Rubella virus genetic determinant of attenuation

Full Text

Вирусная этиология краснухи была доказана в 1938 г. Хиро и Тасака. Вирус краснухи (ВК) впервые был выделен в культуре в 1961 г. Т.Х. Уэллером, П.Д. Паркманом и Ф.А. Невой в США, и в том же году на основе дикого штамма M33 был получен первый аттенуированный вакцинный штамм HPV-77, пассированный на клетках почки зеленой мартышки (AGMK) [1]. Путем многократного пассирования клинических изотлятов ВК на различных линиях клеток разработано несколько штаммов, которые были использованы для создания живой аттенуированной вакцины против краснухи [1]. Описание пассажной истории полученных вакцинных штаммов представлено в табл. 1. На данный момент в мире зарегистрировано девять живых аттенуированных вакцин, основанных на разных штаммах ВК (HPV-77/DE5, Wistar RA27/3, Cendehill, BRD-2, Matsuba vaccine, TCRB19 vaccine, Takahashi vaccine, Matsuura vaccine, и TO-336 vaccine), полученных путем пассирования изолятов вируса при пониженной температуре [2]. Линии клеток различались для разных штаммов, а количество пассажей варьировало от 30 до 90. Для всех вакцинных штаммов аттенуация проводилась при пониженной температуре (от 28 до 35°С) и сопровождалась накоплением мутаций и приобретением термочувствительного фенотипа. Количество и локализация замен у разных штаммов различалась. Так, в штамме TO-336 vaccine обнаружено 6 аминокислотных замен, возникших в процессе аттенуации, а в штамме Matsuura vaccine - 19, что может быть обусловлено различными линиями клеток, на которых проводилось пассирование, и разным количеством пассажей. Для получения штамма TO-336 vaccine проводили 7 пассажей на клетках VMK (velvet monkey kidney), 20 пассажей на первичных клетках почки морской свинки и 3 пассажа на клетках RK. Для штамма Matsuura vaccine проводили 14 пассажей на клетках VMK, 65 пассажей на культуре клеток амниона куриных эмбрионов и 11 пассажей на перепелиных эмбриональных фибробластах [1]. Пассирование вируса в культуре клеток при пониженной температуре создает для него селективные условия двух видов - возникает необходимость адаптации к новому хозяину и пониженной температуре. Таким образом, при анализе мутаций, возникших в процессе холодовой адаптации, важно дифференцировать случайные мутации и мутации, ответственные за адаптацию к новому хозяину и культивированию при пониженной температуре. На данный момент крайне мало известно о молекулярных механизмах аттенуации живых аттенуированных вакцин, и вакцина против краснухи не исключение. Сравнение нуклеотидных и аминокислотных последовательностей вакцинных штаммов и их штаммов-предков может Вакцинные штаммы ВК Штамм Год региСтрана Пассажная история вакцинный дикий страции HPV-77.DE5 M33 1961 США 77 п. - AGMK; 5 п. - утиные эмбрионы HPV-77 DK12 M33 1961 США 77 п. - AGMK; 5 п. - клетки почки собаки Cendehill - 1963 Бельгия 3 п. - VMK; 51 п. - RK-13 RA27/3 - 1964 США 4 п. - почка эмбриона человека (HEK); 17-25 п. - WI-38 TO-336 vaccine TO-336 gmk5 1967 Тояма, Япония 7 п. - VMK; 20 п. - первичные клетки почки морской свинки; 3 п. - RK TCRB19 vaccine - 1967 Токио, Япония 1 п. - VMK; 53 п. - клетки почки крупного рогатого скота; 3 п. - RK Matsuura vaccine (MEQ11) Matsuura. B3 1966 Осака, Япония 14 п. - VMK; 65 п. - клетки амнионов куриных эмбрионов; 11 п. - фибробласты перепелиных эмбрионов Matsuba vaccine (SK) Matsuba.GMK3 1969 Кумамото, Япония 1 п. - VMK; 60 п. - клетки почки свиньи; 6 п. - RK Takahashi vaccine (KRT) Takahashi RVi/ Matsue. JPN/68 1968 Мацуэ, Япония 4 п. - VMK; 36 п. - первичные клетки тестикул кролика; 1 п. - RK BRD-2 BRD-1 (2BS) 1980 Китай 30 п. - диплоидные клетки человека торых 6 приводили к замене аминокислоты. Во фрагменте, кодирующем неструктурные белки (ОРС НСБ), обнаружено 8 нуклеотидных замен, из которых 4 ведут к замене аминокислоты. Во фрагменте, кодирующем структурные белки (ОРС СБ), обнаружено 5 нуклеотидных замен, из которых 2 ведут к замене аминокислоты (табл. 2) [4]. При сравнении аминокислотных замен штамма С-77 с соответствующими позициями известных полноразмерных последовательностей холодоадаптированных вакцинных штаммов ВК и их диких штаммов-предков при их наличии выявлены общие закономерности генетических изменений, возникающие при холодовой адапдать важную информацию для понимания молекулярных основ процесса аттенуации вакцинных штаммов. Таблица 2 Нуклеотидные и аминокислотные замены варианта ca штамма С-77 Фрагмент Мутации в нуклеотидной последовательности Аминокислотные замены позиция wt ca39 уникальность* позиция wt ca ОРС НСБ P150 164 ACC TCC Нет 21 Thr Ser 328 AGC AGT Да - - - 2320 AGC AGT Нет - - - 3165 TAC TGC Да ** 1042 Tyr cys 3357 AGT ACT Да 1106 Ser Thr P90 5360 CTC TTC Нет 1774 Leu Phe 6064 TTC TTT Да** - - - 6223 GTC GTT Нет - - - ОРС СБ C 6588 cTc TTC Да 27 Leu Phe 7392 GCC GCT Нет - - - Е2 7490 CAT CAC Нет - - - 8199 GCC ACC Да 564 Ala Thr Е1 8957 GTC GTT Нет Примечание. * - сравнение проводилось с 97 нуклеотидными последовательностями диких штаммов ВК, представленными в GenBank NCBI (из них 24 последовательности с полноразмерным геномом, 44 последовательности, кодирующие ОРС СБ, 2 последовательности, кодирующие ОРС НСБ, 29 последовательностей, кодирующих протеазу); ** - обнаружено совпадение только с одной последовательностью из базы данных GenBank. Жирным шрифтом выделены нуклеотидные замены, приводящие к уникальной замене аминокислоты (т. е. в данных позициях ни у одного из диких штаммов ВК не обнаруживалось такой же аминокислоты за исключением 1 штамма). Несмотря на то что детерминанты аттенуации для ВК до сих пор точно не установлены, на основании ряда проведенных исследований определены домены в геноме ВК, мутации в которых приводят к аттенуации ВК, а также выявлены точечные мутации, вызывающие фенотипические изменения ВК. Так, в результате ряда исследований, использующих методы «обратной генетики» (создание инфекционного молекулярного клона и сайт-направленный мутагенез), обнаружены вероятные генетические детерминанты аттенуации, а с их помощью выявлен «минимальный генотип» штамма ВК, необходимый для аттенуации [2]. В этих работах обсуждается возможность в перспективе получить методами «обратной генетики» штаммы, обладающие достаточной иммуногенностью, стабильностью и минимальной реактогенностью, что необходимо для вакцинных штаммов. Путем пассирования клинических изолятов ВК на различных линиях клеток разработано несколько отечественных ослабленных штаммов ВК, но на данный момент для производства вакцины против краснухи используют зарубежный штамм вируса. Штамм С-77 был выделен Р. Г. Десятсковой из носового смыва больного манифестной формой краснухи в 2001 г. Полученный вариант штамма С-77 характеризовался стабильной репродукцией вируса, достигавшего титров 105-106 БОЕ/мл, и обладал ге- магглютинирующей активностью, варьировавшей от 2 до 32 ГЕ/0,2 мл. Также в испытаниях на животных отмечены изменение свойств штамма в сторону повышения цитопатической, бляшкообразующей активности и снижение антигенности по мере увеличения пассажа пассиирования. Установлено, что адаптированные варианты отечественных штаммов приобрели различия со свежевыделенными дикими штаммами и сходство с вакцинным штаммом RA27/3. Для получения ослабленных вариантов ca39 и ca46 штамм С-77 (wt) длительно культивировали в культуре клеток Vero: 34 пассажа при температуре 35°С, 4 и 11 пассажей при 33°С соответственно [3]. Штамм ВК С-77 относится к генотипу 1h, который широко распространен на территории России. При сравнении геномов вариантов ca и wt штамма С-77 обнаружено 13 нуклеотидных отличий, из ко- Сравнение аминокислотных замен варианта ca штамма С-77, приобретенных в процессе аттенуации известными вакцинными и дикими штаммами вируса краснухи ОРС НСБ ОРС СБ Штамм (генотип) МТ протеаза полимераза С Е2 164 | 21 3165 1042 3357 1106 5360 | 1774 6588 27 8199 564 C-77wt(1h) ACC Thr TAC Tyr AGT Ser CTC Leu CTC Leu GCC Ala C-77 ca39(1h) TCC Ser TGC Cys ACT Thr TTC Phe TTC Phe ACC Thr C-77 ca46(1h) - - TGC Cys - - - - - - - - Matsuba wt (1A) ACC Thr TAC Tyr AGT Ser TTC Phe CTC Leu GCC Ala Matsuba vac (1A) ACC Thr CAC His AGT Ser TTC Phe CTC Leu GCC Ala Brd-1 wt (2A) ACC Thr TAC Tyr AGC Ser TTC Phe CTC Leu GCC Ala Brd-2 vac (2A) ACC Thr TAC Tyr AGT Ser TTC Phe CTC Leu GCC Ala KRT wt (1A) ACC Thr TAT Tyr AGT Ser TTC Phe CTC Leu GCC Ala KRT vac (1A) ACC Thr CAC His AGT Ser TTT Phe CTC Leu GCC Ala To-336 wt (1A) ACC Thr TAC Tyr AGT Ser TTC Phe CTC Leu GCC Ala To-336 vac (1A) ACC Thr TAC Tyr AGT Ser TTC Phe CTC Leu GCC Ala Matsuura wt (1A) ACC Thr TAC Tyr AGT Ser TTC Phe CTC Leu GCC Ala Matsuura vac (1A) ACC Thr TAC Tyr AGT Ser TTC Phe CTC Leu GCC Ala TCRB-19 vac (1A) ACC Thr TGC Cys AGT Ser TTC Phe CTC Leu GCC Ala Cendehil vac (1A) ACC Thr CAC His AGT Ser TTC Phe CTC Leu GCC Ala Ra 27/3 vac (1A) TCC Ser TAC Tyr AGT Ser TTC Phe CTC Leu GCC Ala Примечание. Светлые строки - аттенуированные/вакцинные штаммы ВК, затемненные - дикие штаммы ВК, секвенирование не проводилось. Жирным цветом выделены совпадающие позиции аминокислотных замен и соответствующие им триплеты нуклеотидов варианта ca39 штамма С-77 и вакцинных штаммов. Для штаммов, у которых не сохранились штаммы-предки, жирным цветом выделены аминокислоты, совпадающие с аминокислотами других вакцинных штаммов или вариантом ca39 штамма С-77 и не встречающиеся ни у одного из диких штаммов-предков. тации (табл. 3) [4]. Сравнение проводили со следующими штаммами: Matsuba vaccine (GenBank AB588193), Matsuba GMK3 (GenBank AB588189), Brd-2 Vac (GenBank AY258323), Brd-1 (GenBank AY258322), Takahashi vaccine (GenBank AB222608), RVi/Matsue.JPN/68 GenBank AB003453.1), а также тремя вакцинными штаммами, для которых не сохранены дикие штаммы-предки: TCRB19 vaccine (Gen- Bank AB588188), Cendehill (GenBank AF188704) и Wistar RA27/3 (GenBank FJ211588). Перечисленные вакцинные штаммы относятся к генотипу 1a, за исключением китайских штаммов BRD-1 и BRD-2, которые относятся к генотипу 2А. В позиции 21 ОРС НСБ вакцинного штамма Wistar RA27/3 так же как и у варианта ca штамма С-77, находится аминокислота Ser, тогда как у варианта wt - Thr. Наличие в этой же позиции аминокислоты Thr у других диких штаммов, вакцинных штаммов и их предков, а также отсутствие дикого штамма-предка у ВА27/3 не позволяют судить о значимости этой замены для процесса аттенуации ВК (табл. 3) [4]. У некоторых вакцинных штаммов в триплетах, соответствующих аминокислотным заменам штамма С-77, выявлены замены нуклеотидов, не ведущие к замене аминокислот. Так, у вакцинного штамма BRD-2 в ОРС НСБ в домене, кодирующем протеазу, в позиции 3358 имеет место нуклеотидная замена цитозина на тимин (AGC- AGT), при этом замены аминокислоты не происходит. У варианта ca штамма С-77 в этом же триплете выявлена замена гуанина на цитозин в позиции 3357 (AGT-ACT), сопровождающаяся заменой аминокислоты Ser1106Thr. Данная нуклеотидная замена является уникальной, т. е. ни у одного из диких штаммов ВК не обнаруживалось такого же нуклеотида в данной позиции. У вакцинного штамма Takahashi vaccine в ОРС НСБ в домене, кодирующем полимеразу, в позиции 5362 имеет место нуклеотидная замена цитозина на тимин (TTC-TTT), при этом замены аминокислоты также не происходит. У варианта ca штамма С-77 в этом же триплете выявлена замена цитозина на тимин в позиции 5360 (CTC-TTC), сопровождающаяся заменой аминокислоты Leu1774Phe (см. табл. 2). В позиции 6223 у варианта ca штамма С-77 обнаружена нуклеотидная замена, не ведущая к замене аминокислоты; замена в той же позиции отмечена в вакцинном штамме BRD-2 [4]. В позиции 1042 ОРС НСБ штамма С-77 выявлена аминокислотная замена Tyr на Cys. В результате сравнительного анализа в этой же позиции имеет место замена Tyr на His в японских штаммах Matsuba и Takahashi vaccine. Также у двух вакцинных штаммов TCRB-19 и Cendehill, для которых не сохранились штаммы-предки, в этой позиции находятся аминокислоты Cys и His соответственно. Важно отметить, что у всех диких штаммов ВК, представленных в базе данных GenBank (NCBI), в этой позиции находится аминокислота Tyr, за исключением одного штамма. Результаты исследований разных групп ученых сходятся в том, что мутации, локализованные в генах, которые кодируют НСБ, и в частности протеазу, которая участвует в протеолитическом процессинге НСБ, ведут к появлению холодоадаптированного фенотипа [2, 5-7]. Выявлено 4 значимые мутации в области, кодирующей НСБ, из них 2 в области, кодирующей протеазу. Две группы японских ученых в 2009-2011 гг. обнаружили ряд мутаций в этой области, ведущих к снижению репродукции ВК при повышенной температуре [2, 5, 7]. Особого внимания заслуживает замена Tyr на Cys в позиции 1042 в протеазном домене штамма C-77. Данная мутация локализуется в протеазном домене полипротеина p150 [4] и является уникальной, т. е. у диких штаммов ВК в этой позиции практически всегда имеет место аминокислота Tyr, данная мутация сохранялась и в варианте ca46 штамма C-77 [4]. В вакцинном штамме TCRB-19 в данной позиции также находится аминокислота Cys, а в штаммах Matsuba и Cendehil - Tyr и His соответственно. Замена Tyr на His в позиции 1042 в вакцинном штамме Takahashi vaccine сопровождалась появлением фенотипа ts, что доказано методами обратной генетики [4]. При обратной замене гистидина на тирозин в позиции 1042 генома вакцинного штамма Takahashi vaccine наблюдался значительный рост интенсивности репродукции полученного штамма при 39°С, однако при замене тирозина на гистидин в позиции 1042 в геноме дикого штамма-предка RVi/Matsue. JPN/68 наблюдалось лишь незначительное снижение репродукции вируса при 39°С, что свидетельствует о наличии дополнительных детерминант холодовой адаптации [5]. Японские ученые обнаружили, что молекулярный клон дикого штамма RVi/Matsue. JPN/68 с заменой Y1042H и T1497I (домен хеликазы) обладал сопоставимыми показателями роста с вакцинным штаммом Taka- hashi vaccine при температуре культивирования 39°С. Интенсивность репродукции данного клона была существенно ниже, чем у дикого штамма RVi/Matsue. JPN/68 и у клона с единственной заменой Y1042H [5]. Кроме этого, нельзя исключать вклад в развитие холодоадаптированного фенотипа и других замен, в том числе и не ведущих к замене аминокислот [5]. Совокупность таких замен, возникших в процессе холодовой адаптации, может способствовать репликации вируса при пониженной температуре или приводить к снижению стабильности геномных структур при повышенной температуре и, как следствие, снижать эффективность репликации вируса. Также к снижению репродукции при повышенной температуре может приводить и совокупность как транс-, так и цис-действующих факторов. Выявлено, что сниженная интенсивность репродукции при температуре культивирования 39°С вакцинного штамма Takahashi (KRT) обусловлена подавлением синтеза РНК. Интенсивность репликации РНК у молекулярного клона с обратной заменой H1042Y при 39°С была на прежнем уровне. В то же время у дикого штамма-предка с заменой Y1042H также наблюдалось ослабление репликации при 39°С в сравнении с исходным диким штаммом Takahashi rvi/Matsue. jpn/68 [5]. Изменения в интенсивности репликации РНК возникали только при наличии замены в позиции 1042. У ВК нерасщепленный неструктурный полипротеин p200 необходим для синтеза комплементарной полноразмерной РНК отрицательной полярности, которая является матрицей для синтеза геномной РНК. В синтезе геномной РНК участвуют продукты процессинга полипротеина p200 - белки p150 и p90. Таким образом, регуляция этих двух этапов репликации генома ВК осуществляется с помощью процессинга НСБ [8]. Обнаруженные нами в штамме С-77, а также выявленные у вакцинного штамма Takahashi KRT и TO-336 vaccine замены в участке генома, который кодирует протеазу, могут вызывать снижение активности вирусной протеазы при повышенной температуре культивирования, а также снижать конформационную стабильность процессированных и непроцессированных НСБ, что в результате может приводить к снижению репликации ВК при повышенной температуре [5]. Протеазный домен вируса краснухи содержит богатый цистеином участок связывания ионов Сa2+ и Zn2+, которые необходимы для протеазной активности и репликации ВК [7]. Кроме того, данный участок содержит домен связывания кальмодулина (кальцийсвязывающий белок), который также играет важную роль в протеазной активности и репликации ВК [9]. Мутации в этом домене приводят к снижению его конформационной стабильности при высокой температуре [9], что является возможной причиной приобретения термочувствительного фенотипа некоторых вакцинных штаммов ВК. Приведенные выше данные позволяют с высокой степенью уверенности утверждать, что замена Tyr на Cys в позиции 1042 в протеазном домене штамма C-77 является не случайной и не следствием адаптации к культуре клеток Vero, а прямо связана с приобретенным холодоадаптированным фенотипом. Таким образом, в результате сравнительного анализа полноразмерных геномов вариантов wt и ca39 штамма С-77 выявлены вероятные генетические детерминанты аттенуации ВК. 5 из 13 выявленных нами нуклеотидных замен в позициях 2320, 6223, 7392, 7490 и 8957, приобретенных в процессе холодовой адаптации штамма С-77, по всей вероятности, являются случайными, так как не ведут к замене аминокислоты и не являются уникальными. Хотя полностью исключать их роль в приобретении холодоадаптированного фенотипа штаммом С-77 нельзя. Две нуклеотидные замены в позициях 328 и 6064 также не ведут к замене аминокислот, но являются уникальными, поэтому представляют больший интерес. Нуклеотидная замена в позиции 164 сопровождается заменой аминокислоты Thr21Ser. Данная нуклеотидная замена не является уникальной, но аминокислота Ser в этой позиции находится у вакцинного штамма Wistar RA27/3 и не встречается ни у одного штамма-предка других вакцинных штаммов. Одна нуклеотидная замена в позиции 5360 ведет к замене аминокислоты, но не является уникальной. Наибольший интерес представляют нуклеотидные замены в позициях 3165, 3357, 6588, 8199, так как они ведут к замене аминокислот, не характерных для диких штаммов ВК, что рассматривается нами как свидетельство их вероятной роли в приобретении холодоадаптированного фенотипа варианта ca штамма С-77 или адаптации к новому хозяину (клеткам Vero). Замена аминокислоты Tyr на Cys в позиции 1042 ОРС НСБ, соответствующая нуклеотидной замене в позиции 3165, по всей вероятности, играет ключевую роль в приобретении холодоадаптированного фенотипа варианта ca штамма С-77, что согласуется с последними данными литературы.

References

Supplementary files