Immunization with live attenuated A/H5N1 vaccine protects guinea pigs from reinfection

Full Text

Вакцинация является основным способом профилактики гриппозной инфекции. Наряду с инактивированными вакцинами (ИГВ) в отдельных странах используют живые аттенуированные вакцины (ЖГВ), которые представляют собой ослабленный вирус, вводимый интраназально (и/н). ЖГВ индуцирует выработку как антительного (секреторные и сывороточные АТа (АТ)), так и клеточного иммунного ответа. Иммунитет, вызванный этими вакцинами, является более длительным и кроссреактивным, чем иммунитет, вызванный инактивированными вирусными препаратами [5]. В настоящее время в мире лицензировано два холодоадаптированных (ХА) донора аттенуации: А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) (в России) и А/Энн Арбор/6/60 (H2N2) (в США), которые используют для получения вакцинных штаммов [1]. Оба донора характеризуются свойствами температуро-чувствительности (ts-) и холодоадаптированности (са-), которые служат маркерами безвредности для людей как самих доноров, так и полученных на их основе реассор-тантов. Нами был получен ХА-штамм A/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2) (А/ГК/са), который также сочетает ts- и са- признаки, а кроме того, обладает высокой репродуктивной активностью в куриных эмбрионах (КЭ) - качеством, повышающим рентабельность производства как живых, так и инактивированных ИГВ [3]. Полученные нами на основе штамма А/НК/са реассортанты с поверхностными антигенами вирусов гриппа различных сероподтипов (H1N1, H3N2, H5N1, H3N8) наследовали его основные свойства (высокая репродуктивность, ts- и са- фенотип) и были безвредными для мышей как при и/н, так и при внутримышечном (в/м) введении [2]. Цель данного исследования состояла в сравнении иммуногенных и защитных свойств экспериментальных препаратов живой вакцины и ИГВ, полученных из реассортанта, который содержит гены поверхностных белков птичьего вируса A/chicken/Astana/6/05 (H5N1) в комбинации с остальными генами донора А/НК/са на морских свинках, высоковосприимчивых к гриппозной инфекции и успешно используемых для оценки эффективности противогриппозных препаратов [8, 9, 18]. Материалы и методы Вирусы. В работе использовали ХА-реассортант на основе штамма A/НК/са, содержащий гемагглютинин (НА) с модифицированным сайтом расщепления и ней-раминидазу (NA) высокопатогенного вируса гриппа A/ chicken/Astana/6/2005 (H5N1) (формула генома 6:2), - штамм А/HK/Astana/6:2/2010 (H5N1) (Ast/HK) [16]; а также аналогичный реассортант вируса A/chicken/ Astana/6/2005 (H5N1), созданный на основе донора А/ PR/8/34 (PR8) методом обратной генетики (формула генома 6:2), - штамм A/Astana/RG/6:2/2009 (H5N1) (Ast/ PR8) [10]. Полиосновной сайт расщепления НА был замещен последовательностью, характерной для низкопатогенных вирусов гриппа птиц [7]. Вирусы культивировали в 10-12-дневных КЭ при следующей температуре: оптимальной 32-34°С, пониженной 26°С или Контактная информация: Сергеева Мария Валерьевна, науч. сотр.; e-mail: maria_s@influenza.spb.ru б Время после заражения, ч □ Ast/HK Щ Ast/PR8 10,0 —і 9,59,08,58,07,57,06,56,0- “Г ~r 72 Ast/PR8 -О- 18 24 48 Время после заражения, ч --Д-.....Ast/HK “Г E а Рис. 1. Изменение в динамике роста инфекционной (в ^ЭИД/мл) (а) и гемагглютинирующей (log2TAE) активности (б) штаммов Ast/HK и Ast/PR8 при накоплении в КЭ. Даны средние значения титров со стандартными отклонениями для трех независимых измерений. По горизонтали - время после заражения (в ч). повышенной 39°С. Инфекционную активность вирусов определяли титрованием в КЭ, рассчитывая 50% эмбриональную инфекционную дозу (ЭИД50/мл) по методу Reed-Muench [11]. Гемагглютинирующую активность определяли по стандартной методике с использованием 0,5% суспензии куриных эритроцитов. Динамику репродукции вакцинных кандидатов изучили, измеряя инфекционную и гемагглютинирующую активность вирусов через 18, 24, 48 и 72 ч после заражения КЭ стандартной дозой 104ЭИД50/КЭ. Морские свинки массой 500-600 г были получены из ФГУП питомник лабораторных животных «Рапполово» РАМН. Перед началом работы животных выдерживали в карантине вивария НИИ гриппа. В исследованиях руководствовались «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (1977). Подготовка вакцинных препаратов. Прототип ЖГВ содержал реассортант Ast/HK, разведенный фосфатносолевым буфером (ФСБ) до концентрации 7 ДОИД5(Умл. Для подготовки прототипов ИГВ вирусы Ast/HK и Ast/PR8 накапливали в КЭ, осветляли, концентрировали, осадок ре-суспендировали в ФСБ, содержащем 0,01М MgSO4, после чего очищали ультрацентрифугированием в ступенчатом градиенте плотности сахарозы (20-60%). Вируссодержащие фракции собирали, разводили указанным буфером, затем центрифугировали. Полученный осадок восстанавливали в указанном буфере и инактивировали 0,025% формалином. Содержание НА в препаратах очищенных вирусов оценивали методом электрофореза в полиакриламидном геле с последующей денситометрией [14]. Иммунизацию морских свинок проводили однократно, без наркоза, каждая опытная группа состояла из 4 животных. 1-й группе животных и/н вводили по 200 мкл прототипа ЖГВ в оба носовых хода в дозе 6,6 ^ЭИД50/животное. 2-й и 3-й группам в/м вводили 100 мкл соответствующего препарата ИГВ (Ast/HK или Ast/PR8) из расчета 10 мкг НА/животное. Контрольным животным в/м вводили ФСБ. Для оценки репродукции реассортанта Ast/HK в верхних дыхательных путях до вакцинации и на 2, 4, 7 и 10-е сутки после получали назальные смывы животных путем промывания носовых ходов 1 мл ФСБ, содержего 200 мкг/мл ампициллина и 0,3% BSA (Sigma, США). Смывы замораживали, хранили при -70°С, затем титровали в КЭ. Системный иммунный ответ оценивали по титру сывороточных АТ в реакциях торможения гемагглютина-ции (РТГА) с 1% лошадиными эритроцитами [16], микронейтрализации (РН) и иммуноферментного анализа (ИФА) [12] до и на 21-е сутки после вакцинации морских свинок. Местные IgG-АТ в носовых смывах животных определяли в ИФА. Защитную эффективность препаратов оценивали по интенсивности репродукции заражающего вируса при реинфекции животных. Для реинфекции через 4 нед после вакцинации животным в каждый носовой ход вводили по 10 мкл вируса Ast/PR8 в дозе 5,27 ^ЭИД50/ животное. На 2, 4, 7 и 10-е сутки после реинфекции собирали назальные смывы и оценивали интенсивность репродукции вируса титрованием в КЭ. Статистический анализ данных проводили в программном пакете GraphPad Prism v5.01 с использованием непараметрических критериев (Манна-Уитни, знаковых рангов Уилкоксона). Результаты При сравнении репродуктивной активности реассор-тантов Ast/PR8 и Ast/HK в КЭ при оптимальной температуре установили, что по этому признаку штаммы практически не отличались. Инфекционная активность достигала 9,5-9,7 ^ЭИД50/мл, а гемагглютинирующая - 1024 ГАЕ. Однако штамм Ast/HK значительно превосходил вирус Ast/PR8 по скорости роста в КЭ при стандартной заражающей дозе 104 ЭИД50 (рис. 1). Репродукция штамма Ast/НК в верхних дыхательных путях животных, получивших ХА-адаптированный препарат, наблюдалась в течение 7 дней, достигая максимального титра (4,2 ^ЭИД50/мл) на 2-е сутки, после чего титр вируса снижался. Через 3 нед после иммунизации во всех группах иммунизированных животных отметили достоверное повышение уровня системных антигемагглютинирующих, нейтрализующих и локальных (IgG) АТ по сравнению с уровнем АТ в контрольной группе (p<0,048, критерий Уилкоксона для выборки и медианы) (рис. 2, а—в). При этом среднегеометрические значения титров системных АТ достоверно не отличались для трех групп животных, получивших живой или инактивированный препараты. Введение прототипа ЖГВ индуцировало образование локальных IgG, титры которых (СГТ = 26,9) достоверно превышали титры, обнаруженные у животных, которые получили прототипы ИГВ (СГТ = 5,7) (рис. 2, г). При реинфекции штаммом Ast/PR8 у контрольных животных данный вирус выделялся из носовых смывов в теа б 8-і 5-і 6- • •• о 4о> О а си 4 — • • ▼ ▼ 2- ▼ т о 5 за о Ё л О ~Г 3 ~Г 2 1 1 Рис. 2. Вирусспецифические АТ в сыворотках крови (а-в) и носовых смывах (г) морских свинок после иммунизации ЖГВ и ИГВ на основе соответствующих вакцинных штаммов. Приведены индивидуальные значения титров АТ по данным РТГА (а), РН (б) и ИФА (в, г). Чертой отмечен среднегеометрический титр для каждой группы животных. *, ** p=0,029 (двусторонний критерий Манна-Уитни). чение 7 сут после заражения. В группах морских свинок, иммунизированных прототипами ИГВ, зафиксировали сокращение срока выделения вируса до 4 сут, а также достоверное снижение его титра на 1,25-2,5 ^ЭИД50 по сравнению с аналогичным показателем у контрольных животных на 2-е и 4-е сутки после инфицирования. Вакцинация прототипом ЖГВ полностью предотвращала выделение вируса, использованного для реинфекции (рис. 3). Обсуждение В наших предыдущих исследованиях была показана безвредность для мышей прототипов ЖГВ и ИГВ, полученных из реассортантов разных сероподтипов на основе штамма A/НК/са. В данной работе мы сравнили иммуногенность и защитную эффективность прототипов ЖГВ и ИГВ, подготовленных из реассортантного штамма Ast/HK подтипа А/ШШ на морских свинках, высоковосприимчивых к инфекции вирусами гриппа разных серотипов, в том числе А/ШШ [18, 19]. В группе животных, иммунизированных прототипом ЖГВ, отметили полное подавление репродукции гомологичного вируса после реинфицирования в отличие от групп, иммунизированных инактивированными препаратами, где наблюдали лишь частичное снижение уровня и продолжительности выделения вируса. Аналогичный результат был продемонстрирован A. Lowen и соавт., которые показали, что иммунизация морских свинок инактивированным препаратом не предотвращала выделения вируса при реинфекции, а иммунизация живым вирусом, аттенуированным за счет транкирования NS-гена, вызывала «стерилизующий» иммунитет [9]. Защищенность морских свинок скорее коррелировала с уровнем вирусспецифических мукозальных IgG, который был наивысшим в группе животных, иммунизированных прототипом ЖГВ, а не с уровнем нейтрализующих АТ, который достоверно не различался во всех группах вакцинированных животных. Необходимо отметить, что иммунизация живым вирусом также стимулирует клеточный иммунитет, который может играть дополнительную роль в обеспечении защищенности животных [5]. При вакцинации людей разница в эффективности живых и инактивированных противогриппозных препаратов менее выражена. Люди неоднократно подвергаются естественной гриппозной инфекции и в Рис. 3. Изменение в динамике выделения вируса из назальных смывов у контрольных и иммунизированных морских свинок после заражения гомологичным вирусом Ast/PR8. Стрелкой отмечен день введения вируса. Приведены средние значения титров (в lg ЭИД5р/мл) по группам и стандартные отклонения. Нижний предел определения инфекционной активности составил 0,8 ^ЭИД50/мл. *, **, ***, **** p<0,029 (односторонний критерий Манна-Уитни). По оси абсцисс - сутки после инфицирования. момент вакцинации могут иметь клетки памяти, которые стимулируются как ЖГВ, так и ИГВ [4]. Отрицательным моментом при иммунизации ЖГВ является активная репродукция вакцинного штамма в верхнем респираторном тракте, так как создает опасность распространения вируса и его генетического материала в популяции. Этот феномен отмечен для обеих лицензированных ХА-вакцин. Так, ХА-вакцинный штамм, полученный на основе низкопатогенного вируса гриппа птиц - А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2), выделялся у привитых людей в течение 11 дней [13]. А в описании ХА-ЖГВ Flumist (США) отмечается, что вакцинный вирус может репродуцироваться до 21 дня. Ограничить репродукцию вакцинного штамма при сохранении защитных свойств возможно при использовании вакцинных кандидатов, аттенуированных за счет удаления NS1-гена [12]. Необходимо отметить, что показатели иммуногенно-сти и защитной эффективности прототипов ИГВ, подготовленных из вакцинных кандидатов на основе стандартного донора PR8 и штамма A/НК/са, достоверно не различались. Интересно, что скорость накопления штамма Ast/HK в КЭ была значительно выше скорости накопления штамма Ast/PR8. Одним из возможных объяснений этого факта может служить различное функциональное соответствие генов реассортанта, например взаимодействие полимеразы PB1 штамма-донора с генными сегментами, кодирующими НА и NA гетерологич-ного птичьего вируса [6, 15]. Результаты проведенных испытаний на морских свинках прототипов ЖГВ и ИГВ, подготовленных из реассор-танта Ast/HK, демонстрируют более высокую защитную эффективность препарата ЖГВ по сравнению с таковой ИГВ и подтверждают перспективность использования штамма А/Гонконг/1/68/162/35(Ю№) в качестве единого донора для подготовки вакцинных и производственных реассортантов.

References

Supplementary files