Herpes Viruses and Male Infertility - Is There Any Relationship?

Full Text

Первая работа об обнаружении герпесвирусов (ГВ) в эякуляте мужчин появилась около 40 лет назад [36]. С тех пор вопрос о связи между герпесвирусными инфекциями (ГВИ) и репродуктивным здоровьем мужчин остается в центре внимания специалистов по теоретической медицине и практическому здравоохранению. В настоящем обзоре суммированы результаты исследований, посвященных анализу вирусного инфицирования эякулята, влиянию ГВИ на сперматогенез и механизмам вертикальной передачи ГВ с мужскими гаметами. В совокупности представленные данные служат, на наш взгляд, серьезным основанием в пользу положительного ответа на поставленный в заглавии вопрос. Частота встречаемости ГВ в эякуляте. В таблице приведены данные о частоте выявления ГВ в эякуляте пациентов с нарушением фертильности и здоровых мужчин. Они показывают, что максимальные и минимальные значения, полученные разными авторами, практически не различаются между сравниваемыми группами. При этом обращают на себя внимание значительные расхождения в частоте выявления вирусов, которые могут быть следствием нескольких причин. Одна из них - различия в чувствительности и специфичности используемых методов детекции (культуральный метод, ПЦР или непрямая иммунофлюоресценция). Другая причина может быть связана с особенностями обследуемого контингента. Показано, что ГВ чаще выявляются у пациентов группы риска по инфекциям, передаваемым половым путем: у работников и клиентов сферы сексуальных услуг [54], мужчин-гомосексуалистов [49, 53], ВИЧ-инфицированных [17, 48, 49], пациентов венерологического профиля [2, 31]. Кроме того, расхождения исследователей в оценке частоты встречаемости ГВ может быть следствием неоднородности распространения ГВ в различных регионах земного шара. Так, частота обнаружения ДНК цитомегаловируса (ЦМВ) в эякуляте пациентов с бесплодием составляет 2-3% во Франции [38, 40], 3,6-8,7% в Германии [15, 16, 26], 7,1-56,5% в Греции [32, 45], 9,6% - в Китае [60], 25% - в США [58], 33% - на Тайване [51]. Аналогично частота выявления ДНК вируса простого герпеса (ВПГ) в эякуляте бесплодных мужчин составляет 3,2-3,7% в Германии [15, 16], 4,8% - в Китае [60], 2,1-49,5% в Греции [32, 34, 45] и 24% в Японии [27]. В России комплексное применение быстрого культурального метода (БКМ), ПЦР и ПЦР in situ при исследовании вирусных маркеров в эякуляте 808 мужчин Контактная информация: Науменко Виктор Алексеевич, канд. мед. наук; e-mail: viro18@mail.ru 4 Частота выявления вирусов семейства Herpesviridae в эякуляте ГВ Частота обнаружения вирусов, % Цитируемый фертильные мужчины мужчины с бесплодием источник ВГЧ-1*(ВПГ-1) 2,5-51 2,1-59 [1, 2, 4, 24, 32, 34, 45, 57] ВГЧ-2 (ВПГ-2) ВГЧ-3 (ВВО)** 1,2 0-3,2 [16, 45] ВГЧ-4 (ВЭБ)*** 45 7,1-39,1 [16, 32, 45] ВГЧ-5 (ЦМВ) 0,4-62,5 0-56,5 [11, 19, 32, 38, 41, 45] ВГЧ-6 70 4-66,3 [16, 45] ВГЧ-7 7 0,4-7 [16, 45] ВГЧ-8 0 0 [16] Примечание.* - формальные названия вирусов герпеса человека (ВГЧ), в скобках - общеупотребительные; ** - вирус ветряной оспы и опоясывающего лишая; *** - вирус Эпштейна-Барр. позволило выявить ВПГ у 27,2% обследованных, ЦМВ - у 8,8%. Одновременно маркеры ВПГ и ЦМВ были обнаружены в 4,4% случаев [6]. Сравнительный анализ показал, что ГВ чаще выявляют в эякуляте с декабря по февраль по сравнению с остальными месяцами года: соответственно 34% против 24,5% для ВПГ (р = 0,019) и 15,7% против 6,8% для ЦМВ (р = 0,007). Обнаруженные сезонные колебания, возможно, связаны с изменениями температуры окружающей среды и/или отражают зимнюю иммунодепрессию, вследствие чего происходит реактивация ГВ. Данные о сезонных колебаниях частоты выявления ГВ имеют важное клиническое значение, поскольку дают возможность уменьшить риск горизонтальной и вертикальной передачи ВПГ и ЦМВ при планировании естественной беременности, а также при лечении бесплодия методами вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). Важное значение имеют данные о более высокой частоте выявления инфекционно-активного ВПГ у пациентов с бесплодием по сравнению со здоровыми мужчинами как в цельном эякуляте (31% против 17%), так и во фракции подвижных сперматозоидов (30% против 8%). Аналогичные результаты получены методом ПЦР in situ: ВПГ обнаружен у 26% пациентов с бесплодием и у 2,6% мужчин контрольной группы [7]. Два других независимых исследования также указывают на корреляцию частоты встречаемости ВПГ в эякуляте и нарушений фертильности. N. Borai и соавт. выявили ДНК ВПГ в 24% образцов эякулята мужчин с бесплодием, но не обнаружили вирусную ДНК в контрольной группе [27]. Использование ДНК-гибридизации in situ позволило D. Kotronias и соавт. выявить ДНК ВПГ в сперматозоидах у 46% мужчин с проблемами фертильности, что в 3 раза чаще, чем у здоровых мужчин [34]. Частота встречаемости ЦМВ, согласно полученным результатам, не отличается у фертильных и бесплодных мужчин. Информативный подход к изучению взаимосвязи между ГВИ и нарушением фертильности состоит в изучении влияния вирусов на показатели качества спермы. Данные, полученные при изучения этого вопроса, неоднозначны. Так, D. Kotronias и соавт. установили корреляцию между инфицированием ВПГ и снижением подвижности мужских гамет [34]. Та же группа авторов сообщила о снижении концентрации сперматозоидов и их подвижности в группе лиц, выделяющих ДНК ВПГ с эякулятом [32]. Концентрация сперматозоидов в пробах, содержа щих ДНК вируса, составила 20 млн/мл, в неинфициро-ванных образцах - 55 млн/мл; доля подвижных форм - 39 и 49% соответственно. G. Bezold и соавт. [15] отмечали значительное снижение концентрации сперматозоидов (34 млн/мл против 77 млн/мл) и их подвижности (39% против 58%) у мужчин с ВПГ в эякуляте по сравнению с неинфицированными лицами. K. Wu и соавт. также показали значительное снижение концентрации сперматозоидов в образцах, содержащих ВПГ, по сравнению с неинфицированными пробами [60]. Другие авторы при обследовании пациентов, обратившихся по поводу бесплодия в браке, не выявили различия по основным показателям спермограммы у ВПГ-инфицированных пациентов и в группе контроля [1]. В результате обследования 29 пациентов с вирусным инфицированием эякулята Е.Н. Бочарова и соавт. также не обнаружили влияния ВПГ на показатели спермограммы [2, 3]. Не обнаружено значимое влияние ВПГ на показатели качества спермы и в двух исследованиях последних лет [16, 45]. Однако при детальном изучении сперматозоидов было показано, что такие морфологические дефекты, как микроголовки и сохранение цитоплазмаи-ческой капли на шейке коррелировали с обнаружением ВПГ в эякуляте [1]. О негативном воздействии ЦМВ на показатели качества спермы свидетельствуют работы D. Lang и соавт. [36, 37]. В серии экспериментов авторы показали, что у пациентов с мононуклеозоподобным синдромом ЦМВ-этиологии высокая концентрация вируса в эякуляте коррелировала с транзиторным снижением подвижности сперматозоидов. K. Wu и соавт. указывают на уменьшение концентрации сперматозоидов у пациентов, выделяющих ЦМВ с эякулятом [60]. В то же время другие исследователи сходятся во мнении об отсутствии влияния ЦМВ на показатели спермограммы [15, 26]. При анализе литературных данных обращает на себя внимание тот факт, что среди исследователей, сообщающих о негативном влиянии ГВ на сперматогенез, нет единства в определении характера этого влияния: в одних работах имеются указания на снижение концентрации сперматозоидов [15, 32, 60], в других - на снижение подвижности [34, 36, 47], в третьих - на нарушение морфологии [1, 60]. Возможно, различия в оценке влияния вируса на качество спермы связаны с высокой вариабельностью показателей спермограммы. Учитывая значительный разброс исследуемых признаков, можно предположить, что установить их отклонение под воздействием какого-либо фактора можно только при большом объеме выборки. Данные, полученные нами при изучении 315 спермо-грамм мужчин, свидетельствуют о негативном влиянии ВПГ на подвижность сперматозоидов и количество морфологически нормальных гамет в эякуляте [6]. При наличии инфекционно-активного ЦМВ в эякуляте концентрация сперматозоидов оказалась в 1,7 раза ниже, чем в его отсутствие, однако статистический анализ различий (р = 0,058) позволяет судить лишь о тенденции к снижению данного показателя. Влияние ЦМВ на подвижность и морфологию сперматозоидов в эякуляте выявлено не было. О влиянии других ГВ на показатели спермограммы известно немного. В двух исследованиях, предусматривающих изучение вирусов герпеса человека 1-8-го типа, не обнаружено воздействия вирусов на качество спермы [16, 45]. До 80-х годов прошлого века для изучения сперматогенеза проводили исследование гистологических срезов или отпечатков, приготовленных из биопсийного материала яичек. Однако было показано, что данная процедура может привести к развитию аутоиммунных 5 процессов. Метод количественного кариологического исследования незрелых половых клеток (НПК) в эякуляте, разработанный Л.Ф. Курило [8], позволяет оценить процессы, происходящие в семенных канальцах, без инвазивного вмешательства. С использованием данного метода было обследовано 128 пациентов с нарушениями фертильности, в том числе 89 ВПГ-инфицированных, 20 ЦМВ-инфицированных и 25 мужчин без вирусных маркеров в эякуляте (контрольная группа). Сравнительный анализ НПК и клеток с патологически измененной структурой показал увеличение числа дегенеративных половых клеток у мужчин, в эякуляте которых обнаружен ВПГ или ЦМВ (16,2% против 7,6% в контроле, p < 0,05). Полученные результаты согласуются с данными K. Wu и соавт., которые обнаружили в эякуляте, инфицированном ВПГ и ЦМВ, увеличение числа клеток с признаками дегенерации: пикнотичными ядрами, вакуолизацией хроматина, нарушениями целостности ядерной оболочки, наличием телец апоптоза [60]. Кроме того, в группе пациентов с высокой вирусной нагрузкой дополнительно к указанным изменениям выявлено снижение числа сперматид по сравнению с контролем (78,3% против 86,5%, p < 0,05), что свидетельствует о гибели или замедлении развития половых клеток [8, 43]. Изучение влияния ГВ на сперматогенез на экспериментальных моделях. Для изучения роли различных факторов, влияющих на сперматогенез, используются экспериментальные модели: клеточные и органные культуры; лабораторные, в том числе трансгенные, животные. При культивировании ВПГ со сперматозоидами in vitro не было выявлено влияние вируса на качество спермы при рутинном анализе спермограммы [47]. Однако использование компьютерной методики подсчета клеток позволило выявить снижение количества подвижных сперматозоидов при культивировании с ВПГ по сравнению с контрольной группой. Кроме того, в присутствии вируса было показано увеличение значений таких специальных показателей, как скорость циркулярного движения, средняя амплитуда латерального отклонения головки, линейное ускорение, а также снижение процента линейности. Воздействие ЦМВ на сперматозоиды в аналогичном эксперименте не обнаружено [47]. Эксперименты на химерных животных позволили исследователям раскрыть некоторые молекулярные механизмы влияния ВПГ на сперматогенез. У трансгенных мышей со встроенным геном тимидинкиназы ВПГ-1 (HSV1-tÆ), были выявлены нарушения фертильности у самцов. При этом показано, что в семенниках на фоне повышенной экспрессии HSV1-tk происходит апоптоз сперматогониев, сперматоцитов, сперматид [20], появляются акросомные аберрации, а также структурные аномалии шейки и жгутика сперматозоида [30]. Предположительно вследствие ферментативной активности тимидинкиназы, накапливающейся в цитоплазме спер-матид, происходит истощение запасов АТФ, необходимых для дальнейшего созревания половых клеток, что и лежит в основе нарушения фертильности у трансгенных мышей [20]. Для изучения влияния ГВ на сперматогенез мы получили органную культуру семенника мыши, а затем яичка человека, на которых показали гаметотоксический эффект ВПГ и ЦМВ [5, 9]. Так, на 14-й день инфекции количество сперматогониев в органной культуре яичка человека, зараженной ВПГ, было снижено по отношению к контролю на 54%, сперматоцитов - на 65%, круглых сперматид - на 72% [8]. Аналогичные данные были получены при заражении ЦМВ [43]. Методами иммуногистохимии и электронной микроскопии была подтверждена способность ГВ проникать в незрелые половые клетки [7, 43]. Для оценки воздействия ВПГ на отдельные стадии цитодифференцировки нами была получена органная культура семенников мышей-сосунков. Кратковременное культивирование эксплантов семенников 9-дневных мышей позволило анализировать дифференцировку сперматогониев в сперматоциты. Было показано, что через 5 дней в контрольной культуре в 19% семенных канальцев появляются сперматоциты, в то время как при ВПГ-инфекции дифференцировка сперматогониев в сперматоциты завершается только в 8% канальцев (p < 0.05). В аналогичном эксперименте с семенниками 17дневных мышей было изучено прохождение половыми клетками мейотического деления в присутствии ВПГ: после 5 дней в культуре блок мейоза наблюдался в 60% канальцев инфицированных семенников. Моделирование инфекционного процесса in vivo проводили путем внутрибрюшинного заражения 7-9дневных мышей ВПГ. Это позволило нам изучать динамику инфекционного процесса, начиная со стадии, предшествующей формированию гематотестикулярного барьера (у мыши - 15—17-й день после рождения). Было показано, что в течение первых 7 дней после заражения происходит накопление вирусной ДНК и вирусных белков в семенниках, после чего наблюдается постепенная элиминация вируса из органа. Представляют интерес данные гистологического анализа, который показал, что морфологические нарушения в семенниках не уменьшаются, а, напротив, с течением времени нарастают. Так, количество канальцев, содержащих половые клетки с признаками апоптоза в семенниках инфицированных животных, увеличивается в 2 раза с 3-го по 27-й день инфекции, а в семенниках неинфицированных мышей не изменяется. При этом число канальцев с признаками активной пролиферации половых клеток в инфицированной культуре оказывается сниженным по сравнению с контролем, начиная с 7-го дня инфекции, без тенденции к последующему восстановлению. Расхождение во времени между максимальной вирусной нагрузкой и морфологическими нарушениями свидетельствует о том, что воздействие вируса на сперматогенез, вероятно, носит не только прямой, но и опосредованный характер. Можно предположить, что вирус запускает патогенетические механизмы, которые продолжают действовать и после его элиминации из тканей семенника. Возможно, ВПГ-инфекция провоцирует систему интерферона на повышенную экспрессию генов, продукция которых оказывает мощное негативное действие на мужские половые клетки [50]. Другой возможный механизм - снижение иммунологической толерантности к мужским половым клеткам в результате нарушения гематотестикулярного барьера. В пользу последнего механизма свидетельствуют полученные нами данные ультраструктурного анализа сперматозоидов инфицированных мышей: до 15% гамет находились внутри фаголизосом макрофагов. Полученные данные позволяют предположить, что одним из механизмов нарушения фертильности является неадекватно повышенный иммунный ответ на вирусную инфекцию, который может индуцироваться на разных стадиях онтогенеза, в том числе в препубертатном периоде. О роли ГВ в нарушении фертильности у мужчин косвенно свидетельствуют также данные об эффективности терапии ex juvantibus. Сообщалось о наступлении беременности у трех ранее бесплодных пар после прохождения партнером курса противовирусной терапии [34]. Другие авторы указывают на эффективность лечения ацикловиром у 5 из 12 бесплодных пар [35]. Роль мужского фактора в вертикальной передаче ГВ. Известно, что ВПГ и ЦМВ передаются половым путем и могут реплицироваться в эпителиальных клетках уро 6 генитального тракта. Кроме того, ВПГ и ЦМВ обнаружены в эпидидимисе [21], простате [18, 42], семенных пузырьках [23, 33] - органах, принимающих участие в формировании семенной жидкости. Репликация ГВ в указанных органах может быть источником накопления вирусов в эякуляте в составе внеклеточной фракции. Возможность внутригаметной ГВИ остается предметом научной полемики. В нескольких независимых исследованиях показано, что инкубация сперматозоидов человека с ВПГ и ЦМВ in vitro не приводит к проникновению вируса в клетку [24, 47, 52]. Однако в последнее время накапливаются данные о выявлении маркеров ГВ в мужских гаметах ex vivo. В сперматозоидах из эякулята обследованных мужчин выявляют ДНК ВПГ и ЦМВ методом ПЦР [2, 6], ПЦР in situ [7], ДНК-гибридизации [46], ДНК-гибридизации in situ [34]. Есть сообщения об обнаружении в сперматозоидах антигенов ГВ [3], а также инфекционной активности ВПГ и ЦМВ [6]. Методом электронной микроскопии в цитоплазматической капле сперматозоидов обнаружены вирусоподобные частицы, морфологически идентичные нуклеокапсидам ГВ [4]. Для разрешения указанного противоречия была предложена гипотеза, согласно которой ГВ попадают в гаметы на этапе пролиферации и дифференцировки половых клеток в яичке [4, 28]. Действительно, в ряде работ описано выявление в мужских гонадах маркеров ВПГ [10, 23, 24] и ЦМВ [22, 25, 39], однако мнения исследователей относительно клеток-мишеней вирусов расходятся. В некоторых работах показано присутствие ГВ в клетках герминативного эпителия - сперматоцитах [14, 28], сперматидах [12], сперматозоидах [14, 28]. Другие авторы указывают на то, что источником репликации ГВ в яичке служат соматические клетки: Лейдига [12], пери-тубулярные и эндотелиальные клетки интерстиция [55]. Изучая органную культуру яичка человека, мы использовали методы иммуногистохимии и электронной микроскопии для определения возможности вирусного инфицирования половых и соматических клеток семенника. Полученные результаты убедительно свидетельствуют в пользу присутствия ВПГ и ЦМВ не только в соматических (клетках Лейдига и Сертоли, фибробластах, миоидных клетках), но и, что более важно, в клетках-предшественниках сперматозоидов (сперматогониях, сперматоцитах, сперматидах). Нам не удалось выявить инфицированные сперматозоиды на ранних стадиях заражения, что согласуется с ранее полученными данными о невосприимчивости зрелых мужских гамет к ГВИ. Однако исключительно важным представляется выявление ВПГ и ЦМВ в сперматозоидах на поздних сроках инфекции [7, 43]. У человека для образования сперматозоидов из ранних сперматид требуется около 2 нед. Наличие маркеров вируса в сперматидах с первых дней инфекции дает основание предположить, что инфицированные клетки продолжают спермиогенез, и через 14 дней это приводит к формированию сперматозоидов, содержащих вирус. Следует отметить, что количество вирусных частиц в клетках интерстиция значительно превышает вирусную нагрузку в половых клетках. Возможно, относительно низкий уровень содержания ГВ в герминативных клетках позволяет им завершить последующие этапы созревания. Для оценки внутригаметной локализации ГВ в образцах эякулята мы использовали метод ПЦР in situ, который дает возможность визуализировать вирусную ДНК в мужских гаметах в виде метки и оценить количество сперматозоидов, пораженных вирусом. В условиях наших опытов доля ВПГ-инфицированных сперматозоидов в образцах составляла от 0,5 до 3,2% (в среднем 1,5%) от общего числа гамет. В пробах, содержащих ЦМВ, пораженными оказались от 0,25 до 15% (в сред нем 1,7%) сперматозоидов. Как следует из полученных результатов, большая часть подвижных сперматозоидов в инфицированном эякуляте свободна от вируса. По всей видимости, вероятность оплодотворения яйцеклетки инфицированным сперматозоидом, которую можно соотнести с долей зараженных гамет, в среднем составляет 1,5% [7, 43]. Некоторые исследователи пытаются воспроизвести вертикальную передачу ГВ с гаметами на животных моделях. Так, P. Neighbour и соавт. [44] при инкубации ооцитов и сперматозоидов с мышиным ЦМВ in vitro наблюдали присутствие неинфекционных вирусных частиц в перивителиновом пространстве. Учитывая, что zona pellucida защищает ооцит от проникновения вирусов, авторы предположили, что вирус попадает в яйцеклетку вместе со сперматозоидом. Показана контаминация эмбрионов коровы, полученных in vitro, ГВ коров и вирусом диареи коров при использовании инфицированных сперматозоидов [59]. При применении другого способа заражения - микроинъекции ДНК ЦМВ мыши в мужской пронуклеус зиготы мыши J. Baskar и соавт. наблюдали уменьшение размеров плаценты, а также задержку и аномалии развития плода. Наличие ДНК ЦМВ мыши в тканях плода было показано методом ПЦР и ДНК-гибридизации [13]. Заражение эмбриона при инъекции вирусной ДНК в мужской пронуклеус имеет важное клиническое значение, так как означает возможность заражения яйцеклетки при лечении бесплодия методами ВРТ. Другие авторы при инъекции мышиного ЦМВ в мужской пронуклеус зиготы мышей выявляли вирусную ДНК до формирования бластоцисты у 56% эмбрионов, однако при формировании плода ДНК не определялась, заражение вирусом не влияло на выживаемость эмбрионов и не вызывало признаки ЦМВ-инфекции у потомства [55, 56]. Возможность вертикальной передачи с гаметами предполагают также для вируса герпеса человека 6-го типа. Стратегия данного вируса отличается от таковой других представителей семейства Herpesviridae: ДНК вируса способна встраиваться в теломерные участки хромосом (в том числе половых клеток), что обеспечивает репликацию генетического материала вируса при каждом клеточном делении [29]. Заключение. В совокупности данные о высокой частоте выявления ВПГ в эякуляте мужчин с бесплодием, ухудшении показателей качества спермы, изменении состава популяции НПК у ВПГ-инфицированных лиц, а также о прямом и опосредованном гаметотоксическом воздействии вируса в экспериментальных модельных системах указывают на то, что ВПГ играет определенную патогенетическую роль в формировании мужского бесплодия. Вопрос об этиологической роли ЦМВ в развитии бесплодия у мужчин остается спорным. С одной стороны, описаны нарушения в составе популяции половых клеток как методом количественного кариологического анализа в эякуляте ЦМВ-инфицированных мужчин, так и на модели ЦМВ-инфекции яичка in vitro. С другой стороны, большинство исследователей указывают на отсутствие влияния вируса на показатели спермограм-мы. Учитывая относительно низкую частоту выявления ЦМВ в эякуляте, можно предположить, что изучение более репрезентативных популяционных групп мужчин с нарушениями фертильности позволит выяснить роль ЦМВ в развитии у них бесплодия. Результаты проведенных работ имеют значение не только для фундаментальной вирусологии и теоретической медицины. Они важны также для практического здравоохранения. Установление связи между ГВИ эякулята и бесплодием у мужчин указывает на необходи 7 мость включения исследования эякулята на маркеры ГВ (методом ПЦР, БКМ) в алгоритм диагностики мужского бесплодия. Выполнение данного вида исследования может быть рекомендовано также при использовании ВРТ или естественном планировании беременности для предотвращения риска вертикальной передачи ГВ с мужскими гаметами. Этиологическая расшифровка диагноза при мужском бесплодии открывает перспективы использования специфической противовирусной терапии в лечении данных пациентов.

References

Supplementary files