Adaptation of the sheep pox virus (Poxviridae: Capripoxvirus: Sheeppox virus) to African green monkey kidney cell line and evaluation of its immunobiological properties

Full Text

Введение

Животноводство является одной из важнейших отраслей агропромышленного комплекса Республики Казахстан (РК) и вносит значительный вклад в национальную экономику. С каждым годом поголовье овец в стране увеличивается, что делает оптимальное содержание этих животных чрезвычайно важным. Однако внезапные вспышки инфекционных заболеваний серьёзно препятствуют сохранению и увеличению поголовья мелкого рогатого скота (МРС), повышению продуктивности и улучшению качества продукции, оказывая значительное влияние на экономику страны. К числу таких инфекционных заболеваний МРС относится оспа овец (ОО).

ОО является одной из наиболее распространённых инфекционных болезней среди МРС, классифицированных Всемирной организацией здравоохранения животных (Международное эпизоотическое бюро – МЭБ) как заболевание, подлежащее уведомлению. Болезнь эндемична в Африке (к северу от экватора), на Ближнем Востоке, в Центральной Азии и на Индийском субконтиненте [1, 2]. ОО оказывает значительное влияние на продуктивность МРС из-за снижения удоя молока, повреждения шкур и смертности [3, 4]. Смертность у молодых животных может превышать 50%, а иногда достигать и 100% [5, 6].

По данным МЭБ, в 2021 г. вспышки ОО были зарегистрированы в таких странах, как Турция, Израиль, Китай, Мальдивы, Монголия, Таиланд, Россия, Алжир, Кения, Коморские острова, Тунис и Уганда [7].

Следует отметить, что в 2019 г. в сельском округе Кызылозен Тупкарагайского района Мангистауской области, а также в селе Суюндук Курмангазинского района Атырауской области РК были зарегистрированы вспышки оспы МРС. Благодаря экстренным мерам, принятым ветеринарными службами РК, инфекцию удалось локализовать [8]. Борьба с этим заболеванием жизненно важна для повышения продуктивности МРС. Для профилактики ОО доступны различные типы вакцин, но живая аттенуированная вакцина является лучшим выбором, так как она обеспечивает длительный иммунитет [9]. Использование инактивированной вакцины имеет целый ряд недостатков, таких как высокие дозы и короткая продолжительность иммунитета [10].

Овец в основном иммунизируют живыми вакцинами из аттенуированных штаммов Romania, Bakirkoy, RM65, KSGP O-240 и KSGP O-180. В Северной Африке и на Ближнем Востоке для защиты овец от оспы в основном используется румынский штамм, в то время как в Восточной Африке обычно используются KSGP O-240 и KSGP O-180. В Турции вакцинация овец проводится с использованием штамма Bakirkoy, в то время как в Иране – RM65 [11]. В странах СНГ широко используются штаммы НИСХИ, Б/5-96 и ВНИИЗЖ вируса ОО [12].

Ветеринарная служба РК с целью предотвращения проникновения ОО из соседних или отдалённых стран ежегодно проводит плановую профилактическую иммунизацию овец группы риска живой аттенуированной вакциной против названной инфекции из штамма НИСХИ производства Научно-исследовательского института проблем биологической безопасности (НИИПББ) РК. Согласно технологии производства данной вакцины, балк-продукт получают путём культивирования вакцинного штамма НИСХИ в первично-трипсинизированной культуре клеток почки ягнёнка. Однако системы первичных и диплоидных клеточных культур в настоящее время заменяются использованием перевиваемых клеточных линий. Эти субстраты получают всё большее признание в биотехнологии, поскольку улучшенные технологии скрининга устраняют опасения относительно их потенциальных онкогенных свойств [13]. В то же время современные требования, предъявляемые к эффективности и безопасности ветеринарных препаратов, а также их качественному производству с соблюдением правил GMP (Good Manufacturing Practice – Надлежащая производственная практика) приводят к совершенствованию технологий изготовления вакцинных препаратов, производство которых сводится к культивированию высокоиммуногенных вакцинных штаммов различных вирусов в перевиваемой клеточной линии [14–18].

В связи с этим с целью устранения негативных явлений, связанных с затратами на получение промышленных серий клеточной культуры почки ягнёнка, в качестве клеточного субстрата для культивирования производственного штамма НИСХИ была выбрана перевиваемая клеточная линия Vero. Она является наиболее известной перевиваемой клеточной линией, предназначенной для производства вирусных вакцин для медицинского и ветеринарного применения.

Целью данной исследовательской работы является адаптация штамма НИСХИ вируса ОО к перевиваемой линии клеток Vero.

Материалы и методы

Штаммы

Использован аттенуированный вакцинный штамм НИСХИ вируса ОО с инфекционной активностью 10^5,5 lg ТЦД₅₀/мл. Штамм депонирован в коллекции микроорганизмов НИИПББ (РК).

Вирулентный штамм А вируса ОО в виде органно-тканевого лиофилизированного материала был получен из лаборатории коллекции микроорганизмов НИИПББ (РК).

Культура клеток

Адаптация вакцинного штамма НИСХИ вируса ОО и титрование вирусных материалов были проведены в культуре клеток Vero, полученной из лаборатории клеточной биотехнологии НИИПББ (РК).

Животные и их подготовка к опыту

В опытах использовались овцы тонкорунной казахской породы в возрасте от 6 до 12 мес. с живой массой 18–20 кг, доставленные из хозяйств, благополучных по острым инфекционным заболеваниям, и серонегативных к вирусу ОО.

Перед постановкой экспериментов на животных была проведена их идентификация. Идентифицированные животные были помещены на карантин в течение 1 мес. с термометрией, клиническим обследованием и анализом сыворотки крови на наличие специфических антител к вирусу ОО в соответствии с методом OIE (Office International des Épizooties – МЭБ) [19]. В опыте использовались животные, у которых не было обнаружено специфических антител к вирусу ОО и без истории вакцинации против этой инфекции.

Эксперименты проводились в специально оборудованных помещениях для животных ABSL-2 (Animal Biosafety Level 2). По прибытии в помещения для животных НИИПББ овец пронумеровали и оставили для акклиматизации в течение 2 нед. до начала эксперимента. Каждая группа была помещена в отдельную комнату без прямого контакта друг с другом. Подопытные животные имели свободный доступ к воде и пище на протяжении всего эксперимента.

Авторы подтверждают соблюдение институциональных и национальных стандартов по использованию лабораторных животных в соответствии с Consensus Author Guidelines for Animal Use (IAVES, July 23, 2010). Протокол исследования был одобрен Комитетом по этике экспериментов на животных РГП «Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности» Министерства здравоохранения Республики Казахстан (протокол 1510/14).

Адаптация штамма НИСХИ к перевиваемой линии клеток Vero

Для адаптации штамма НИСХИ вируса ОО к перевиваемой линии клеток Vero проведено 10 последовательных пассажей вируса на данной культуре. В процессе работы культуры клеток Vero, выращенные на матрасах площадью 300 см², были инфицированы вирусом ОО в дозе 0,1 ТЦД₅₀/кл. В качестве поддерживающей питательной среды использована среда DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium), содержащая 2% фетальной бычьей сыворотки. Инфицированные культуры клеток ежедневно контролировались с помощью светового микроскопа для обнаружения характерных к вирусу ОО цитопатических изменений в монослое клеток. В качестве контроля были использованы неинфицированные матрасы с культурой клеток из этой же партии, в которых через двое суток была проведена смена питательной среды.

По достижении цитопатического действия в монослое культуры клеток Vero на 85–90% матрасы подвергались двум циклам замораживания/оттаивания в пределах от –40 °C до комнатной температуры. Сбор вируссодержащих материалов (ВСМ) каждого пассажа проводился в стерильные флаконы в асептических условиях. Одновременно из каждого флакона с ВСМ отбирались пробы для определения биологической активности вируса в соответствии с методом Ж.Т. Амановой и соавт. [20]. Титр вируса был рассчитан с использованием метода I.J. Reed и H.A. Muench и был указан в lg ТЦД₅₀/см³ [21]. Стерильность ВСМ каждого пассажа была определена согласно ГОСТ 28085-2013 [22].

Определение специфичности штамма НИСХИ

Специфичность штамма НИСХИ, адаптированного к клеточной линии Vero, определялась проявлением цитопатических изменений, специфичных для вируса ОО, а также с использованием классической тест-системы ПЦР (полимеразная цепная реакция) [23].

Лиофилизация штамма НИСХИ

ВСМ был объединён с комбинацией стабилизирующей среды (пептон – сахароза в конечной концентрации 3–5%) в соотношении 1 : 1 с последующим добавлением антибиотиков (пенициллин 500 000 ЕД и стрептомицин 0,5 г на 1 дм³ смеси). Полученный балк-продукт был разлит в стерильные ампулы по 1,0 см³ с помощью вакуумного шприца и высушен методом лиофилизации согласно методике Ж.Т. Амановой и соавт. [24].

Оценка безвредности штамма НИСХИ

Штамм НИСХИ был протестирован на овцах (3 головы) путём подкожной инъекции штамма в дозе 10⁵ ТЦД₅₀/мл в объёме 1,0 см³. Контрольные животные (3 головы) были иммунизированы по 1,0 см³ подкожно фосфатно-солевым буфером (PBS). Испытуемые животные ежедневно наблюдались клинически, проводился осмотр места аппликации и общего состояния животных с измерением ректальных температур в течение 14 сут.

Вакцинный штамм считался безвредным, если он не вызывал гибели овец и каких-либо клинических признаков заболевания и патологических изменений в месте введения вакцины в течение 14 сут. В то же время у некоторых овец допускалось повышение температуры тела до 41,0 °C в течение 1–4 сут, а у некоторых животных (до 20%) – образование воспалительного отёка в месте инъекции в виде уплотнений (в течение 3–5 сут).

Оценка иммуногенности штамма НИСХИ

Для определения иммуногенности штамма НИСХИ были сформированы 3 экспериментальные группы по 3 головы и 3 контрольные группы по 2 головы овец в каждой. Экспериментальные группы животных были иммунизированы в подмышечную область испытуемым штаммом в дозе 1000 ТЦД₅₀ в объеме 1,0 см³. На 7, 14 и 21-е сутки после введения штамма у животных были отобраны образцы крови для определения титра сывороточных антител к вирусу ОО. В течение вышеупомянутых периодов экспериментальным и контрольным животным внутрикожно в область подхвостовой складки вводился вирулентный штамм А вируса ОО в дозе 1000 ИД₅₀. Экспериментальные овцы клинически наблюдались в течение 14 сут с ежедневной термометрией.

Иммуногенность штамма НИСХИ оценивали в реакции нейтрализации по наличию антител к вирусу ОО [20], а также по результатам контрольных заражений вирулентным штаммом ОО.

Статистическая обработка результатов исследования

Статистический анализ проводился с использованием Prism 8.0.1 Release Notes от GraphPad. Результаты серологического теста после вакцинации обеими вакцинами, а также разница между группами после заражения контрольным вирусом были проанализированы с помощью двустороннего теста ANOVA. Значение p ≤ 0,05 считалось статистически значимым. Разница в эффективности между группами вычислялась с помощью одностороннего точного критерия Фишера для двух пропорций при уровне значимости α < 0,05.

Результаты и обсуждение

В ходе работы по адаптации штамма НИСХИ вируса ОО к перевиваемой линии клеток Vero было проведено 10 последовательных пассажей (рис. 1). Начиная с первого пассажа, наблюдалось размножение вируса ОО, однако в первых двух пассажах признаки деструктивных изменений клеток проявлялись на 3-и сутки культивирования, тогда как в остальных пассажах первые признаки цитопатических клеточных изменений, характерные для вируса ОО, были отмечены на 2-е сутки культивирования. На 5–6-е сутки культивирования вируса ОО 80–90% клеточного пласта было им разрушено, при этом цитопатогенное действие вируса проявлялось в виде округлых клеток, которые впоследствии образовали очаги и на 5–6-е сутки культивирования отделились от стенок матраса, образуя окошки (рис. 2).

 

Рис. 1. Динамика накопления инфекционной активности штамма НИСХИ в культуре клеток Vero. *Максимальный титр вируса. **Минимальный титр вируса.

 

Рис. 2. Цитопатическое действие вируса оспы овец на культуре клеток Vero: а – контрольная культура клеток Vero; б – инфицированная вирусом оспы овец культура клеток Vero.

 

Биологическая активность штамма НИСХИ постепенно повысилась до 5-го пассажа. В последующих пассажах (от 6-го до 10-го) титр вируса ОО колебался от 6,17 до 6,33 lg ТЦД₅₀/мл. В то же время ВСМ ОО с наибольшей активностью был получен на 5-м пассаже с титром 6,50 lg ТЦД₅₀/мл, тогда как ВСМ ОО с наименьшей активностью был получен на начальном пассаже с титром 5,50 lg ТЦД₅₀/мл.

На основании полученных результатов исследований для последующих экспериментов использовали ВСМ, полученный на 5-м пассаже с титром 6,50 lg ТЦД₅₀/мл.

Для определения специфичности штамма НИСХИ, адаптированного к клеточной линии Vero, использовали пробы ВСМ ОО, полученные до 5-го пассажа. Результаты представлены в табл. 1.

 

Таблица 1. Результаты ПЦР-исследования на наличие вируса оспы овец в пробах вируссодержащих материалов

Table 1. Results of a PCR testing for sheep pox virus in samples of virus-containing material

Исследуемый агент Research material	Пассажный уровень Passage	Наличие ДНК вируса оспы овец The presence of the DNA of the sheep pox virus
Штамм НИСХИ вируса оспы овец Strain NISHI of sheep pox virus	1-й	+
	2-й	+
	3-й	+
	4-й	+
	5-й	+
	K+	+
	K–	–

Примечание. K⁺ – положительный контроль; K^– – отрицательный контроль; «+» – положительный; «–» – отрицательный.

Note/ K⁺ – positive control; K^– – negative control; «+» – positive; «–» – negative.

 

ДНК вируса была обнаружена во всех пробах ВСМ ОО. Следовательно, во время пассирования вируса ОО на культуре клеток Vero были получены ВСМ, специфичные для данного вируса.

Лиофилизация штамма НИСХИ, адаптированного к линии клеток Vero

ВСМ ОО (100 мл) с биологической активностью 6,50 lg ТЦД₅₀/мл, полученный на 5-м пассажном уровне, объединяли с комбинацией стабилизирующей среды «пептон – сахароза» (в конечной концентрации 3–5% соответственно) в соотношении 1 : 1, добавляли антибиотики (пенициллин 50 000 ЕД и стрептомицин 0,05 г на 100 см³ смеси) и разливали в стерильные ампулы по 1,0 см³ с помощью вакуумного шприца. После готовый балк-продукт высушивали методом лиофилизации. Биологические и физические характеристики лиофилизированного штамма НИСХИ представлены в табл. 2.

 

Таблица 2. Биологические и физические характеристики лиофилизированного штамма НИСХИ

Table 2. Biological and physical characteristics of the lyophilized NISKНI strain

Наименование вируса Name of the virus	Титр вируса после лиофилизации, lg ТЦД50/мл Virus titer after lyophilization, lg TCD50/ml	Стерильность лиофилизированого штамма Sterility of the lyophilized strain	Физические показатели вакцины после лиофилизации Physical parameters of the vaccine after lyophilization
Штамм НИСХИ вируса оспы овец NISHI strain of sheep pox virus	6,25 ± 0,00	–	Однородная таблетка светло-коричневого цвета Homogeneous tablet of light brown color

Примечание. «–» – стерильно.

Note. «–» – sterile.

 

Таким образом, был получен стерильный лиофилизированный штамм НИСХИ, адаптированный к культуре клеток Vero, с биологической активностью 6,25 lg ТЦД₅₀/мл.

Оценка безвредности штамма НИСХИ, адаптированного к линии клеток Vero

Подкожное введение вируса ОО в бесшёрстный участок подмышечной области в исходном разведении по 1,0 см³ в дозе 10⁵ ТЦД₅₀/мл не вызывало заболевания и гибели овец в течение 30 сут. Ректальная температура иммунизированных овец была в пределах нормы (рис. 3). Лишь у 3 из 5 овец после вакцинации наблюдались местные реакции в виде уплотнения, которые самостоятельно рассосались в течение 4 сут.

 

Рис. 3. Динамика ректальной температуры овец, иммунизированных штаммом НИСХИ вируса оспы овец. *Местные реакции, возникшие после введение штамма у 3 овец, наблюдались в течение 5 сут.

 

Таким образом, штамм НИСХИ вируса ОО, адаптированный к перевиваемой культуре клеток Vero, является безвредным для овец.

Оценка иммуногенности штамма НИСХИ, адаптированного к линии клеток Vero

Через 7, 14 и 21 день после введения штамма НИСХИ в экспериментальных группах животных титр нейтрализующих антител к гомологичным агентам находился в диапазоне 1,8–4,33 log₂. В крови контрольных овец антитела к вирусу ОО отсутствовали (рис. 4).

 

Рис. 4. Титры вируснейтрализующих антител у овец, привитых штаммом НИСХИ, по сравнению с контрольными животными.

 

В результате контрольного заражения обеих групп овец вирулентным штаммом А вируса ОО установлено, что овцы опытной группы проявляют устойчивость к вирусу ОО в течение 2 нед. При этом животные оставались здоровыми, за исключением припухлостей у 3 овец в месте инъекции вирулентного вируса размером 1,0 × 1,2 см, которые рассосались через 3–4 дня после заражения. Температура тела овец была в пределах физиологической нормы (рис. 5).

У контрольных животных первичные клинические поражения с развитием местной реакции в виде отёка плотной консистенции размером до 4 × 5 см начались на 2–3-й день после контрольного заражения. На 5-е сутки ректальная температура инфицированных овец достигла 40,8 °C. Пик пирексии (˃ 41,2 °C) был отмечен на 7-е сутки после заражения. Ректальная температура у больных животных начала нормализовываться на 11–12-е сутки после контрольных испытаний (рис. 5).

 

Рис. 5. Динамика изменения ректальной температуры овец опытной и контрольной групп после контрольного заражения вирулентным штаммом А вируса оспы овец. Пунктирная линия на графике показывает верхний предел нормальной температуры тела; пп – пик пирексии у контрольных овец; 1у – на 9-е сутки одна овца усыплена в связи с ухудшением общего состояние. *Срок местных реакций, возникшие после инфицирование овец опытной и контрольной групп.

 

На 5-е сутки одновременно с лихорадкой у всех подопытных животных наблюдались водянистые и слизисто-гнойные выделения из глаз и носа, а также поражения кожи (красные высыпания) диаметром 0,5–0,7 см на внутренней поверхности кожи передних и задних конечностей, коже вымени. У большинства больных животных (70%) наблюдалась потеря аппетита. На 9-е сутки одна овца контрольной группы (отобранная на 21-е сутки) была гуманно усыплена после контрольного заражения в связи с ухудшением общего состояния. В дополнение к вышеуказанным клиническим признакам у вынужденно усыпленной овцы наблюдались затрудненное дыхание, периодический кашель, а также умеренная депрессия. Выздоровевшие животные (5 голов) по истечении срока контрольных испытаний (14 сут) были обработаны антибиотиками и содержались в карантине до полного выздоровления.

Таким образом, было установлено, что штамм НИСХИ, адаптированный к перевиваемой культуре клеток Vero, при однократной иммунизации формирует у овец напряжённый иммунитет, обеспечивающий надежную защиту от ОО.

Заключение

Анализируя полученные данные, можно заключить, что штамм НИСХИ сохраняет свои вирусологические и иммунобиологические свойства при репродукции в перевиваемой линии клеток Vero, что позволяет использовать данную клеточную линию для культивирования штамма НИСХИ при изготовлении профилактического препарата против ОО.

Участие авторов: Аманова Ж.Т. – анализ литературных данных, оформление статьи, проведение экспериментов, концепция и дизайн исследования; Саметова Ж.Ж. – проведение экспериментов, постановка серологических реакций; Булатов Е.А. – руководство, планирование, обработка результатов исследований, одобрение окончательного варианта статьи для публикации.

Финансирование. Работа выполнена в рамках государственного задания «Услуги по обеспечению биологической безопасности в сфере науки» на 2022 г.

Благодарности. Авторы выражают признательность руководству РГП «Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности» Министерства здравоохранения Республики Казахстан и сотрудникам лаборатории технологии культивирования микроорганизмов.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией.

Этические утверждение. Авторы подтверждают соблюдение институциональных и национальных стандартов по использованию лабораторных животных в соответствии с Consensus Author Guidelines for Animal Use (IAVES, July 23, 2010). Протокол исследования был одобрен Комитетом по этике экспериментов на животных РГП «Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности» Министерства здравоохранения Республики Казахстан (протокол 1510/14).

About the authors

Zhanat T. Amanova

Research Institute for Biological Safety Problems of Ministry of Health of the Republic of Kazakhstan

Email: amanova-janka@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3987-6814

Master of Sciences (Biological), Senior Researcher, Laboratory of Microorganism Cultivation Technology

Казахстан, 080409, Gvardeyskiy vill., Zhambyl region, Korday district

Zhanna Zh. Sametova

Research Institute for Biological Safety Problems of Ministry of Health of the Republic of Kazakhstan

Email: sametova_zh.zh@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2332-2841

Master of Sciences (Biotechnological), Researcher, Laboratory of Microorganism Cultivation Technology

Казахстан, 080409, Gvardeyskiy vill., Zhambyl region, Korday district

Yerbol A. Bulatov

Research Institute for Biological Safety Problems of Ministry of Health of the Republic of Kazakhstan

Author for correspondence.
Email: erbol_km@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8543-4219

сandidate of Sciences (Biological), head of the laboratory of Microorganism Cultivation Technology

Россия, 080409, Gvardeyskiy vill., Zhambyl region, Korday district

References

Supplementary files