Genetic characterization of the Sakhalin virus (SAKV), Paramushir virus (PMRV) (Sakhalin group, Nairovirus, Bunyaviridae), and Rukutama virus (RUKV) (Uukuniemi group, Phlebovirus, Bunyaviridae) isolated from the obligate parasites of the colonial sea-birds ticks Ixodes (Ceratixodes) uriae, White 1852 and I. signatus Birulya, 1895 in the water area of sea of the Okhotsk and Bering sea

Full Text

Прототипный штамм LEIV-71C вируса Сахалин (SAKV - Sakhalin virus) изолирован из облигатных паразитов чистиковых птиц (Alcidae) - клещей Ixodes (Ceratixodes) uriae White, 1852 (Ixodidae, Ixodinae) - в августе 1969 г., собранных в гнездовье кайр Uria aalge Pontoppidan, 1763 на острове Тюлений, расположенном вблизи юго-восточного побережья острова Сахалин в Охотском море (48°29' с.ш., 144°38' в.д.) [1-3]. Позднее были изолированы еще 52 штамма SAKV из клещей I. uriae на острове Тюлений и острове Ионы в Охотском море, на Командорских островах в бассейне Берингова моря и на юго-восточном побережье полуострова Чукотки в Беринговом проливе (табл. 1) [2, 4]. По данным электронной микроскопии SAKV отнесен к сем. Bunyaviridae и явился родоначальником новой антигенной группы Сахалин [1]. Прототипный штамм LEIV-2268 вируса Парамушир (PRМV - Paramushir virus) изолирован от облигатных паразитов берингийских бакланов (Phalacrocorax pelagicus Pallas, 1811) - клещей I. signatus Birulya, 1895, собранных в гнездовьях птиц в сентябре 1972 г. на острове Парамушир (Курильские острова) в Охотском море (50°23' с.ш., 155°41' в.д.) [5, 6]. По данным электронной микроскопии PRМV отнесен к сем. Bu-nyaviridae, а по серологическим данным входит в группу Сахалин [6, 7]. Позднее (1972-1987) изолированы еще 18 штаммов вируса из клещей I. uriae, собранных в гнездовьях чистиковых птиц (Alcidae) на острове Тюлений в Охотском море и на Командорских островах в Беринговом море (табл. 1) [5-7]. Прототипный штамм LEIV-6269C вируса Рукутама (RUKV - Rukutama virus; по названию реки Рукутама, впадающей в залив Терпения Охотского моря на юговосточном побережье острова Сахалин) изолирован из клещей I. uriae, собранных в сентябре 1976 г. в гнездовьях кайр Uria aalge на острове Тюлений [5, 8]. Еще три штамма изолированы на острове Тюлений и Командорских островах из клещей I. uriae, собранных в 1976-1986 гг. (см. табл. 1). По данным Международного каталога арбовирусов, на 1985 г. в группу Сахалин рода Nairovirus (Bunyaviridae) включены пять вирусов (табл. 2) [1-17]. В настоящей работе проведен анализ полноразмерных геномных последовательностей SAKHV и RUKV, а также частичной последовательности генома PRMV, определенных методом массового параллельного сек-венирования. В работе впервые получены полные последовательности генома для наировирусов группы Сахалин. На основе проведенного анализа полученных данных показано, что RUKV принадлежит к роду Phle-bovirus (группа Укуниеми). Материалы и методы Вирусные штаммы. Работы с инфекционным материалом, связанные с получением и накоплением вируса, проводили в боксовых помещениях, оборудованных и сертифицированных для работы с микроорганизмами II группы патогенности. В работе использовали вирусы SAKV (штамм LEIV-71C), PRMV (LEIV-1149K) и RUKV (LEIV-6269C), полученные из Государственной коллекции вирусов РФ при ФГБУ “НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского” Минздрава России в виде лиофилизиро-ванной мозговой суспензии. Для накопления вируса ли-офилизированную суспензию восстановили в 1 мл культуральной среды ДМЕМ (с добавлением антибиотика) и использовали для интрацеребрального заражения новорожденных беспородных белых мышей. После развития симптомов поражения ЦНС (2-3 сут) мышей забивали в соответствии с правилами содержания и использования лабораторных животных. Выделение РНК. Фрагменты мозга (около 30 мг) помещали в 1 мл реагента TRIzol (Life Technology, США) и гомогенизировали пластиковым пестиком. Далее выделяли РНК согласно прилагаемой инструкции производителя данного реагента. Конечный осадок суммарной РНК растворяли в 100 мкл DEPC-обработанной воды. Для дополнительной очистки, а также для удаления низкомолекулярных фракций рибосомальной (5 S) и транспортной РНК полученный препарат очищали набором “RNeasy mini kit” (QIAGEN, Германия) в режиме clean-up на автоматической станции QIAcube (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией. Концентрацию РНК измеряли с использованием флюориметра Qubit (Invitrogen, США). Для удаления рибо-сомальной (18 и 28 S) РНК использовали набор “GenRead rRNA depletion Kit”(QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией. Для этого брали не более 3 мкг суммарной РНК. Эффективность деплеции достигала 50-80%, и, таким образом, количество полученной РНК для дальнейшего анализа составляло около 300 нг. Подготовка ДНК-библиотек и секвенирование. Для получения кДНК около 100 нг деплецированной РНК фрагментировали в 15 мкл реакционной смеси для обратной транскриптазы с гексапраймером при 85°С в течение 5 мин, после чего помещали в лед. К фрагментированной РНК добавляли 200 ед. фермента RevertAid Premium (Thermo Scintific, США) и 20 ед. ингибитора РНаз RNasin (Promega, США). Инкубировали при 25°С 10 мин, далее при 42°С 60 мин. Реакцию останавливали прогреванием при 70°С 10 мин. Синтез второй цепи кДНК проводили с использованием набора “NEBNext® mRNA Second Strand Synthesis Module» (NEB, США) в соответствии с инструкцией. Полученную дцДНК очищали с помощью набора “MinElute PCR Purification Kit” (QIAGEN, Германия) на автоматической станции QIAcube. Для получения ДНК-библиотек из дцДНК использовали набор “TruSeq DNA Sample Prep Kits v2” (Illumina, США) в соответствии с инструкцией. Для селекции ДНК по размеру применяли реагент “AMpure XP” (Beckman Coulter, США) с расчетом получения ДНК-библиотек длиной более 270 н.о., что соответствует размеру вставки около 150 н.о. Данные требования к размеру ДНК-библиотек связаны с использованием для секвенирования набора, позволяющего секвенировать не более 150 н.о. в одну сторону. Полученные библиотеки визуализировали на станции автоматического электрофореза “QIAxcel Advanced System” (QIAGEN, Германия). Молярности полученных библиотек измеряли методом полимеразно-цепной реакции в реальном времени (2х SsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad, США), прибор Bio-Rad CFX1000) согласно рекомендациям, изложенным в руководстве “Sequencing Library qPCR Quantification Guide” (Illumina, США). Секвенирование ДНК-библиотек проводили на приборе MiSeq (Illumina, США) с использованием набора “MiSeq Reagent Kits V2 (300PE)” в соответствии с инструкцией производителя. Биоинформационный анализ. Обработку данных полногеномного секвенирования, сборку контигов и картирование ридов осуществляли с помощью программы “CLC Genomics Workbench 6.0” (CLC bio, США). Предварительный поиск гомологичных последовательностей проводили, используя сервис BLASTX (http://blast.ncbi. nlm.nih.gov). Для анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей использовали пакет программ “Lasergene Core Suite” (DNAstar, США). Выравнивание последовательностей проводили по алгоритму ClustalW. Филогенетический анализ и построение дендрограмм осуществляли с использованием программы MEGA5 по алгоритму ближайшего соседа (neighbor-joining) или 12 Таблица 1 Изоляция вирусов Сахалин (SAKV), Парамушир (PMRV) и Рукутама (RUKV) от облигатных паразитов чистиковых птиц (Alcidae) клещей Ixodes (Ceratixodes) uriae в бассейнах Охотского и Берингова морей Характеристика Дальний Восток Европейская часть Сахалинская область Камчатский край Чукотская АО Мурманская область остров Тюлений (48°29' с.ш., 144°38' в.д.) остров Ионы (56°24' с.ш., 143°23' в.д.) остров Арий Камень (Командорские острова) (55°13' с.ш., 165°48' в.д.) побережье пролива Беринга (64°50' с.ш., 173°10' з.д.) остров Харлов близ Кольского полуострова (68°49' с.ш., 37°19' в.д.) SAKV Количество штаммов 42 2 10 3 0 % зараженности клещей 0,307 0,103 0,033 0,26 - Количество штаммов 57 0 о обследовано клещей 35 725 8994 S % зараженности клещей 0,160 - PMRV Количество штаммов 10 0 8 0 0 % зараженности клещей 0,073 - 0,042 - - Количество штаммов о 18* 0 о обследовано клещей т 35 725 8994 S % зараженности клещей 0,050 - RUKV Количество штаммов 3 0 1 0 0 % зараженности клещей 0,022 - 0,005 - - Количество штаммов 4 0 о обследовано клещей 35 725 8994 S % зараженности клещей 0,011 - Примечание. АО - автономная область. * - один штамм изолирован из клещей I. signatus в гнездовой колонии берингийских бакланов на острове Парамушир в Охотском море (50°23' с.ш., 155°41' в.д.). максимального правдоподобия (Maximum likelihood) с 1000-кратным бутстреп-тестированием. Результаты и обсуждение Род Nairovirus был сформирован при объединении вирусов пяти антигенных групп: Крымской-Конго геморрагической лихорадки (прототипный вирус; CCHF - Crimean-Congo hemorrhagic fever), болезни овец Найроби (NSD - Nairobi sheep disease virus), Хьюз (HUGV - Hughes virus), Дера-Гхази-Хан (DGKV - Dera Ghazi Khan virus) и Кальюб (QYBV - Qalyub virus). Позднее к роду Nairovirus были отнесены вирусы серогрупп Сахалин (SAKV) и Тиафора (TFAV - Thiafora virus) [18]. Несмотря на то что наировирусы широко распространены и обладают высоким патогенным потенциалом, геномные данные о большинстве наировирусов являются ограниченными. Генетические данные для вирусов группы Сахалин представлены только небольшим (147 а.о.) фрагментом РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp) вируса Тилламук (TILLV - Tillamook virus), который был изолирован от клещей I. uriae на Тихоокеанском побережье США (штат Орегон) [19]. Для изучения молекулярно-генетических характеристик группы Сахалин с использованием метода массового параллельного секвенирования мы секвенировали геномы двух вирусов - SAKV и PRMV, отнесенных к данной группе на Таблица 2 Вирусы группы Сахалин (Sakhalin) (Bunyaviridae, Nairovirus), изолированные из облигатных паразитов чистиковых птиц (Alcidae) и пингвинов (Spheniscidae) - клещей Ixodes (Ceratixodes) uriae Вирус Район и место сбора материалов Биотоп Автор Источник SAKV Бассейны Охотского, Берингова морей, 1969-1971 гг. Гнездовья кайр Uria aalge, клещи I. uriae Д.К. Львов и соавт., 1971; D. Lvov и соавт., 1972 [1, 2, 4] PMRV Бассейны Охотского, Берингова морей, 1969-1971 гг. Гнездовья кайр Uria aalge, берин-гийских бакланов Phalacrocorax pelagicus, клещи I. uriae D. Lvov и соавт., 1976 [5, 6] TAGV Австралия, острова Маккуори в южной части Тихого океана (54°30' ю.ш., 159°00' в.д.), 1972 г. Гнездовья королевских пингвинов Eudyptes schlegeli, клещи I. uriae R. Doherty и соавт, 1975 [26] Кло-Мор (CMV -Clo-Mor virus) Мыс Рот на северном побережье Шотландии (58°36' с.ш., 04°53' з.д.), 1973 г. Гнездовья кайр Uria aalge, клещи I. uriae на севере Англии A. Main и соавт., 1976 [11] Авалон (AVAV -Avalon virus) Полуостров Авалон, остров Ньюфаундленд, провинция Лабрадор (52°46’ с.ш., 47°1Г з.д.), 1972 г. Гнездовья кайр Uria aalge, клещи I. uriae A. Main и соавт., 1976 [15, 16] Франция, Бретань, 1976 г. Гнездовья кайр Uria aalge, клещи I. uriae C. Chastel и со-авт., 1981 [12] 13 £ Chim LEIV-858UZ Bandia virus AY357717 Qalyub 92 I- Qalyub virus AY359528 -issyk-Kui virus | Issyk-Kul -Abu Mina virus AY357716 -Abu Hammad virus AY357715 40 I-Punta Salinas virus AY359527 Dera Ghazi Khan 93 40I- _I- I 94 35 rl Tillamook virus AY359530 • Sakhalin virus Paramushir virus Raza virus AY359529 Farallon virus AY359523 -Caspy virus T amdy LEIV-10228Az T amdy LEIV-1308Uz Tamdy LEI V-6158Ar Sakhalin Hughes 100 Tamdy - Artashat virus | Artashat 66 47 -DugbevirusNC004159 | NSD - Crimean-Congo HF virus NC005301 | CCHF ■ Hazara virus - ErvevirusAY357719 I Thiafora Рис. 1. Дендрограмма, построенная на основе сравнения частичной аминокислотной последовательности каталитического центра РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp, L-сегмент) представителей рода Nairovirus (Bunyaviridae). SAKV и PRMV, описанные в настоящей работе, обозначены черным кружком. Рис. 2. Дендрограмма, построенная на основе сравнения аминокислотных последовательностей РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp, L-сегмент) буньявирусов. Филогенетическое положение RUCV в составе рода Phlebovirus обозначено черным кружком. основании серологических реакций. Ранее с использованием технологии полногеномного секвенирования показано, что ряд неклассифицированных вирусов являются новыми членами рода Nairovirus. Низкий уровень гомологии вирусов Иссык-Куль (ISKV - Issyk-Kul virus), Там-ды (TAMV - Tamdy virus) и Арташат (ARTSV - Artashat virus) с другими наировирусами позволяет предположить, что они являются прототипны-ми вирусами новых самостоятельных филогенетических групп (рис. 1) [20-22]. В результате определены полная последовательность генома SAKV (ID GenBank KF801659) и частичные последовательности PRMV (KF801657). Результаты анализа полученных последовательностей показали, что TILLV является практически идентичным SAKV (99%) и, таким образом, должен рассматриваться как один из изолятов SAKV. При сравнении нуклеотидных последовательностей каталитического центра RdRp между PRMV и SAKV установили 81% гомологии. По аминокислотной последовательности данное значение составляет 98,5%. С другими наировирусам, для которых известна полная последовательность генома, SAKV обладает от 25% (белок нуклеокапсида N) до 50% (RdRp) гомологии (табл. 3). При этом максимальный уровень гомологии SAKV имеет с CCHFV, Дугбе (DUGV - Dugbe virus) и NSDV, которые так же, как и SAKV, экологически связаны с иксодовыми клещами. Результаты филогенетического анализа, проведенного на основе последовательности RdRp наировирусов, представлены на рис. 1. Провели анализ полной последовательности генома RUKV (KF892052-KF892054), первоначально классифицированного как наировирус, входящий в группу Сахалин. Согласно полученным данным, RUKV является представителем рода Phlebo-virus (Bunyaviridae) (рис. 2). RUKV обладает высоким уровнем гомологии (93-95,5%) с описанным нами ранее новым флебовирусом Командоры (KOMV - Komandory virus) [23]. RUKV и KOMV формируют новый филогенетический кластер в составе группы Укуниеми (UUKV -Uukuniemi virus) [24]. Из флебовирусов данной группы RUKV и KOMV наиболее близки к вирусу Манава (MWAV - Manawa virus), изолированному в 1964 г. из клещей Argas abdussalami Hoogstraal et McCarthy, 1965 в Пакистане, и обладают с ним 65-74% гомологии [25]. Таким образом, исправлены предварительные 14 Таблица 3 Уровень гомологии (рассчитанный на основе генетической дистанции p-distance) на основе полноразмерных последовательностей белков SAKV и PRMV c вирусами рода Nairovirus Вирус RdRp (L-сегмент) G^Gn (М-сегмент) N (S-сегмент) Крымской-Конго геморрагической лихорадки (ККГЛ) (CCHF - Crimean-Congo hemorrhagic fever virus) 50,8 28,4 43,0 Болезни овец Найроби (NSDV - Nairobi sheep disease) 50,4 28,9 41,7 Дугбе (DUGV - Dugbe virus) 50,7 28,1 40,9 Ерве (ERVEV - Erve virus) 43,7 25,9 37,6 Иссык-Куль (ISKV -Issyk-Kul virus) 43,2 27,3 36,3 Каспий (CASV - Caspiy virus) 42,8 28,1 30,0 Примечание. Gc/Gn - структурные оболочечные белки. данные по антигенной классификации RUKV, который должен рассматриваться как новый представитель группы Укуниеми рода Phlebovirus. В случае SAKV зараженность имаго клещей I. uriae выявлена в 2 и 10 раз выше по сравнению с таковой в нимфальную и личиночную стадию метаморфоза соответственно. Трансовариальная передача установлена в 10% [17, 26-29]. Зараженность самцов и самок примерно одинакова. Это свидетельствует о трансстадийной передаче вируса, поскольку самцы имеют рудиментарный гипостом и, следовательно, не могут заражаться вирусом при кровососании на зараженной птице [17, 26-29]. Зараженность имагинальной стадии I. uriae по крайней мере в 20 раз выше в сравнении с I. signatus, что свидетельствует об основной роли I. uriae и кайр U. aalge и U. lomvia в качестве природного резервуара вируса. Берингийские бакланы Phalacrocorax pelagicus и их облигатные паразиты I. signatus, вероятно, имеют лишь дополнительное значение [17, 26-28]. Антитела к SAKV на Дальнем Востоке обнаружены у кайр U. aalge, берингийских бакланов (Phalacrocorax pelagicus Pallas, 1811), глупышей (Fulmarus glacialis Linnaeus, 1761), топорков (Lunda cirrhata Pallas, 1769), чаек-моевок (Rissa tridactyla Linnaeus, 1758) [17, 26-29]. При серологическом обследовании птиц в непрямой реакции связывания комплемента антитела не обнаружены в Арктическом поясе (остров Новая Земля и остров Врангеля Северного Ледовитого океана), северной части Субар-ктики (побережья Чукотки и Камчатки в бассейне Тихого океана) и за пределами южной границы ареала - на острове Монерон и острове Фуругельма в бассейне Японского моря. В наиболее северной части ареала (Командорские острова) антитела найдены в 2,2%. Крайним южным районом обнаружения антител (1,1%) оказался остров Кунашир из цепочки Курильских островов. Чаще всего (4,1-17,8%) антитела находили в центральной части бассейна Охотского моря (острова Сахалин, Тюлений, Ионы). Антитела выявляли у круглоносых плавунчиков (Phalaropus lobatus Linnaeus, 1758), песчанок (Calidris alba Pallas, 1764), длиннопалого песочника (C. subminuta Middendorff, 1853) (до 8,4%), а также у глупышей (Fulmarus glacialis Linnaeus, 1761) (4,9%), качурок (Oceanodroma leucorhoa Vieillot, 1818), топорков (Lunda cirrhata Pallas, 1769) (4,6%), кайр (Uria aalge Pontopiddan, 1763) (3,8%), уссурийских бакланов (Phalacrocoraxfilamentosus Temminck et Schlegel, 1850) (1,0%), чаек-моевок (Rissa tridactyla Linnaeus, 1758) (0,6%). У других видов чистиковых птиц, гусей, уток, домашних кур антитела не обнаружены [26-29]. Вируснейтрализующие антитела к близкому вирусу Авалон (который представляет собой региональный вариант SAKV) найдены в 27,6% у топорков (Fratercula arctica Linnaeus, 1758), буревестников (Calonectris leucomelas Temminck, 1835) и серебристых чаек (Larus argentatus Pontoppidan, 1763) в Канаде [13, 30, 31]. Находки антител у куликов, качурок, глупышей, осуществляющих ежегодные сезонные миграции в южное полушарие, дают основания предполагать возможность трансконтинентального заноса вируса в южном направлении [17, 26-29]. Изоляция вируса от голодных личинок клещей I. uriae в лаборатории из собранных в природе кладок служит прямым доказательством трансовариальной передачи вируса у клещей [17]. По экспериментальным данным комары Aedes ae-gypti и Culex pipiens molestus способны заражаться вирусом при кровососании. Титры вируса в комарах на 9, 14 и 19-е сутки после заражения достигают 1, 1,5 и 2 lg (LD50)/10 мкл соответственно. Однако передачу вируса через укус зараженными комарами мышам-сосункам осуществить не удалось [27-29]. Наличие клещей и близкого к SAKV вируса Таггерт (TAGV - Taggert virus) в Южном полушарии в гнездовых колониях пингвинов на островах Маккуори свидетельствует об их заносе из природных очагов Северного полушария [15]. Ряд видов птиц, служащих прокормителями клещей I. uriae, совершают ежегодные миграции. Закле-щеванность взрослых кайр достигает 10-42%, а птенцов - 100%. Индекс обилия достигает сотен разных стадий метаморфоза на птице. Это обеспечивает очень высокий уровень обмена вируса между клещами и птицами [17, 27-29]. Интенсивная циркуляция вируса, возможно, сказывается на состоянии экосистем на прибрежных территориях северной части бассейна Тихого океана. Некоторые другие виды клещей рода Ixodes паразитируют на морских птицах и могут также служить природным резервуаром адаптированных к ним вирусов, например I. auritulus Neumann, 1904, ареал которого простирается в Южной Америке от мыса Горн на юге до северной части Чили, хотя этот вид паразитирует на птицах, обитающих на континенте. Это же относится к близкому виду I. zealandicus Dumbleton, 1953 [30, 31]. Зондирование территорий в высоких широтах проводится в рамках программы по биобезопасности и изучения биоразнообразия в разных экосистемах Северной Евразии, а также для пополнения Государственной коллекции вирусов [32-36].

References

Supplementary files