Adjuvant effect of dispersed fullerene C60 on the immune response to constructs harboring amino acid and nucleotide sequences of hepatitis C virus nonstructural NS5B protein

Full Text

Введение

Гепатит С признан одной из главных причин хронических заболеваний печени, включая терминальные стадии – цирроз и гепатокарциному. До 80% случаев острого гепатита С переходят в хроническую форму, вызывая хронический гепатит С, что объясняется повышенной частотой мутаций вируса гепатита С (ВГС), интерференцией вирусных белков с факторами врождённого и адаптивного иммунитета хозяина, образованием эскейп-вариантов ВГС, ускользающих от иммунного ответа [1].

Долгое время проблема эффективного лечения гепатита С оставалась нерешённой, так как стандартная терапия, основанная на сочетании пегилированного рекомбинантного интерферона (IFN) α и рибавирина, позволяла излечивать не более половины пациентов и сопровождалась серьёзными побочными эффектами [2]. В 2014 г. в терапии гепатита С произошёл прорыв: благодаря применению пангенотипных препаратов прямого противовирусного действия (ПППД), блокирующих вирусные ферменты NS3, NS5В и NS5А, число пациентов с устойчивым исчезновением вируса из периферической крови превысило 95% [3]. Это событие называют новой эрой в лечении гепатита С. Однако со временем выявился ряд фактов, показывающих, что точку в решении проблемы гепатита С ставить рано. Так, ПППД крайне дороги, что делает лечение малодоступным. Исследования последних лет показали, что исчезновение вируса при действии ПППД не приводит к полной нормализации функций лимфоцитов: не восстанавливается пролиферация Т-клеток, продолжается синтез цитокинов, вызывающих воспаление и фиброз, наблюдается экспансия супрессорных клеток [4, 5]. Мало изучены отдалённые последствия блокирования вирусных ферментов, так как ВГС может оставаться в печени и клетках крови после исчезновения вирусной РНК в плазме периферической крови [6, 7]. При лечении ПППД часто отмечается реактивация вирусов других таксономических групп [8, 9]. Успешная элиминация ВГС с помощью ПППД не защищает от реинфекции.

Отсутствие вакцины – главное препятствие в контроле за гепатитом С [10]. Доказано, что эффективная вакцина должна стимулировать мощный мультиэпитопный и функциональный клеточный иммунный ответ, а также индуцировать высокоактивные вируснейтрализующие антитела [11]. Усугубляет проблему разработки вакцин отсутствие адекватной лабораторной модели гепатита С на животных [12]. Поэтому на начальных этапах разработки вакцин используют стандартный подход, который заключается в анализе эффективности иммунного ответа, индуцированного вакцинами, в иммунокомпетентных мышах [13].

Основой для разработки вакцин служат генно-инженерные продукты, имитирующие последовательности ВГС: рекомбинантные белки, пептиды, представляющие В- и Т-клеточные эпитопы, ДНК в составе плазмид и вирусных векторов. Что касается рекомбинантных белков в качестве вакцинных препаратов, то основная проблема состоит в их слабой иммуногенности, в том числе в недостаточной индукции В-клеточного ответа. При ДНК-иммунизации иммунный ответ носит в основном Т-клеточную направленность, тогда как образования антител практически не наблюдается. Несмотря на испытания многочисленных вакцин против гепатита С разного состава, ни одна из них пока не одобрена для применения, что в значительной степени связано с отсутствием высокоэффективных адъювантов [14, 15].

В связи с этим большой интерес представляют углеродсодержащие наноматериалы, в том числе фуллерены [16]. Они нетоксичны, биосовместимы; это сильные антиоксиданты, некоторые из них обладают выраженной противовоспалительной и противовирусной активностью [17–21], могут ингибировать фиброз печени и предотвращать цирроз в экспериментальной крысиной модели [22]. Эти препараты могут повышать иммуногенность за счёт комплексования иммуногена и формирования мультиплетной структуры, а также улучшения транспорта в антигенпрезентирующие клетки с дальнейшим процессингом. Например, фуллеренол – гидроксилированный фуллерен C₆₀(OH)₂₂ – испытывали как адъювант для иммунизации животных вирусными белками и ДНК-вакциной. Результаты показали, что такие наночастицы обладают иммуномодулирующей активностью, усиливая врождённый иммунный ответ через активацию различных Toll-подобных рецепторов дендритных клеток и макрофагов [23, 24]. В последние годы на основе легко масштабируемой зелёной технологии была разработана водорастворимая нанодисперсная форма немодифицированного фуллерена С₆₀ (dnC₆₀); она проявляет противовоспалительный, противовирусный и ранозаживляющий эффекты и относится к группе нетоксичных субстанций [19, 25, 26].

Целью настоящей работы было выяснение способности водного раствора dnC₆₀ оказывать иммуностимулирующее действие при введении мышам компонентов кандидатной вакцины против гепатита С – рекомбинантного белка NS5B ВГС – РНК-зависимой РНК-полимеразы, а также ДНК-конструкции, кодирующей этот белок.

Материалы и методы

Рекомбинантный белок NS5B ВГС (rNS5B) – полноразмерный белок без С-концевого гидрофобного участка, содержащего 21 аминокислотный остаток (а.о.), (2420–3011 а.о., генотип 1b) был экспрессирован в Escherichia coli и очищен на агарозе Ni-NTA (никель – нитрилоацетат), как описано ранее [27]. Его использовали как иммуноген при иммунизации мышей, как антиген для стимуляции Т-клеточных реакций in vitro, а также как сорбент в иммуноферментном анализе (ИФА) для оценки продукции антител.

Синтетические олигопептиды синтезированы в НПО «Иммунотэкс» (БелкиАнтитела.РФ, г. Ставрополь, Россия) с чистотой более 98%, аминокислотные последовательности приведены в таблице. Пептиды имитировали ВГС-специфические эпитопы цитотоксических лимфоцитов (CTL) и Т-хелперов 1-го типа (Th1); их использовали как стимуляторы Т-клеточных реакций in vitro. Поиск эпитопов проводили в соответствии с картированными последовательностями [28–32] с использованием ресурса Immune Epitope Database Analysis Resource¹.

 

Таблица. Характеристика синтетических олигопептидов из региона белка NS5B вируса гепатита С

Table. Characteristics of synthetic oligopeptides from hepatitis C virus NS5B protein

Обозначение Designation	Позиция аминокислотных остатков Amino acid positions	Последовательность Sequence	Характеристика эпитопа Epitope characteristics	Источник Reference
р1	2726–2733	AGLQDCTM	CTL, синтез IFN-γ CTL, IFN-γ release	N. Himoudi и соавт. [28], S. Vertuani и соавт. [32]
р2	2555–2563	TTIMAKNEV	CTL, консервативный CTL, conservative	A. Ikram и соавт. [29]
р3	2576–2584	ARLIVFPDL	CTL, протективный, синтез IFN-γ CTL, protective, IFN-γ release	N. Himoudi и соавт. [28]
р4	2594–2601	LYDVVSKL	CTL, синтез IFN-γ CTL, IFN-γ release	N. Himoudi и соавт. [28], A.C. Tan и соавт. [31]
р5	2820–2827	RHTPVNSW	CTL, протективный CTL, protective	K. Nitschke и соавт. [30]
р6	2423–2430	SYSWTGAL	Th1	A. Ikram и соавт. [29]

 

Плазмида pcNS5В, кодирующая полноразмерный белок NS5B ВГС, получена на основе вектора pcDNA3.1(+) (Invitrogen, США) и описана ранее [33, 34].

Дисперсный фуллерен dnC₆₀. Водный раствор фуллерена (dnC₆₀) был получен ультрафильтрационным методом из высокоочищенного фуллерена (99,95%, «НеоТекПродакт», Россия), как описано ранее [19, 25]. Этот метод обеспечивает высокий выход фуллерена C₆₀ без использования ультразвука и нагревания, при этом гидродинамический размер частиц, определённый методом динамического светорассеяния, составляет около 200 нм. В настоящей работе исходная концентрация стерильного раствора была 1 мг/мл. Дозы рассчитывали с учётом весового содержания С₆₀, определённого по оптической плотности раствора при 340 нм (коэффициент молярной экстинкции 50 200).

Мыши. Для экспериментов in vivo использовали самок мышей инбредной линии C57BL/6 (Н-2^b) в возрасте 6–8 недель (средний вес 20 ± 3 г), полученных из питомника лабораторных животных «Столбовая».

Иммунизация мышей. Проводили две серии экспериментов по испытанию иммуностимулирующей активности dnC₆₀ на модели рекомбинантного белка rNS5B и ДНК-конструкции pcNS5В. Белок rNS5B вводили мышам подкожно в корень хвоста в дозе 4 мкг/мышь либо в физиологическом растворе (ф/р), либо в смеси с dnC₆₀ в дозах 2, 10 и 50 мкг/мышь. Плазмиду pcNS5В вводили в дозе 100 мкг/мышь внутримышечно в четырёхглавую мышцу бедра задних лап, в ф/р или в смеси с dnC₆₀ в дозах 5 и 25 мкг/мышь. Контрольным группам мышей вводили ф/р. Иммунизации проводили трёхкратно с интервалом 2 недели, через 7–9 дней после последней инъекции учитывали иммунный ответ индивидуально для каждой мыши (n = 8 в каждой группе).

Оценка иммунного ответа, гуморальный ответ. Активность взаимодействия антител к белку rNS5B ВГС в сыворотках крови мышей определяли методом непрямого ИФА, как описано ранее [33]. 96-луночные планшеты сенсибилизировали rNS5B в фосфатно-солевом буфере, pH 7,2 (PBS), в концентрации 1 мкг/мл в течение ночи при комнатной температуре. В качестве вторичных использовали антитела к иммуноглобулинам мыши изотипов IgG1 и IgG2a, конъюгированные с пероксидазой хрена (Jackson ImmunoResearch Laboratories, США), в качестве субстрата пероксидазы – тетраметилбензидин (Sigma, США); оптическую плотность измеряли при 450 нм. За титр сывороток в ИФА принимали предельное разведение сыворотки крови, при котором значение оптической плотности при А₄₅₀ в 2 раза превышало значение для контрольного образца (сыворотка крови неиммунизированных мышей).

Анализ пролиферации лимфоцитов иммунизированных мышей проводили in vitro по включению в лимфоциты [³H]-тимидина. Для получения лимфоцитов селезёнки диспергировали, клеточные суспензии процеживали через ситечки с размером пор 100 мкм (BD Falcon Cell Srtainers, США), дважды отмывали в среде RPMI-1640 («ПанЭко», Россия). Лимфоциты помещали в 96-луночные культуральные панели по 5 × 10⁵ клеток в лунку в среде RPMI-1640, содержащую 20% эмбриональной телячьей сыворотки (Invitrogen, США), 2 мМ глутамина, 4,5 г/л глюкозы, 50 мкг/мл гентамицина, 0,2 ед/мл инсулина. К клеткам добавляли стимулятор – рекомбинантный белок NS5B в конечной концентрации 1 мкг/мл и культивировали при 37 °C в атмосфере 5% СО₂ в течение 5 сут. Культуральные жидкости отбирали для анализа цитокинов, в клетки добавляли свежую среду с [³H]-тимидином (1 мкКи/лунка) (ФГБУ «Институт молекулярной генетики НИЦ «Курчатовский институт» РАН). Через 18 ч радиоактивность в клетках измеряли с помощью β-счетчика MicroBeta2 (PerkinElmer, США). Рассчитывали индекс стимуляции пролиферации (ИСП) как отношение радиоактивности (в имп/мин) в лунках со стимуляторами к радиоактивности в лунках со средой.

Измерение концентрации IFN-γ в культуральных жидкостях, полученных после стимуляции лимфоцитов, проводили методом ИФА с помощью наборов Mouse IFN-γ ELISA development kit (HRP) (Mabtech, Швеция) в соответствии с рекомендациями производителя. Концентрацию цитокина определяли по калибровочным кривым стандартных образцов. Предел чувствительности для IFN-γ составлял 2 пг/мл.

Определение количества IFN-γ-секретирующих клеток проводили методом ELISpot c использованием тест-системы Mouse IFN-γ ELISpotPLUS kit (ALP) (Mabtech, Швеция). Изолированные спленоциты (4 × 10 ⁵ клеток в лунке) инкубировали с иммобилизованными на 96-луночных планшетах антителами к IFN-γ мыши течение 2,5 сут при 37 °C в атмосфере 5% СО₂ в присутствии стимуляторов – rNS5B (1 мкг/мл) и пептидов (1 и 5 мкг/мл в двух повторах, данные усредняли). Окрашивание клеток проводили в соответствии с инструкцией. Окрашенные пятна (spots, споты) детектировали визуально с помощью стереоскопического микроскопа МБС-10 (ОАО «ЛЗОС», Россия). Результаты выражали как разницу в количестве спотов на 10⁶ клеток в лунках в присутствии стимуляторов и в контрольных лунках без стимуляторов (со средой).

Определение фенотипа лимфоцитов методом проточной цитометрии. Лимфоциты, выделенные из селезёнок иммунизированных мышей, анализировали методом проточной цитометрии с использованием меченных флуорохромами антител к кластерам дифференцировки CD4 и CD8 (BD Biosciences, США). Окрашивание клеток (10⁶ клеток/проба) проводили по стандартной методике, рекомендованной производителем. Измерения выполняли на проточном цитофлуориметре BD FACSCanto™ II (США), результаты анализировали с помощью программы BD FACSDiva v.6.1.3 (BD Biosciences, США).

Для статистической обработки результатов использовали программы Statistica 8.0 и GraphPad Prism 7. Данные представляли как среднее ± стандартное отклонение. Для сравнения параметрических количественных данных использовали t-test (критерий Стьюдента), непараметрических – U-test (критерий Манна–Уитни). Значения р < 0,05 принимались как статистически значимые.

Результаты

В первой серии экспериментов изучали способность dnC₆₀ в дозах 2, 10 и 50 мкг/мышь проявлять адъювантные свойства при иммунизации рекомбинантным белком rNS5B ВГС. Среднегеометрический титр антител IgG1 к NS5B, введённого в ф/р (группа 1), составил 1 : 10⁵ (рис. 1 а), антител изотипа IgG2a обнаружено не было (титр < 1 : 100). У мышей, которых иммунизировали белком rNS5B ВГС в смеси с dnC₆₀ (группы 2–4), был зарегистрирован дозозависимый эффект увеличения уровня антител IgG1 в 7, 10 и 20 раз соответственно (p < 0,05) (рис. 1 а, б); антитела изотипа IgG2a не выявлялись.

 

Рис. 1. Активность антител изотипа IgG1 к рекомбинантному белку rNS5B вируса гепатита С в сыворотках мышей, иммунизированных rNS5B в смеси с дисперсным фуллереном: а – кривые титрования сывороток в ИФА; б – кратность увеличения титров антител в группах мышей, за единицу принят титр антител в группе 1 (1 : 105). ОП – оптическая плотность при 450 нм.

*Статистически значимые различия (p < 0,05) по сравнению с группой 1, которой rNS5B вводили с физиологическим раствором.

Fig. 1. Activity of IgG1 antibodies to the recombinant HCV rNS5B protein in the sera of mice immunized with rNS5B in a mixture with dispersed fullerene: a – sera titration curves in ELISA; b – the increase of antibody titers in groups of mice, the antibody titer in group 1 (1 : 10⁵) was taken as a unit. OD – optical density at 450 nm.

* p < 0.05 compared to group 1, to which rNS5B was administered with saline solution (saline).

 

Клеточный ответ оценивали по пролиферации лимфоцитов in vitro и секреции ими IFN-γ в ответ на стимуляцию rNS5B. Оба показателя были на низком уровне, варьировали среди индивидуальных мышей, статистически значимо не различаясь как между группами, которым вводили рекомбинантный белок, так и с контрольной группой, которая получала только ф/р (рис. 2).

 

Рис. 2. Клеточный ответ к рекомбинантному белку NS5B в спленоцитах мышей, иммунизированных rNS5B в смеси с дисперсным фуллереном. Пролиферативный ответ лимфоцитов выражен в виде индекса стимуляции пролиферации, секреция IFN-γ – концентрация в пг/мл; индекс стимуляции пролиферации рассчитывали как отношение радиоактивности (в имп/мин) в лунках со стимуляторами к радиоактивности в лунках со средой. Контрольной группе вводили только физиологический раствор.

Fig. 2. Cellular response to recombinant NS5B protein in splenocytes of mice immunized with rNS5B in a mixture with dispersed fullerene. The lymphocyte proliferation is expressed as a stimulation index (SI); IFN-γ secretion is a cytokine concentration in culture fluids by ELISA, in pg/ml; SI was calculated as the ratio of radioactivity (in cpm/min) in wells with stimulants to radioactivity in wells with medium alone. The control group (Control) was administered saline alone.

 

При проведении экспериментов in vivo не было зарегистрировано ни падежа иммунизированных мышей, ни потери ими массы тела. Поведенческие реакции у животных контрольной и опытных групп не различались. Однако при вскрытии животных в группе 4, получивших 50 мкг dnC₆₀, наблюдались жировые отложения на внутренних органах – печени, желудке, селезёнке. При этом органы были слегка увеличены в размерах, нормального цвета. Можно судить о первой (начальной) степени ожирения. Ткань печени и почек при визуальной оценке не была изменена. В связи с этим в следующих экспериментах мы вдвое уменьшили максимально использованную дозу dnC₆₀.

Изучение способности dnC₆₀ проявлять стимулирующую активность проводили при иммунизации плазмидой, кодирующей ген NS5B, фуллерен вводили в дозах 5 и 25 мкг/мышь. Гуморальный ответ на ДНК-иммунизацию был слабым у мышей всех групп, получавших pcNS5B: титры антител к целевому белку обоих изотипов не превышали 1 : 100.

В процессе оценки Т-клеточного иммунного ответа показано, что при стимуляции спленоцитов, полученных от мышей, иммунизированных pcNS5B, была выявлена активная пролиферация лимфоцитов в ответ на rNS5В. При этом ИСП у мышей группы 1 достигал 8 (рис. 3). При иммунизации плазмидой в смеси с dnC₆₀ наблюдалась обратная зависимость показателя ИСП от дозы dnC₆₀.

 

Рис. 3. Снижение пролиферативной активности in vitro спленоцитов мышей, иммунизированных плазмидой pcNS5B с дисперсным фуллереном, в ответ на стимуляцию белком rNS5В. Индекс стимуляции пролиферации рассчитывали как отношение радиоактивности (в имп/мин) в лунках со стимулятором (rNS5B) к радиоактивности в лунках со средой.

*Статистически значимые различия (p < 0,05) по сравнению с контрольной группой, которой вводили только физиологический раствор.

Fig. 3. Reduction of lymphocyte proliferation of mice immunized with pcNS5B plasmid with dispersed fullerene in response to in vitro stimulation by rNS5B protein. The stimulation index (SI) was calculated as the ratio of radioactivity (in cpm/min) in wells with stimulants to radioactivity in wells with medium alone.

*p < 0.05 compared to the control group (Control), which was administered saline alone.

 

Анализ количества лимфоцитов, синтезирующих IFN-γ, проводили in vitro методом ELISpot. В качестве стимуляторов клеток использовали rNS5В и 6 пептидов, имитирующих Т-клеточные эпитопы белка. Как показано на рис. 4, все антигены вызывали формирование спотов в группе 1, в группах 2 и 3 – только один из пептидов и rNS5В, но в значительно меньшем количестве.

 

Рис. 4. Различия в количестве IFN-γ-синтезирующих клеток, полученных от мышей, иммунизированных плазмидой pcNS5B в присутствии/отсутствии dnC60. Результаты представлены как разница в количестве спотов на 106 клеток в лунках со стимуляторами и в контрольных лунках без стимуляторов (со средой); р1–р6 – пептиды, перечисленные в таблице, представляющие последовательности вируса гепатита С.

Fig. 4. Differences in the number of IFN-γ-synthesizing cells obtained from mice immunized with pcNS5B plasmid in the presence/absence of dnC₆₀. The results are presented as a difference in the number of spot-forming cells (SFC) per 10⁶ cells in wells with stimulants and in control wells without stimulants (with medium alone); p1–p6 are peptides listed in Table representing HCV sequences.

 

Подсчёт популяций Т-клеток в селезёнках иммунизированных мышей проводили методом проточной цитометрии. Установлено статистически значимое снижение (р < 0,0001) Th/CD4⁺ во всех экспериментальных группах, получивших плазмиду, по сравнению с контрольной группой, которой вводили только ф/р, показатели не зависели от концентрации dnC₆₀ (рис. 5). В случае CTL/CD8⁺ наблюдалась другая картина: данная популяция клеток была снижена только в группах 2 и 3, иммунизированных с добавлением dnC₆₀ (р < 0,0001).

 

Рис. 5. Определение доли лимфоцитов CD4+ и CD8+ в группах мышей, иммунизированных плазмидой pcNS5В в сочетании с дисперсным фуллереном, методом проточной цитометрии.

*Статистически значимые различия (p < 0,05) по сравнению с контрольной группой, которой вводили только физиологический раствор.

Fig. 5. Determination of the proportion of CD4⁺ and CD8⁺ lymphocytes in the spleen of mice immunized with pcNS5B plasmid in combination with dispersed fullerene by flow cytometry.

*p < 0.05 compared to the control group (Control), which was administered saline alone.

 

Обсуждение

В качестве кандидата для включения в вакцину был выбран неструктурный белок NS5B ВГС, так как это один из важнейших ферментов вируса и мишень для действия ряда ПППД; в нём картировано самое большое число, по сравнению с другими вирусными белками, консервативных Т-клеточных эпитопов, важных для индукции эффективного иммунного ответа [35]. Результаты работы показали высокую эффективность водного раствора дисперсного фуллерена в стимуляции гуморального ответа на белок NSB: при трёхкратном введении прирост титров антител в зависимости от дозы dnC₆₀ был в 7–20 раз выше. Ранее на модели рекомбинантного белка NS4 ВГС мы показали, что водорастворимые производные фуллерена С₆₀ с глюкозаминилмурамилдипептидом и натриевой солью аминокапроновой кислоты на порядок усиливали гуморальный ответ, при этом антиген вводился в дозе в 5 раз большей (20 мкг/мышь) по сравнению с использованной в настоящей работе (4 мкг). Эти препараты, однако, не были эффективны при инъекции малых доз антигена и стимулировали иммунный ответ только после 4–5 иммунизаций [36]. Следует также отметить, что в работе китайских учёных применение C₆₀(OH)₂₂ в сочетании с тремя белками ВГС повышало гуморальный ответ только к одному из них, притом менее значительно (в 4 раза) и после 4 иммунизаций [23].

Введение белка подкожно с максимально использованной дозой dnC₆₀ 50 мкг/мышь вызывало некоторые побочные эффекты. Ранее показано, что при однократном введении фуллерена С₆₀ независимо от пути введения (внутривенный, внутрибрюшинный, интрагастральный) препарат не обладает острым токсическим эффектом в большом диапазоне доз, вплоть до 2700 мкг/мышь [37]. Острой токсичности мы также не наблюдали; возможно, жировые отложения на внутренних органах могут объясняться неоднократной (трёхкратной) иммунизацией, а также путём введения препарата. Интересно, что при изучении противоаллергических свойств dnC₆₀ на модели атопического дерматита у мышей показаны различные эффекты при накожном и подкожном введении препарата: только при накожной экспликации увеличивалась выработка ключевых цитокинов Th1-профиля интерлейкина (IL) 12 и IFN-γ; в большей степени повышалась экспрессия маркера активации Т-регуляторных клеток Foxp3, блокирующих клеточный иммунный ответ [21].

Клеточный ответ к rNS5B при иммунизации белком с dnC₆₀ не усиливался, о чём свидетельствует отсутствие значимого увеличения пролиферации и продукции IFN-γ стимулированными лимфоцитами in vitro, а также антител изотипа IgG2a – маркера Th1 звена иммунного ответа. Для изучения влияния дисперсного фуллерена на клеточный ответ при ДНК-иммунизации мышей иммунизировали плазмидой pcNS5B совместно с dnC₆₀. Установлено, что внутримышечная иммунизация плазмидой в физиологическом растворе вызывает на достаточно высоком уровне пролиферацию лимфоцитов в ответ на специфический антиген и синтез IFN-γ не только к rNS5B, но и к ряду пептидов – эпитопов CTL и Th1. Оказалось, что добавление dnC₆₀ дозозависимо ингибирует клеточный ответ. В группах мышей, получивших плазмиду с дисперсным фуллереном, снижалась доля CD8⁺-лимфоцитов. Доля CD4⁺-лимфоцитов также была снижена по сравнению с контрольными мышами, но не с группой, получившей pcNS5B без dnC₆₀.

Полученные данные согласуются с опубликованными ранее результатами о противовоспалительной активности фуллерена и дополняют их. Так, показано, что некоторые производные фуллерена С₆₀ ингибируют активацию одного из основных провоспалительных транскрипционных факторов NF-κB [38]. С использованием экспериментальной модели на мышах в реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) установлено, что введение dnC₆₀ ингибирует продукцию цитокинов Th1-, Th2- и Th17-профиля [39]. Аналогичные данные получены японскими исследователями: водная наносуспензия кристаллического фуллерена частично подавляла ГЗТ-опосредованное воспаление, при этом также выявлено снижение секреции IL-6, IL-17 и относительный рост популяции T-регуляторных клеток [40].

Заключение

Таким образом, полученные данные демонстрируют, что препарат dnC₆₀ представляется весьма обещающим адъювантом для повышения иммуногенности слабоиммуногенных белков, к которым относятся белки ВГС, включая поверхностные, важные для протективного ответа. Однако для повышения способности dnC₆₀ усиливать клеточный иммунный ответ на компоненты кандидатной вакцины против гепатита С необходимы дальнейшие исследования.

Участие авторов: Масалова О.В. – концепция и дизайн исследования, анализ и интерпретация данных, подготовка текста; Леснова Е.И. – проведение экспериментов; Андреев С.М. – проведение экспериментов, редактирование статьи; Шершакова Н.Н. – проведение экспериментов; Козлов В.В. – проведение экспериментов, анализ и интерпретация данных, редактирование статьи; Пермякова К.Ю. – проведение экспериментов; Демидова Н.А. – проведение экспериментов; Валуев-Эллистон В.Т. – проведение экспериментов; Турецкий Е.А. – проведение экспериментов; Иванов А.В. – проведение экспериментов, редактирование статьи; Николаева Т.Н. – проведение экспериментов, редактирование статьи; Хаитов М.Р. – редактирование статьи; Пронин А.В. – редактирование статьи; Кущ А.А. – концепция и дизайн исследования, редактирование статьи.

Финансирование. Исследование выполнено за счёт государственного бюджета.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Этическое утверждение. Авторы подтверждают соблюдение институциональных и национальных стандартов по использованию лабораторных животных в соответствии с Consensus Author Guidelines for Animal Use (IAVES, July 23, 2010). Протокол исследования одобрен Этическим комитетом ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России (Протокол № 10 от 07.06.2021).

 

¹ T Cell Epitope Prediction Tools. Available from: http://tools.immuneepitope.org/main/tcell/.

About the authors

Olga V. Masalova

Gamaleya NRC of Epidemiology and Microbiology, Ministry of Health of the Russian Federation

Email: ol.mas@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-5571-5669
SPIN-code: 7210-0870

Dr. Sci. (Biology), Leading Researcher, Head of the Laboratory

Россия, 123098, Moscow

Ekaterina I. Lesnova

Gamaleya NRC of Epidemiology and Microbiology, Ministry of Health of the Russian Federation

Email: wolf252006@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2801-6843
SPIN-code: 9901-8607

Researcher

Россия, 123098, Moscow

Sergey M. Andreev

NRC Institute of Immunology FMBA of Russia

Email: sm.andreevj@nrcii.ru
ORCID iD: 0000-0001-8297-579X
SPIN-code: 2542-5260

PhD, Head of the Laboratory

Россия, 115522, Moscow

Nadezhda N. Shershakova

NRC Institute of Immunology FMBA of Russia

Email: nn.shershakova@nrcii.ru
ORCID iD: 0000-0001-6444-6499
SPIN-code: 7555-5925

PhD, Head of the Laboratory

Россия, 115522, Moscow

Vyacheslav V. Kozlov

Gamaleya NRC of Epidemiology and Microbiology, Ministry of Health of the Russian Federation

Email: hyperslava@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-0502-4824
SPIN-code: 6821-2115

Researcher

Россия, 123098, Moscow

Kristina Yu. Permyakova

Gamaleya NRC of Epidemiology and Microbiology, Ministry of Health of the Russian Federation; Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education «Moscow State Academy of Veterinary Medicine and Biotechnology — MVA by K.I. Skryabin»

Email: kristusha164@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3579-4416
SPIN-code: 6220-3425

Junior Researcher, Senior Lecturer

Россия, 123098, Moscow; 109472, Moscow

Natalia A. Demidova

Gamaleya NRC of Epidemiology and Microbiology, Ministry of Health of the Russian Federation

Email: ailande@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1961-9789
SPIN-code: 8759-0277

Researcher

Россия, 123098, Moscow

Vladimir T. Valuev-Elliston

Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences

Email: gansfaust@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0365-570X
SPIN-code: 3492-4501

PhD, Researcher

Россия, 119991, Moscow

Evgeny A. Turetskiy

NRC Institute of Immunology FMBA of Russia; Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: ea.turetskiy@nrcii.ru
Scopus Author ID: 1006824

PhD

Россия, 115522, Moscow; 119991 Moscow

Alexander V. Ivanov

Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences

Email: aivanov@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5659-9679
SPIN-code: 5776-5496

PhD, Leading Researcher

Россия, 119991, Moscow

Tatyana N. Nikolaeva

Gamaleya NRC of Epidemiology and Microbiology, Ministry of Health of the Russian Federation

Email: tatyananik.55@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6226-7251
SPIN-code: 6679-1727

Dr. Sci. (Medicine), Head of the Laboratory

Россия, 123098, Moscow

Musa R. Khaitov

NRC Institute of Immunology FMBA of Russia; Pirogov Russian National Research Medical University

Email: mr.khaitov@nrcii.ru
SPIN-code: 3199-9803

RAS Corr. Member, Professor, Dr. Sci. (Medicine), Director

Россия, 115522, Moscow; 119997, Moscow

Alexander V. Pronin

Gamaleya NRC of Epidemiology and Microbiology, Ministry of Health of the Russian Federation

Email: proninalexander@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-5266-9783
SPIN-code: 5736-5260

Professor, Dr. Sci. (Biology), Director

Россия, 123098, Moscow

Alla A. Kushch

Gamaleya NRC of Epidemiology and Microbiology, Ministry of Health of the Russian Federation

Author for correspondence.
Email: vitallku@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3396-5533
SPIN-code: 6964-1715

Professor, Dr. Sci. (Biology), Leading Researcher

Россия, 123098, Moscow

References

Supplementary files