, что иммунизация мышей rNS5B в смеси с dnC60 в дозах 2–50 мкг/мышь приводила к значительной индукции гуморального ответа: дозозависимый прирост титров антител IgG1 был в 7–20 раз выше. Усиления клеточного ответа к rNS5B при введении с dnC60 не наблюдалось: продукция IFN-γ лимфоцитами, стимулированными in vitro, не увеличивалась; антитела изотипа IgG2a – маркера Th1 звена иммунного ответа – не обнаруживались. Гуморальный ответ на ДНК-иммунизацию был слабым у мышей всех групп, получавших pcNS5B. Клеточный ответ при введении плазмиды в смеси с dnC60 подавлялся. Показана обратная зависимость индекса стимуляции пролиферации лимфоцитов в ответ на специфические стимуляторы in vitro от дозы dnC60, снижение количества клеток, синтезирующих IFN-γ, в реакции ELISpot, сокращение популяции CD8+-лимфоцитов.
Заключение. Дисперсный фуллерен dnC60 представляется весьма обещающим адъювантом для повышения иммуностимулирующей активности слабоиммуногенных белков, к которым относятся белки ВГС, включая поверхностные, важные для протективного ответа. Для повышения способности dnC60 усиливать клеточный иммунный ответ на компоненты кандидатной вакцины необходимы дальнейшие исследования.
516-526
Определение специфического Т-клеточного иммунитета к антигенам вируса SARS-CoV-2 у людей, переболевших COVID-19
Аннотация
Введение. Развитие пандемии, связанной с COVID-19, послужило стимулом к научным исследованиям, направленным на изучение механизмов формирования иммунитета против SARS-CoV-2. В настоящее время имеется необходимость разработки отечественного специфичного, несложного и экономичного метода, пригодного для мониторинга в популяции Т-клеточного ответа в отношении SARS-CoV-2 у переболевших и вакцинированных людей.
Цель работы заключалась в отработке скринингового метода оценки специфического Т-клеточного иммунитета в отношении SARS-CoV-2.
Материалы и методы. Обследованы 40 человек, перенёсших COVID-19 лёгкой или средней степени тяжести, и 20 здоровых добровольцев, не имевших в анамнезе данного заболевания. Серологические исследования по наличию и уровню антител класса IgG и IgM к SARS-CoV-2 проводили методом ИФА на тест-системах АО «Вектор-Бест». Антигенную стимуляцию мононуклеаров проводили на коммерческих планшетах с сорбированным цельновирионным инактивированным антигеном SARS-CoV-2 (ФБУН ГНЦ «Вектор», Россия). Концентрацию IFN-γ определяли методом ИФА на тест-системах АО «Вектор-Бест». Иммунофенотипирование лимфоцитов проводили на проточном цитометре Cytomics FC500 (Beckman Coulter, США). Статистическую обработку данных осуществляли с помощью пакета программ Microsoft Excel и Statistica 10.
Результаты. Стимуляция цельновирионным инактивированным антигеном SARS-CoV-2, фиксированным на дне лунок полистиролового планшета, мононуклеарных клеток, выделенных из периферической крови доноров, показала значительно более высокий медианный ответ по продукции IFN-γ у 40 человек, перенёсших COVID-19, по сравнению с 20 здоровыми донорами крови (172,1 [34,3–575,1] пг/мл против 15,4 [6,9–25,8] пг/мл, р < 0,0001). Не было различий в медианном уровне IFN-γ в супернатантах, собранных с нестимулированных мононуклеарных клеток от переболевших COVID-19 и здоровых доноров (2,7 [0,4–11,4] пг/мл против 0,8 [0,0–23,3] пг/мл; р < 0,05). Общая чувствительность и специфичность метода составляли 73% (95% доверительный интервал (ДИ) 58–88%) и 100% (95% ДИ 100–100%) соответственно при пороговом значении 50 пг/мл.
Заключение. Разработанный способ определения клеточного иммунного ответа на SARS-CoV-2 может быть использован в качестве скринингового для мониторинга в популяции Т-клеточного ответа в отношении новой коронавирусной инфекции у переболевших людей.
527-537
РЕЦЕНЗИИ
Рецензии
Аннотация
В № 5, 2022 журнала «Вопросы вирусологии» в разделе «Редакционная концепция» была опубликована статья «130 лет вирусологии» (Львов Д.К., Альховский С.В., Жирнов О.П. 130 лет вирусологии. Вопросы вирусологии. 2022; 67(5): 357-384. DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-140).
В обзоре представлены основные этапы становления и развития вирусологии как науки в России с акцентом на наиболее значимых достижениях отечественных вирусологов в борьбе с вирусными инфекционными заболеваниями человека и животных
В редакцию поступили следующие рецензии и отзывы на статью.
538-540
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС77-77676 от 29.01.2020.