Research of supression of the herpes simplex virus reproduction with drug resistance by combination phosphite of acycloguanosine with some antiherpetic drugs

Full Text

Введение Для лечения и предотвращения рецидивов инфекций, вызываемых вирусом простого герпеса 1-го и 2-го типов (ВПГ-1 и ВПГ-2) и вирусом варицелла зостер (ВЗВ), используют высокоэффективные этиотропные лекарственные средства, относящиеся к классу модифицированных нуклеозидов (препараты ацикловира (АЦВ), ва- лацикловир, пенцикловир, фамцикловир) [1]. Развитие лекарственной резистентности вирусов к этой группе ингибиторов главным образом у иммунокомпромисс- ных пациентов может существенно снижать эффективность антивирусной химиотерапии [2-4]. Лечение категории пациентов с данной патологией осложняется тем, что резистентность ВПГ/ВЗВ к модифицированным ну- клеозидам в подавляющем большинстве случаев носит перекрестный характер, т. е. развитие резистентности к одному из препаратов приводит к резистентности к остальным ингибиторам этой группы [5, 6]. Единственным препаратом выбора в этом случае является фоскар- нет (препарат фосфономуравьиной кислоты - ФМК) [2, 3] , высокотоксичный для макроорганизма. Кроме того, следует учитывать возможность перекрестной резистентности у ВПГ/ВЗВ к модифицированным нуклео- зидам и ФМК одновременно. Такие клинические изоляты были описаны [7, 8]. В связи с вышеизложенным поиск эффективных и безвредных соединений, которые способны эффективно ингибировать репродукцию вариантов ВПГ и ВЗВ, резистентных к АЦВ и родственным ему соединениям, сохраняет актуальность. Ранее мы показали, что фосфит ациклогуанозина (Ф-АЦГ) одинаково эффективно ингибирует репродукцию как чувствительного, так и резистентных к АЦВ штаммов ВПГ, включая клинические изоляты ВПГ, циркулирующие в человеческой популяции в настоящее время [9, 10]. Использование комбинаций противовирусных агентов с различным механизмом действия позволяет не только ингибировать репродукцию ВПГ с лекарственной резистентностью, но и предотвратить или существенно снизить скорость формирования подобных штаммов [11]. Такая стратегия хорошо зарекомендовала себя при проведении антиретровируной химиотерапии [12-14]. Цель исследования - поиск комбинаций противогерпе- тических агентов, включающих Ф-АЦГ, характеризующихся взаимоусиливающим характером воздействия на герпетическую инфекцию и сохраняющих активность в отношении штаммов ВПГ-1, резистентных к АЦВ. Изучали комбинации Ф-АЦГ с традиционными, имеющими практическое значение соединениями, активными в отношении резистентных к АЦВ штаммов ВПГ-1. Материалы и методы Препараты. В работе использовали следующие препараты: Ф-АЦГ (Н-фосфонат 9-(2-гидроксиэтоксиметил) гуанина) синтезирован в Институте молекулярной биологии. а-интерферон (а-ИФН, Реаферон-ЕС для инъекций сухой ЗАО «Вектор-Медика» лиофильный препарат а-ИФН со специфической активностью 3 000 000 МЕ/амп. (п. Кольцово Новосибирской обл.); ФМК производства Sigma Aldrich (США); АраА (9-р^-аденинарабинозид. видаробин) производства Calbiochem (США); цидофовир (ЦДВ, ^)-1-(3-гидрокси-2-фосфонилметоксипропил) цитозин производства Sigma Aldrich (США); глицир- ризинат аммония однозамещенный (ГЛН, глицирам, Glycyram, производства «Химфарм ОАО», Казахстан); рибавирин (Rib; 1-Р^-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3- карбоксамид) производства ICN Switzerland AG, Швейцария. Вирусы. ВПГ-1, штамм L2 (ВПГ-1/L) получен из Государственной коллекции вирусов НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского. ВПГ-1/Ь2/АЦВк, резистентный к АЦВ (ИД 50 > 100 мкг/мл), получен нами путем серийного пассирования ВПГ-1/Ц в присутствии АЦВ и подробно охарактеризован ранее [9]. Цитотоксичность оценивали методом окрашивания клеток трипановым голубым. За величину ЦД50 принимали концентрацию, в присутствии которой погибает 50% клеток при продолжительности инкубации 72 ч [9, 10]. Противовирусную активность соединений и их комбинаций оценивали микрометодом по их способности защищать инфицированные клетки от гибели путем предотвращения развития вирусиндуцированного цито- патического эффекта (ЦПЭ) в соответствии с методом E. De Clercq и соавт. [15], как описано нами ранее [9, 10]. Монослойную культуру клеток Vero Е6, выращенную в пластиковых 96-луночных планшетах (Linbro, Flow lab- Таблица 1 Противогерпетическая активность ряда соединений, а также их комбинаций на модели ВПГ-1 c различной лекарственной чувствительностью в культуре клеток Vero E6 № Соединение ЦД50, мкг/мл ИД50, мкг/мл ИД95, мкг/мл FIC Эффект 1 Ф-АЦГ > 1000 15,81/31,22 31,25762,52 - - 2 ФМК > 62,5 31,2й 62,5 й - - 3 АраА > 62,5 15,61/31,22 62,512 - - 4 ЦДВ > 62,5 3,91, 2 15,6й - - 5 Rib > 125 2501, 2 5001,2 - 6 ГЛН > 1000 5001, 2 > 10001, 2 - - 7 а-ИФН > 1000 2501, 2 > 10001, 2 - - 8 Ф-АЦГ + ФМК > 15,6 + 31,25 7,8 + 7,8715,6 + 7,82 15,6 + 15,6731,25 + 15,62 0,751/0,752 Синергидный 9 Ф-АЦГ +АраА > 15,6 + 15,6 7,8 + 7,8715,6 + 15,62 15,6 + 15,6731,25 + 31,252 1,01/1,02 Аддитивный 10 Ф-АЦГ + ЦДВ > 62,5 + 7,8 7,8 + 0,97715,6 + 0,782 15,6 + 1,95731,25 + 1,952 0,751/0,702 Синергидный 11 Ф-АЦГ + Rib > 31,25 + 125 7,8 + 31,25715,6 + 31,252 15,6 + 62,5731,25 + 62,52 0,751/0,752 Синергидный 12 Ф-АЦГ + ГЛН > 31,2+1000 3,9 + 250715,6 + 2502 15,6 + 500731,25 + 5002 0,7571,02 Синергидный/аддитивный 13 Ф-АЦГ + а-ИФН > 40 + 500 10 + 12,5715,6 + 502 40 + 50731,25 + 1002 0,701/0,702 Синергидный 14 а-ИФН + ФМК > 1000 + 62,5 62,5 + 15,6х, 2 62,5 + 31,25', 2 0,751, 2 Синергидный 15 а-ИФН + АраА > 1000 + 31,2 100 + 7,87100 + 15,62 100 + 15,67100 + 31,252 0,901/0,902 Синергидный 16 а-ИФН + ЦДВ > 7,8 + 500 31,25 + 0,48х, 2 125 + 1,951, 2 0,251,2 Выраженный синергидный 17 ФМК + ГЛН > 62,5 + 1000 15,6 + 2501, 2 31,25 + 5001 2 1,01,2 Аддитивный 18 ФМК + ЦДВ > 62,5 + 7,8 7,8 + 0,9V1- 2 31,25 + 3,91 2 0,501, 2 Синергидный 19 ФМК + АраА > 62,5 + 31,25 15,6 + 7,8715,6 + 15,62 31,25 + 15,6731,25 + 31,252 1,0 Аддитивный 20 ФМК + Rib > 62,5 + 125 15,6 + 31,25', 2 31,325 + 62,51 2 0,751, 2 Синергидный 21 ЦДВ + АраА > 7,8+15,6 1,95 + 7,8', 2 7,8 + 15,61' 2 1,01/0,752 Аддитивный/Синергидный 22 ЦДВ + Rib > 15,6 + 125 1,95 + 15,6', 2 7,8 + 62,512 0,621, 2 Синергидный 23 ЦДВ + ГЛН > 7,8 + 1000 1,95 + 2501, 2 3,9 + 5001,2 1,01,2 Аддитивный Примечание. Здесь и в табл. 2: концентрация а-ИФН в МЕ/мл. Показатели противовирусной эффективности соединений и их комбинаций: 1 - на модели БПГ-1/Ь2; 2 - на модели ВПГ-1/Е2/АЦБк. Противогерпетическая активность тройных комбинаций ряда соединений на модели ВПГ-1 c различной лекарственной чувствительностью в культуре клеток Vero E6 Соединение ЦД50, мкг/мл ИД50, мкг/мл ИД95, мкг/мл FIC Эффект 24 Ф-АЦГ + а-ИФН + ФМК > 15,6 + 31,25 + 7,8 7,8 + 15,6 + 3,977,8 + 31,25 + 7,82 15,6 + 31,2 + 7,8715,6 + 62,5 + 7,82 0,6870,682 Синергидный/синергидный 25 Ф-АЦГ + а-ИФН + АраА > 31,2 + 250 + 15,6 7,8 + 62,5 + 1,951/5,6 + 62,5 + 3,92 15,6 + 125 + 3,9731,25 + 125+ 3,92 0,871/0,872 Синергидный/синергидный 26 Ф-АЦГ + а-ИФН + ЦДВ > 125 + 250 + 7,8 7,8 + 15,6 + 0,48715,6 + 15,6 + 0,482 15,6 + 31,2 + 0,95731,25 + 31,2 + 0,952 0,6870,682 Синергидный/синергидный 27 Ф-АЦГ + ФМК + ГЛН > 125 + 1000 + 125 7,8 + 7,8 + 125715,6 + 6,25 + 125 15,6 + 15,6 + 250731,25 + 15,6 + 250 1,01/0,952 Аддитивный/склонность к аддитивному 28 Ф-АЦГ + ФМК + ЦДВ > 15,6 + 15,6 + 31,25 3,9 + 3,9 + 1,9577,8 + 3,9 + 1,56 7,8 + 7,8 + 3,91/15,6 + 7,8 + 3,92 0,871/0,772 Синергидный/синергидный 29 Ф-АЦГ + ФМК+ Rib > 31,25 + 62,5 + 250 3,9 + 7,8 + 31,251/7,8 + 7,8 + 31,252 7,8 + 15,6 + 62,5715,6 + 15,6 + 62,51 0,751/0,752 Синергидный 30 Ф-АЦГ + ЦДВ + АраА >15,6 + 1,95 + 3,9 7,8 + 0,97 + 1,95715,6 + 0,97 + 3,92 15,6 + 1,95 + 3,9731,25 + 1,95 + 7,8 0,871/0,872 Синергидный/синергидный 31 Ф-АЦГ +ЦДВ + Rib > 62,5 + 31,25 + 500 3,9 + 1,95 + 31,2577,8 + 1,95 + 31,252 7,8 + 3,9 + 62,5715,6 + 3,9 + 62,52 0,871/0,872 Синергидный/синергидный 32 Ф-АЦГ +ЦДВ +ГЛН > 31,25 + 7,8 + 1000 3,9 + 0,97 + 1251/7,8 + 0,97 + 1252 15,6 + 3,9 + 500731,25 + 3,9 + 5002 0,751/0,752 Синергидный/синергидный 33 Ф-АЦГ + ФМК + АраА > 7,8 + 15,6 + 3,9 3,9 + 7,8 + 1,9577,8 + 7,8 + 1,952 7,8 + 15,6 + 3,9715,6 + 15,6 + 3,92 0,621/0,622 Синергидный/синергидный oratories, Соединенное Королевство Великобритании и Северной Ирландии), инфицировали с множественностью 0,1 БОЕ/кл; продолжительность инкубации составила 48 ч при 370C, при этом в контроле ВПГ развивался 95-100% ЦПЭ, т. е. ЦПЭ охватывал весь монослой клеток. Эффективность препарата количественно выражали как ИД50 и ИД95 - концентрации соединения, ингибирующие развитие вирусиндуцированного ЦПЭ на 50% и практически полностью. При изучении комбинированного действия препаратов определяли их концентрации, которые в сочетании обеспечивают эффекты, соответствующие ИД50 и ИД95. Антигерпетическое действие комбинаций препаратов оценивали путем вычисления индекса FIC (fractional inhibitory concentration) [16]: ИДп соединения А в комбинации FIC= ----------------------------------------------------- + ИД50 соединения А ИД5П соединения В в комбинации + - . ИД50 соединения В Результаты и обсуждение Механизм противогерпетического действия АЦВ и родственных ему соединений связан с двумя вирус- специфическими ферментами - тимидинкиназой (ТК) и ДНК-полимеразой [17]. Соответственно формирование резистентности к этим ингибиторам в большинстве случаев связано с мутациями в гене ТК и гораздо реже в гене ДНК-полимеразы [18]. Мы исследовали комбинации соединений, обладающих противогерпетической активностью и не нуждающихся в активации вирусной ТК, а следовательно, в большинстве случаев одинаково эффективных в отношении как чувствительных, так и резистентных к АЦВ штаммов ВПГ-1. Как видно из данных, приведенных в табл. 1, использование Ф-АЦГ в составе двойных комбинаций с АраА или ГЛН обеспечивает суммирование эффектов противовирусных соединений - при сочетанном использовании минимальная активная доза (ИД50) каждого из соединений равна У ИД50, установленной при их раздельном использовании: FIC, являющийся критерием эффективности сочетанного действия препаратов, равен 1. При использовании Ф-АЦГ в комбинации с а-ИФН, ФМК, или Rib наблюдали взаимоусиливающий эффект. FIC, равный 0,7, 0,75 и 0,75, указывает на то, что при сочетанном использовании этих ингибиторов в меньших концентрациях можно получить более выраженный противовирусный эффект на обеих вирусных моделях (ВПГ-1/Ц и ВПГ-1/Ц/АЦВк) независимо от чувствительности ВПГ к АЦВ. Взаимоусиливающий эффект Ф-АЦГ и ЦДВ в комбинации был более выражен на модели ВПГ-1^2/ АЦВк (FIC = 0,7 по сравнению с FIC = 0,75). Из представленных в табл. 2 результатов следует, что введение в двойные комбинации Ф-АЦГ + ФМК и Ф - АЦГ+ ЦДВ третьего компонента а-ИФН приводит к снижению FIC c 0,75/0,7 до 0,68. При этом становится возможным существенно снизить концентрации ФМК и ЦДВ, высокотоксичных для макроорганизма, при сохранении противовирусной активности комбинации по сравнению с отдельно взятыми соединениями. Величина ИД достигается при использовании Ф-АЦГ+ ФМК + а-ИФН и Ф-АЦГ+ ЦДВ + а-ИФН в концентрациях, равных У, 1/8 и 1/16 ИД50 каждого из соединений на обеих вирусных моделях. Эффект комбинации Ф-АЦГ+АраА+а-ИФН также носит синергидный характер (0,87), превосходящий взаимоусиливающий эффект двойных комбинаций Ф-АЦГ + АраА (1) и АраА + а-ИФН (0,9). Поэтому, несмотря на то, что величина FIC тройной комбинации была выше, чем FIC Ф-АЦГ + а-ИФН (0,7), тройная комбинация представляет интерес, так как благодаря сочетанному использованию этих соединений удается снизить концентрацию наиболее токсичного компонента комбинации - АраА. Сочетанное применение препаратов Ф-АЦГ + ФМК + АраА также способствовало усилению противовирусного эффекта относительно индивидуальных соединений и их соответствующих двойных комбинаций. Выраженность потенцирования противовирусной активности Ф-АЦГ + ЦДВ + ГЛН (FIC = 0,75) была аналогична потенцирующему эффекту двойных комбинаций Ф-АЦГ + ЦДВ (0,75) и Ф-АЦГ + ГЛН (0,75) и превосходила эффект комбинации ЦДВ + ГЛН (1) на модели эталонного штамма ВПГ-1/L На модели резистентного к АЦГ штамма ВПГ-1/Ц/АцВк эффект двойной комбинации Ф-АЦГ + ЦДВ (0,7) незначительно превосходил таковой тройной комбинации (0,75). Комбинации ГЛН с Ф-АЦГ и ЦДВ характеризовались только аддитивным характером взаимодействия (1) на этой вирусной модели. При сопоставлении данных, представленных в табл. 1-2, видно, что комбинация Ф-АЦГ + ФМК + ГЛН также способна ингибировать развитие ЦПЭ, индуцированного АЦВ-резистентным штаммом ВПГ-1. Однако в этом случае полученный эффект соответствовал аддитивному, тогда как эффект Ф-АЦГ в сочетании с ФМК или ГЛН был оценен как синергидный. Лишь в отношении АЦВ-резистентного штамма ВПГ комбинация Ф-АЦГ + ГЛН оказалась менее активной (FIC = 1). Для тройных комбинаций Ф-АЦГ + ФМК + ЦДВ и Ф-АЦГ + ЦДВ + Rib также установлено ослабление взаимоусиливающего эффекта относительно соответствующих двойных комбинаций. Сочетанное применение АраА с Ф-АЦГ или ЦДВ обеспечивает суммирование противовирусного эффекта индивидуальных соединений (FIC = 1) в отношении ВПГ-1/ L2. Выраженность потенцирующего эффекта тройной комбинации Ф-АЦГ + ЦДВ + АраА (FIC = 0,87) превосходила аддитивный, но была ниже эффекта комбинации Ф-АЦГ+ ЦДВ (FIC = 0,75). На модели ВПГ-1/Ь2/АЦВк противовирусный эффект двух двойных комбинаций (АраА + ЦДВ и Ф-АЦГ + ЦДВ) был выражен в большей степени по сравнению с таковым тройной комбинации. Эффект комбинаций Ф-АЦГ + ФМК, Ф-АЦГ + Rib и ФМК + Rib был оценен как синергидный (FIC = 0,75 во всех трех случаях). При анализе данных табл. 1, 2 видно, что если величина ИД50 одного из компонентов комбинации снижена в 4 раза, то для сохранения эффекта 50% ингибирования развития вирусиндуцированного ЦПЭ концентрацию второго компонента можно снизить не более, чем в 2 раза. При объединении этих соединений в тройную комбинацию выраженность синергидного эффекта сохраняется (FIC = 0,75). При этом концентрации всех трех соединений можно было снизить в 4 раза. Представленные в данном исследовании результаты комбинированного использования противогерпетиче- ских агентов на модели ВПГ-1 дают возможность разработки оптимальных схем химиотерапии герпеса в случаях неэффективности АЦВ и других модифицированных нуклеозидов.

References

Supplementary files