Complete genome analysis of the Batai virus (BATV) and the new Anadyr virus (ANADV) of the Bunyamwera group (Bunyaviridae, Orthobunyavirus) isolated in Russia

Full Text

Введение Вирус Батаи (Batai virus, BATV), арбовирус серогруп- пы Буньямвера рода Orthobunyavirus семейства Bunyaviridae, был впервые изолирован от комаров Culex gelidus в 1955 г. в Малайзии [1]. Геном этого оболочечного вируса представлен тремя одноцепочечными молекулами РНК отрицательной полярности - S-, M- и L-сегментами. Основными членистоногими переносчиками BATV являются кровососущие комары родов Anopheles, Culex, Coquillettidia, реже Ochlerotatus [2]. К позвоночным хозяевам BATV относятся люди, крупный рогатый скот, верблюды, лошади, свиньи, овцы, козы и птицы [3]. BATV широко распространен на территории Африки, Азии и Европы, тем не менее случаи заражения людей достаточно редки и обычно сводятся к гриппоподобным состояниям [2]. Повышенный интерес исследователей к вирусу Батаи в недавнее время связан с установлением его роли в реассортационном процессе возникновения африканского вируса Нгари (Ngari virus, NRIV), ассоциированного со вспышкой геморрагических лихорадок в Кении и Сомали 1997-1998 гг. [4, 5]. Учитывая широкое распространение BATV, а также видов комаров, которые он способен заражать, существует вероятность его участия и в других, еще не идентифицированных, реассортационных процессах. Мониторинг и идентифицикация подобных вирусов сильно осложняются отсутствием полногеномных данных для многих представителей семейства Bunyaviridae. На настоящий момент нуклеотидные последовательности всех трех сегментов генома вируса Батаи доступны для штаммов, выделенных на территории Италии [6], Германии [7], бывшей Чехословакии [8], Уганды [9], Малайзии [9], Китая (KJ187038-40), Индии [9, 10] и Японии [11]. Нуклеотидные последовательности BATV, циркулирующего на территории РФ, впервые опубликованы в 2010 г. и ограничиваются частичными последовательностями для двух сегментов [12]. Настоящая работа посвящена получению первых полногеномных данных для штаммов вируса Батаи, выделенных на территории РФ. Материалы и методы Вирусные штаммы. Штамм LEIV-13395 (депонент Государственной коллекции вирусов РФ № 810; авторы Громашевский В.Л., Львов С.Д.) выделен из комаров рода Aedes sp. в Магаданской области в 1987 г. Вирус получен в виде лиофилизованной мозговой суспензии, восстановлен в 1 мл культуральной среды DMEM (с добавлением антибиотика) и использован для интраце- ребрального заражения новорожденных беспородных мышей. После развития симптомов поражения ЦНС (2-3 сут) мышей забивали в соответствии с правилами содержания и использования лабораторных животных. Штаммы LEIV-Ast507 и LEIV-Ast528 были изолированы от лысух Fulica atra в 2004 г. в дельте реки Волги, Астраханская область. Вирусы были использованы для заражения культуры клеток Vero, и через 3 сут вирусосодержащий супернатант был отобран для дальнейшей работ (табл. 1). Выделение РНК проводили из гомогената мозговой суспензии реагентом TRI REAGENT (MRC, США) согласно инструкции производителя, для выделения РНК из вируссодержащего клеточного супернатанта использовали TRI REAGENT LS (MRC, США). Полученную РНК дополнительно очищали набором для выделения РНК RNeasy MinElute CleanUp Kit (QlAGEN, Германия); для препарата тотальной РНК, выделенной из мозга, также провели рибодеплецию с помощью набора Ge- neRead rRNA Depletion Kit (QIAGEN, Германия). Подготовка ДНК-библиотек и секвенирование. Около 100 нг полученной РНК фрагментировали нагреванием до 94°C в течение 5 мин в буфере для обратной транскрипции (Thermo Fisher Scientific, США). Реакцию обратной транскрипции полученных фрагментов проводили в присутствии гексануклеотидных праймеров (Promega), 20 ед. ингибитора РНКаз (RNasin, Promega) и 200 ед. обратной транскриптазы RevertAid Premium (Thermo Fisher Scientific, США) в следующем температурном режиме: 25°C (10 мин) - 42°C (60 мин) - 85°C (5 мин). Синтез двухцепочечной ДНК на основе полученных кДНК проводился с помощью набора NEBNext mRNA Second Strand Synthesis Module (NEB, США) согласно инструкции производителя. Полученные двухцепочечные ДНК-фрагменты очищали с использованием набора MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN, Германия) и использовали для приготовления библиотек набором TruSeq DNA Sample Prep Kits v2 (Illumina, США). Условия приготовления библиотек были оптимизированы для получения вставки длиной от 150 до 300 нуклеотидов. Библиотеки визуализировали в 2% агарозном геле для подтверждения нужной величины вставки, их моляр- ность измеряли методом полимеразно-цепной реакии в реальном времени (SsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad, США), прибор Bio-Rad CFX1000), согласно руководству Sequencing Library qPCR Quantification Guide (Illumina, США). Секвенирование библиотек проводили на приборе MiSeq (Illumina, США) с использованием набора MiSeq Reagent Kits V2 (300PE) в формате индексированных библиотек. Биоинформатический анализ. Обработку полученных нуклеотидных последовательностей проводили в программе CLC Genomic Workbench 7.0 (QIAGEN, Германия). Поиск и вычитание химерных прочтений осуществляли с помощью алгоритма UCHIME программы USEARCH 7.0 [13]. Выравнивания нуклеотидных Таблица 1 Вирусные штаммы, использованные в работе Вирус Место изоляции Источник изоляции Год изоляции LEIV Ast507, Дельта реки Вол- Лысухи 2001-2004 LEIV Ast528 ги, Астраханская область (Fulica atra) LEIV-13395 Магаданская область Комары (Aedes sp.) 1987 и аминокислотных последовательностей проводили с помощью алгоритма ClustalW как функции программы MEGA5 [14]. Филогенетический анализ нуклеотидных вирусных последовательностей осуществляли с помощью программы MEGA5 методами максимального правдоподобия (maximum likelihood) по всем сайтам выравнивания (use all sites) и методом присоединения соседей (neighbor-joining) с полным удалением отсутствующей информации (complete deletion) в рамках двухпараметрической модели Кимуры с 1000-кратным бутстрэп-анализом. Для поиска потенциальных сайтов N-гликозилирования внутри аминокислотных последовательностей применяли сервис NetNGlyc 1.0 (http:// www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/). Возможные сайты нарезания полипротеина-предшественника были найдены с помощью программы SignalP 4.1 (http://www.cbs. dtu.dk/services/SignalP/; [15]). Результаты и обсуждение Результаты полногеномного секвенирования. В результате секвенирования библиотек, соответствующих штаммам LEIV-Ast04-2-315 и LEIV-Ast04-2-336 и LEIV- 13 395, получили 470.040, 370.904 и 2.225.022 прочтений соответственно. В результате сборки и анализа получили более протяженные последовательности для всех трех сегментов изучаемых вирусов. По результатам проведенного филогенетического анализа (см. рисунок) все доступные нуклеотидные последовательности BATV можно разделить на три группы в соответствии с их географическим распространением: штаммы из Китая, Малайзии, Японии, Индии формируют азиатскую группу; штамм BATV из Уганды и NRIV (для которых BATV считается донором М-сегмента) относятся к африканской группе, штаммы, выделенные на территории Италии, Германии, бывшей Чехословакии, Западной Украины и России, входят в европейскую группу. Исследуемые в работе штаммы LEIV-Ast04-2-315 и LEIV-Ast04-2-336 по трем сегментам с высоким уровнем бутстрэп-поддержки попадают в кластер европейских штаммов BATV. Внутри данной группы они филогенетически наиболее близки к штамму 42, выделенному в Волгоградской области в 2003 г. от комаров Anopheles maculipennis, для которого известны частичные нуклеотидные последовательности L- и M-сегментов [12]. Между штаммами LEIV-Ast04- 2-315 и LEIV-Ast04-2-336 наблюдали крайне высокий уровень нуклеотидной и аминокислотной идентичности по трем сегментам генома - 99,6/99% (L-сегмент / РНК- зависимая РНК-полимераза), 99,9/100% (M-сегмент/ полипротеин-предшественник) и 99,7/100% (S-сегмент/ нуклеокапсид). Уровень нуклеотидной идентичности штамма 42 с исследуемыми штаммами по частичной последовательности L- и M-сегментов составляет 98,6/98,8% и 100/100% соответственно, все имеющиеся нуклеотидные замены являются синонимичными. Минимальные наблюдаемые генетические различия, а также временная и географическая близость выделения LEIV- 13395 LEIV- Ast507/528 BATV Italy BATV Calovo BATV Malaysia BATV China BATV Japan BATV India BATV Uganda NRIV ILEV BUNV CVV TENV LACV WYOV N 59 (NDTG) N 247 (NRSC) N 247 (NKSC) N 247 (NKSC) N 247 (NKSC) N 247 (NKSC) N 247 (NKSC) N 247 (NKSC) N 247 (NKSC) N 248 (NRSC) N 247 (NKSC) N 61 (NETG) N 249 (NKSC) N 57 (NATG) N 245 (NKSC) N 60 (NNTI) N 247 (NKSC) N 387 (NITY) N 366 (NISI) Потенциальные сайты N-гликозилирования полипротеина-предшественника вирусов Батаи и некоторых вирусов серогрупп Буньямвера и Калифорнийского энцефалита N 429 (NYTT) N 623 N 623 N 623 N 623 N 623 N 623 N 623 N 623 N 623 N 623 N 623 N 625 N-615 (NTTY) (NSTY) (NSTY) (NSTY) (NSTY) (NSTY) (NSTY) (NSTY) (NSTY) (NSTY) (NETY) (NSTY) (NDTY) N 664 N 664 N 664 N 664 N 664 N 664 N 664 N 664 N 664 N 664 N 656 (NTTG) (NTTG) (NTTG) (NTTG) (NTTG) (NTTG) (NTTG) (NTTG) (NTTG) (NTTG) (NKTE) N-702 N-702 N-702 N-702 N-702 N-702 N-702 N-702 N-702 N 704 (NETS) (NETS) (NETS) (NETS) (NETS) (NETS) (NETS) (NETS) (NETS) (NTTK) N 763 (NLTA) N 763 N 765 (NLTA) (NLTV) N 490 (NCTG) N 1170 (NLSV) N 1170 (NLSV) N 1177 N 1153 (NGTI) (NKTI) Примечание. Номера позиций сайтов потенциального N-гликозилирования приведены относительно первого метионина полипротеина-предшественника. Номера использованных последовательностей в GenBank: Batai virus (BATV) - Italy (AGM39999), Calovo (AGM34034), Malaysia (AFY52601), China (AHW40490), Japan (BAE97686), India (AFY52602), Uganda (AFY52603); Ngari virus (NRIV) (AGM34030); Ilesha virus (ILEV) (AGU99596); Bunyamwera virus (BUNV) (NP_047212); Cache Valley virus (CVV) (AAD48896); Tensaw virus (TENV) (ACV95627); La Crosse virus (LACV) (NP_671969); Wyeomyia virus (WYOV) (AEZ35274). вирусов позволяют предположить их общее происхождение в качестве различных изолятов одного и того же штамма BATV, циркулирующего в Южной части РФ. На основании антигенных свойств LEIV-13395, выделенный в 1987 г. от комаров Anopheles sp. в Магаданской области, был первоначально отнесен к серокомплексу Буньямвера рода Orthobunyavirus. В результате проведенного нами филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей трех геномных сегментов данный вирус не попадает ни в один из трех кластеров (европейский, азиатский, африканский) известных штаммов BATV, оставаясь внешней группой по отношению к ним. Для установления таксономического положения исследуемого вируса провели детальный молекулярногенетический анализ. Молекулярно-генетический анализ. S-сегмент LEIV- 13395 кодирует нуклеокапсидный белок N, состоящий из 233 а.о. (26,6 кД; pI = 9,33), а также неструктурный белок NSs длиной 101 а.о. (11,2 кД;, pI = 10,38). Для нуклеокапсидного белка ранее были найдены 46 аминокислот, абсолютно консервативных для 51 вируса серогрупп Буньямвера, Калифорнийского энцефалита, группы С и Симбу, а также 14 аминокислот, консервативных как минимум для 90% этих вирусов [16]. Данные аминокислотные остатки считаются крайне важными для функционирования нуклеокапсидного белка. Консервативность всех 60 аминокислотных остатков в нуклеокапсидном белке LEIV-13395 сохранена. М-сегмент вируса кодирует полипротеин-предшественник длиной 1434 аминокислот (161,96 кД; pI = 8.02). Полипротеин предположительно котрансляционно нарезается на белки Gn из 286 аминокислот (позиции 16301 по отношению к первому метионину полипротеина, 32,1 кД; pI = 8,86), NSm (174 а.о., позиции 302-475, 19,6 кД; pI = 7,67) и Gc, длиной 926 а.о. (позиции 508-1434, 105 кД; pI = 7,43). Предсказанный с помощью сервиса SignalP 4.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) сайт нарезания сигнального пептида располагается между аминокислотой 15 и 16 полипротеина. Сайт нарезания между белками Gn и NSm предположительно находится сразу после консервативного остатка аргинина в позиции 301 полипротеина. Согласно предсказанию SignalP, нарезание NSm-Gc сигнальной пептидазой происходит после остатка аланина в позиции 476. В положении -3 по отношению к предсказанному сайту находится остаток валина, который в сочетании с позицией -1 аланина является одной из наиболее часто встречающихся комбинаций аминокислот в сайтах нарезания полипротеинов клеточными сигналазами. Таким образом, полипротеин- предшественник LEIV-13395 обладает типичной для ортобуньявирусов структурой, обладая полноразмерными белками Gn, NSm и Gc, в отличие от новых представителей рода - вирусов Хурдун [17], Herbert virus, Tai virus и Kibale virus (KIBV) [18]. Для полипротеина LEIV-13395 с помощью сервиса NetNGlyc 1.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/, [15]) мы обнаружили шесть потенциальных сайтов N-гликозилирования (табл. 2) - два в части, кодирующей Gn (остатки аспарагина N-59 и N-247), и четыре в области, кодирующей Gc (N-623, N-664, N-763 и N-1170). В отличие от этого для полипротеинов различных штаммов BATV обнаружили от трех до четырех подобных сайтов, причем позиция N-247 оказалась характерна исключительно для штаммов, выделенных на территории Азии и Африки (включая NRIV), но не Европы. Три из шести сайтов гликозилирования вируса LEIV-13395 не встречаются у BATV, однако обнаруживаются у других ортобуньявирусов. Так, сайт N-1170 характерен африканскому вирусу Илеша группы Буньямвера и вирусу Ла Кросс (LACV-La Crosse Virus) группы Калифорнийского Уровень нуклеотидной и аминокислотной идентичности сегментов генома и соответствующих белков LEIV-13395 и некоторых представителей групп Буньямвера и Калифорнийского энцефалита L-сегмент и РНК-зависимая РНК-полимераза идентичность (%) LEIV-13395 BATV BUNV CVV TENV WYOV LACV LEIV-13395 90,6 81,4 83,1 83,0 67,8 55,3 BATV 79,5 81,6 83,1 83,2 68,1 56,1 BUNV 73,5 73,5 82,1 81,6 67,3 56,6 CVV 74,1 74,7 73,0 87,9 67,3 56,1 TENV 73,9 74,2 72,9 77,0 67,0 55,7 WYOV 67,5 67,3 66,9 66,7 66,4 56,1 LACV 60,9 59,3 59,3 58,7 59,1 60,3 Нуклеотидная Аминокислотная идентичность (%) Номера последовательностей РНК-зависимой РНК-полимеразы в GenBank: Batai virus (BATV) (AGM40000); Bunyamwera virus (BUNV) (P20470); Cache Valley virus (CCV( (KC436106); Tensaw virus (TENV) (FJ943510); Wyeomyia virus (WYOV) (JN801038); La Crosse virus (LACV) (NC_004108). Номера последовательностей L сегментов в GenBank: Batai virus (BATV) (KC168048); Bunyamwera virus (BUNV) (X14383); Cache Valley virus (CCV) (AGI03946); Tensaw virus (TENV) (ACV95629); Wyeomyia virus (WYOV) (AEZ35278); La Crosse virus (LACV) (NP_671968). М-сегмент и полипротеин-предшественник идентичность (%) LEIV-13395 BATV BUNV CVV TENV WYOV LACV LEIV-13395 84,2 64,0 75,2 74,0 51,2 41,3 BATV 77,5 64,3 75,5 74,5 51,4 42,0 BUNV 65,8 64,4 64,2 64,0 51,2 41,6 CVV 70,5 70,8 63,9 80,6 51,9 41,3 TENV 71,2 69,9 64,4 74,0 52,0 41,6 WYOV 58,8 58,0 58,0 57,3 58,7 40,7 LACV 52,9 53,0 52,1 53,0 53,4 52,9 Нуклеотидная Аминокислотная идентичность (%) Номера последовательностей полипротеина-предшественника в GenBank: Batai virus (BATV) (AGM39999); Bunyamwera virus (BUNV) (AAA42777); Cache Valley virus (CCV) (AAF33115); Tensaw virus (TENV) (ACV95627); Wyeomyia virus (WYOV) (AEZ35274); La Crosse virus (LACV) (NP_671969). Номера последовательностей M сегмента в GenBank: Batai virus (BATV) (KC168047); Bunyamwera virus (BUNV) (M11852); Cache Valley virus (CCV) (KC436107); Tensaw virus (TENV) (FJ943508); Wyeomyia virus (WYOV) (JN572081); La Crosse virus (LACV) (NC_004109). S-сегмент и нуклеокапсидный белок идентичность (%) LEIV-13395 BATV BUNV CVV TENV WYOV LACV LEIV-13395 97,8 93,1 94,0 95,3 62,7 42,9 BATV 86,3 92,6 93,9 94,3 62,6 43,5 BUNV 80,3 81,3 90,6 93,1 63,5 42,9 CVV 82,6 83,9 81,2 95,3 63,9 44,2 TENV 82,5 83,2 80,9 84,7 63,5 44,6 WYOV 56,8 57,2 58,5 58,4 58,3 48,5 LACV 51,3 51,2 49,0 50,3 49,9 51,8 Нуклеотидная Аминокислотная идентичность (%) Номера последовательностей нуклеокапсидного белка в GenBank: Batai virus (BATV) (ADX97411); Bunyamwera virus (BUNV) (NP_047213); Cache Valley virus (CCV) (ADG62277); Tensaw virus (TENV) (ACV95624); Wyeomyia virus (WYOV) (AEZ35279); La Crosse virus (LACV) (NP_671970). Номера последовательностей S сегментов в GenBank: Batai virus (BATV) (KC168046); Bunyamwera virus (BUNV) (NC_001927); Cache Valley virus (CCV) (X73465); Tensaw virus (TENV) (FJ943505); Wyeomyia virus (WYOV) (FJ235921); La Crosse virus (LACV) (NC_004110). энцефалита. Сайты N-59 и N-763 среди представителей группы Буньямвера также найдены у циркулирующих на территории Северной Америки вирусов Tensaw и Cache Valley, что, возможно, коррелирует с местом изоляции LEIV-13395. Полипротеин-предшественник содержит 70 остатков цистеина, 19 в области Gn, 8 в белке NSm и 43 в белке Gc. Высокий уровень содержания цистеиновых остатков (в данном случае 4,9%), по-видимому, является общей чертой буньявирусов [19]. Идентифицированный M. Plassmeyer и соавт. [20] пептид-слияния для LACV, состоящий из 22 аминокислотных остатков, также консервативен и для LEIV-13395 и располагается в позициях 1059-1080 а.о. полипротеина- предшественника. В позиции 11 данного пептида находится остаток изолейцина, характерный для TENV, CCV и BATV, выделенного в Китае, в то время как у всех остальных штаммов BATV в данной позиции расположен остаток валина. L-сегмент LEIV-13395 кодирует вирусную РНК-зави- Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей S-, M- и L-сегментов (а-в) вирусов серогруппы Буньямвера, рода Orthobunyavirus. Филогенетические деревья построены методом максимального правдоподобия (maximum likelihood) по всем сайтам выравниваний (use all sites) в рамках двухпараметрической модели Кимуры с 1000-кратной статистической оценкой методом бутстрэп-анализа и укоренены относительно соответствующих последовательностей вируса Ла Кросс (LACV). симую РНК-полимеразу длиной 2237 а.о. (258,7 кД; pI = 7,13), содержащую все консервативные для вирусных РНК-полимераз домены [21]. Филогенетический анализ Наибольшей нуклеотидной идентичностью L-сегмент LEIV-13395 обладает с таковым у различных штаммов BATV (от 76,5 до 79,7%), меньшее значение этого показателя наблюдается с последовательностями BUNV (73,5%), CVV (74,1%) и TENV (73,9%). Аминокислотная последовательность РНК-зависимой РНК-полимеразы более консервативна и достигает 91% идентичности с соответствующей последовательностью BATV (табл. 3). Последовательности M-сегмента и полипротеина- предшественника LEIV-13395 также обладают наибольшей нуклеотидной и аминокислотной схожестью (76,9-80,8% и 83,1-84,4% соответственно) с последовательностями различных штаммов BATV М-сегменты ортобуньявирусов обычно менее консервативны по сравнению с S- и L-сегментами, так как кодируют вирусные поверхностные гликопротеины, определяющие рецепторную специфичность вируса для позвоночного и членистоногого хозяев. Нуклеотидная идентичность последовательности S-сегмента LEIV-13395 с последовательностями различных вирусов Батаи находится в диапазоне от 85,8 до 86,9 и составляет порядка 82,5% с TENV и CVV На аминокислотном уровне для нуклеокапсидного белка наблюдается более выраженная консервативность, достигающая 98,7% (отличие в 3 аминокислотных остатках) по отношению к штамму BATV из Уганды. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей S-, M- и L-сегментов вирусов серогруппы Буньямвера рода Orthobunyavris, проведенный с использованием методов максимального правдоподобия (maximum likelihood, см. рисунок) и присоединения соседей (neighbor-joining), определяет LEIV-13395 как внешнюю группу по отношению к BATV Учитывая максимальный уровень нуклеотидных идентичностей S-(86,9%), M- (80,8%) и L- (79,7%) сегментов по отношению к известным ортобуньявирусам, а также особый паттерн сайтов N-гликозилирования полипротеина-предшественника, мы предлагаем считать LEIV-13395 новым представителем серогруппы Буньямвера.

References

Supplementary files