The elisa system based on the specific class Y (IgY) antibodies from egg yolks for the quantitative determination of D-antigen in inactivated poliovirus vaccines

Full Text

Введение Заключительный этап программы ВОЗ по глобальному искоренению полиомиелита предусматривает изменения в стратегии вакцинации: прекращение иммунизации с помощью оральной полиовирусной вакцины (ОПВ) и разработку более безопасных процессов изготовления инактивированных полиовирусных вакцин (ИПВ) и приемлемых стратегий их использования [1]. Известные недостатки ОПВ (в течение многих десятилетий «вакцина выбора» для достижения целей программы ВОЗ) - возникновение случаев вакциноассоциированного полиомиелита и возможность формирования вакцинородственных штаммов с повышенной нейровирулентностью и способностью к трансмиссии, делают неприемлемым ее использование для рутинной иммунизации на заключительном этапе выполнения программы. Новый стратегический план ВОЗ по искоренению полиомиелита предусматривает повсеместное внедрение хотя бы одной дозы ИПВ, в последующем ИПВ будет основным средством профилактики полиомиелита [1]. Создание любого варианта ИПВ (на основе «диких», аттенуированных, генетически модифицированных и т. д. штаммов полиовирусов) неизбежно связано с разработкой метода количественного определения D-антигена (выражается в D-антигенных единицах, DU/ДАГ ЕД) - основного показателя потенциальной способности вакцины индуцировать защитный иммунитет (вируснейтрализующие антитела - АТ) у вакцинированных лиц. Ведущие производители коммерческих ИПВ (например, Sanofi Pasteur, Франция; GlaxoSmithKline, Великобритания) для количественного определения D-антигена используют различные варианты иммуноферментного анализа (ИФА) собственной разработки. Эти системы ИФА основаны на специфических поликлональных АТ млекопитающих, в частности кроликов [2]. Однако известно, что использование АТ млекопитающих (кролики) для систем ИФА сопряжено с рядом негативных моментов, прежде всего с возможностью неспецифических взаимодействий данных АТ с другими компонентами ИФА (вторичные АТ, ферментный конъюгат), что выражается в высоком неспецифическом фоне и получении ложноположительных результатов анализа [3, 4] . Исходя из этого, в данном сообщении мы представляем результаты разработки первой отечественной системы ИФА для количественного определения D-антигена полиовирусов, основанной на использовании специфических АТ класса Y (IgY) яичных желтков («IgY-технология») [4]. Материалы и методы Иммунные препараты. Несущихся куриц породы Леггорн (4-6-месячного возраста) иммунизировали 3 раза с интервалом в 2 нед по 1 мл антигена, который представлял собой в 10 раз сконцентрированную полную (типы I-III «дикого» по- лиовируса) коммерческую инактивированную полио- вирусную вакцину производства Sanofi Pasteur (Франция), в 4 точки пекторальных мышц без адъюванта [5, 6] . Отложенные яйца маркировали и хранили при температуре 4°С, либо выделяли желтки и хранили их при -20°С. Препараты IgY (из желтков, полученных через 2 нед после 3-й иммунизации) получали высаливанием сульфатом натрия (Na2SO4) по методу E. Akita и со- авт. [7] с последующей аффинной очисткой на колонке HiTrap (Amersham) согласно инструкции производителя. Концентрацию тотального IgY определяли при 280 нм. Препараты IgY стерилизовали фильтрацией (фильтры с диаметром пор 0,45 мкм), хранили при 4°С и использовали в ИФА как универсальный иммуносорбент (против типов I-III полиовируса). Для получения моноспецифических иммунных сывороток против полиовирусов использовали рандомбред- ных кроликов породы Шиншилла (масса 2,5-3 кг, возраст 3 мес). Вируссодержащие осветленные культуральные жидкости клеток RD, инфицированные "дикими" полиовирусами I типа (Mahoney), либо типа II (MEF-1), либо III типа (Saukett) с титром 8 lg ТЦД/1 мл вводили по следующей схеме. Первая иммунизация: 5 мл вируса внутривенно (в/в) и 5 мл вируса + 5 мл адъюванта (вазелиново-ланолиновая эмульсия) внутримышечно. Через 3 нед 2-я иммунизация: 10 мл вируса в/в без адъюванта; затем 3-я-6-я иммунизация в/в по 10 мл без адъюванта (интервал между 2-й и 3-й - 3 нед, между 3-й и 4- й - 2 нед, между 4, 5 и 6-й - 5 нед. Через 7 дней после 6- й иммунизации производили забор крови. Аффинно- очищенные препараты IgG из сывороток получали на колонке HiTrap Protein A (Amersham) согласно инструкции производителя. Концентрацию тотального IgG определяли при 280 нм. Препараты IgG стерилизовали фильтрацией (фильтры с диаметром пор 0,45 мкм), хранили при 4°С и использовали в ИФА в качестве вторичных (детекторных) АТ для каждого типа полиовируса. Специфическую активность (авидность) очищенных IgY из желтков и IgG из сывороток кроликов определяли в реакции микронейтрализации (РН) против стандартных препаратов полиовирусов Сэбин типов I-III (препараты получены из Национального института биологических стандартов и контроля - NIBSC, Великобритания) на культуре клеток HEp-2 согласно рекомендациям ВОЗ [8]. Система ИФА для количественного определения D-антигена полиовирусов Иммунопанели Costar (кат. № 9018) сенсибилизировали 18 ч при 4°С аффинно- очищенным IgY против трех типов «диких» полиовирусов (поливалентный иммуносорбент) в концентрации 20 мкг/мл в карбонат-бикарбонатном буфере, pH 9,6 (Sigma, кат. № C3041-100 CAP). После 3-кратной отмывки 0,05% Tween-20 в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) и блокирования свободных сайтов 1% сывороткой теленка (Gibco) в ФСБ в течение 1 ч при 37°С и 3-кратной отмывки вносили анализируемые препараты D-антигена: ИПВ Sanofi Pasteur (в качестве референс-образца), экспериментальные серии ИПВ на основе штаммов Сэбина (разработка ФГУП «ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН»). Препараты D-антигена разводили, начиная с 1:4-1:8 в ИФА-буфере (1% сыворотка теленка в ФСБ с 0,05% Tween-20). Негативный контроль - ИФА-буфер. После 4,5-1 43,532,521,510,50- 8 16 32 64 128 256 512 1024 2048 4096 С-ИПВ Sanofi Pasteur Негативный контроль (ИФА-буфер) ИФА: результаты титрования D-антигена в экспериментальной серии С-ИПВ и коммерческой ИПВ Sanofi Pasteur. а - I тип; б - II тип; в - III тип. По оси абсцисс - разведение (обратные величины; по оси ординат - ОП (450 нм). Результаты контроля специфичности ИФА методом «блока» при определении содержания D-антигена полиовируса в коммерческой ИПВ Sanofi Pasteur Тип Разведение типоспецифической "блокирующей"/неиммунной сыворотки (обратные величины) 10 20 40 80 160 320 I 1,337*/0,344** 1,342/0,359 1,338/0,370 1,357/0,421 1,345/0,529 1,332/0,607 II 0,934/0,203 0,929/0,254 0,931/0,366 0,936/0,510 0,926/0,629 0,948/0,814 III 0903/0,435 0,889/0,499 0,881/0,610 0,896/0,766 0,891/0,763 0,893/0,814 Примечание. * - оптическая плотность (450 нм) образца D-антигена в разведении 1:10 при инкубации с разведениями: * - неиммунной сыворотки, ** - типоспецифической. инкубации в течение 2 ч при 37°С (или 18 ч при 4°С) и 5-кратной отмывки вносили вторичные АТ: аффинно- очищенные препараты IgG кролика против соответствующего типа полиовируса в ИФА-буфере в рабочем разведении, подобранным шахматным титрованием. После инкубации в течение 1 ч при 37°С и 5-кратной отмывки вносили пероксидазный конъюгат против IgG кролика (Sigma, кат. № A1949-1VL) в ИФА-буфере в рабочем разведении. Инкубировали 1 ч при 37°С, отмывали 5 раз и вносили готовый субстрат TMB (Sigma, кат. № Т0440-100 мл). Инкубировали в течение 30 мин в темноте, реакцию останавливали 1 М серной кислотой. Объем вносимых ингредиентов 0,1 мл. Оптическую плотность (ОП) измеряли при 450 нм (Thermo Scientific Multiscan FC ELISA reader, Thermo Labsystems). Результат (титр D-антигена) считали положительным при значении P/N (ОП опыта/ОП контроля) > 2,1 [9]. Количество D-антигена (DU/ml, ДАГ ЕД/мл) рассчитывали по титру или по отношению к ОП референс-образца (приблизительно). Для точного подсчета используют «метод параллельных линий» (PLA), для которого, однако, необходим референс-образец с максимально достоверным количеством D-антигена [2]. Система ИФА для контроля специфичности определения содержания D-антигена ("блок" ИФА) Данная система повторяет вышеописанную за исключением фазы "блока" - после инкубации с исследуемым образцом D-антигена вносили по 0,1 мл разведений сыворотки (в ИФА-буфере, начиная с 1:10), содержащей АТ к соответствующему типу полиовируса (например, сыворотка мыши), инкубировали 1 ч при 37°С, отмывали 5 раз; дальнейшие процедуры - инкубация с вторичными АТ, конъюгатом и т. д., проводили согласно вышеописанному. В контрольные лунки вносили сыворотку неиммунной мыши в ИФА-буфере в аналогичных разведениях. Результат считали положительным, если ОП лунок с D-антигеном после инкубации со специфической сывороткой снижалась на > 50% по сравнению с таковой неиммунной сыворотки [10], подтверждая специфичность связи D-антигена с иммуносорбентом (IgY) и вторичными АТ (типоспецифическими IgG кролика). Результаты Специфическая активность (авидность) иммунных препаратов в реакции нейтрализации против штаммов Сэбина (титры вируснейтрализующих АТ). Препарат IgY (поливалентный иммуносорбент): I тип - 1:2371; II тип - 1: 3350; III тип - 1: 355. Препараты IgG кроликов (вторичные АТ): I тип - 1: 1412; II тип - 1: 708; III тип - 1: 596. На рисунке представлены результаты параллельного титрования D-антигена полиовируса трех типов: в коммерческой ИПВ Sanofi Pasteur (смесь I-III типов) и в экспериментальной серии ИПВ на основе штаммов Сэбина (раздельно 1, 2 и 3 типы). ОП (450 нм) негативного контроля (ИФА-буфер) составляет 0,1-0,2 оптической единицы (низкий фоновый сигнал), что достоверно ниже ОП исследуемых образцов D-антигена. Титры D-антигена ИПВ Sanofi Pasteur: > 1:256 для I и II типов и 1: 64 для III типа. Титры D-антигена для экспериментальной серии ИПВ на основе штаммов Сэбина: > 1:4096 для I и II типов и 1:256 для III типа. В таблице представлены результаты проверки специфичности определения содержания D-антигена в коммерческой ИПВ Sanofi Pasteur (метод "блока" ИФА). Тест специфичен, поскольку в результате инкубации с "блокирующими" специфическими сыворотками мышей ОП снижается на > 50% по сравнению с таковой при инкубации с неиммунной сывороткой мыши. При этом титр «блокирующей» сыворотки для I типа равен 1: 320 (снижение ОП на 58%), для II типа - 1:80 (снижение ОП на 50%), и для III типа - 1:10 (снижение ОП на 54%). Обсуждение Представленная система ИФА для количественного определения D-антигена полиовирусов является первой отечественной системой такого рода (до настоящего времени определение содержания D-антигена для практики вакцинологии в России было просто не востребовано в связи с исключительным применением ОПВ). Использование «IgY-технологии» отвечает современным тенденциям конструирования диагностических систем и доказанным преимуществами АТ класса Y [3, 4]. Ранее мы сообщали о получении препаратов IgY из куриных желтков в качестве иммунных реагентов к вирусу клещевого энцефалита [5], данное сообщение подтверждает эффективность использования АТ птиц для конструирования систем ИФА, предназначенных для определения вирусных антигенов. Приготовление поливалентного иммуносорбента для связывания D-антигена полиовирусов трех типов - достаточно простая процедура: три иммунизации куриц (без адъюванта), обеспечивающие высокий выход IgY (не ниже 10 мг/мл в очищенном препарате одного желтка; специфический IgY составляет примерно 10% общего белка [4]). Отсутствие (на уровне ИФА) перекрестных реакций между D-антигенами полиовируса трех типов оправдывает использование поливалентного иммуносорбента и упрощает конструирование системы ИФА. При оценке специфической активности иммунных препаратов для конструирования системы ИФА такого рода следует ориентироваться прежде всего на данные функционального теста (реакция нейтрализации), а не на результаты стандартного варианта ИФА для определения содержания АТ, поскольку для полиовирусов корреляция между уровнем РН-титров и титров ИФА низка [10]. Исключение составляют специальные варианты ИФА (например, вариант «Binding Inhibition», симулирующий РН [10]). Представленные в «Результатах» данные по специфической активности иммуносорбента и вторичных IgG (титры вирус- нейтрализующих АТ) свидетельствуют о том, что данные уровни титров позволяют конструировать систему ИФА с чувствительностью примерно 0,3 ДАГ ЕД/мл, что более чем достаточно для систем такого рода. Таким образом, представленная система ИФА может использоваться для количественного определения D-антигена в процессе изготовления ИПВ. Система специфична, демонстрирует низкий уровень фона в негативном контроле и четкий специфический сигнал.

References

Supplementary files