Enhancing the immunogenic activity of Influvac vaccine in the use of adjuvant TI complexes modified by echinochrome A

Full Text

Вакцинные препараты, построенные из субъеди-ничных природных вирусных белков или из генноинженерных либо химически синтезированных антигенов, являются более безопасными в сравнении с цельновирионными или сплит-вакцинами. Однако они, как правило, индуцируют менее выраженный специфический иммунный ответ, сила которого может быть недостаточной для обеспечения эффекта протективности. С целью повышения иммуногенно-сти таких вакцин используются различные технологические подходы, в частности предусматривающие использование адъювантных носителей липидной природы типа липосом и иммуностимулирующих комплексов (ИСКОМ), основой которых является липид-сапониновая матрица (ЛСМ), способная включать в свой состав белковые антигены, имеющие гидрофобные или амфифильные свойства [3, 6]. Известно, что процессы иммунологического распознавания чужеродных антигенов в значительной степени зависят от формы пространственной организации вирусных антигенов [5]. Коллоидные и мульти-мерные формы субъединичных вакцин могут имитировать естественную форму презентации антигенов и в результате обладают повышенной иммуногенно-стью в сравнении с обычной растворимой формой антигенов. Включение вирусных белков в липидные суперструктуры типа липосом и ИСКОМ позволяет увеличить их иммуногенность за счет более эффективной презентации антигена иммунокомпетентным клеткам, сочетания антигена с адъювантными компонентами, а также защиты антигена от действия протео-литических ферментов внутренней среды организма и обеспечения, таким образом, эффекта пролонгации антигенного раздражения. Особенно актуальным является создание эффективных и безопасных вакцинных препаратов, способных обеспечить быстрое формирование протективного иммунного ответа к инфекционным агентам, вызывающим поражение большого процента населения при эпидемических вспышках. К таким эпидемически значимым возбудителям относятся вирусы гриппа, борьба с которыми ведется уже длительное время. Имеется большой арсенал вакцин различного типа, однако проблема контроля гриппозной инфекции по-прежнему актуальна и даже обостряется в последние годы ввиду опасности образования вирусных рекомбинантных мутантов. В связи с вышеперечисленными тенденциями особый интерес представляет разработка вакцинных препаратов, способных индуцировать сравнительно быстрый, но эффективный и длительный иммунный ответ. Решение подобной проблемы вряд ли возможно без применения адъювантного сопровождения в отношении гриппоспецифических антигенов. Многообещающим подходом в этом направлении является использование в качестве адъювантов различных ЛСМ. ИСКОМ уже более 20 лет считаются одними из самых перспективных носителей и адъювантов для антигенов. Однако реальное применение в клинике инфекционных заболеваний человека и животных они пока не получили ввиду известного побочного действия ИСКОМ - гемолитической активности сапонинов QuillA, необходимых для формирования ЛСМ в присутствии полярных липидов и холестерина [3, 6]. В значительной степени эти проблемы решены нами путем замены сапонинов QuillA на структурно охарактеризованный индивидуальный тритерпеновый гликозид кукумариозид A2-2 (КД), выделенный из дальневосточной голотурии Cu-cumaria japonica [1]. КД оказался способным в присутствии фосфо- или гликолипидов и холестерина к формированию тубулярного типа суперструктур, названных нами тубулярными иммуностимулирующими комплексами (ТИ-комплексами) [3, 4]. При этом замена фосфолипида на гликолипид моногалактозил-диацилглицерол (МГДГ), выделенный из различных морских макрофитов, приводила к усилению имму-ноадъювантной активности таких модифицированных комплексов в отношении бактериального антигена - порового белка из Yersinia pseudotuberculosis [4]. В данной работе впервые проведена оценка имму-ноадъювантной активности ТИ-комплексов в отношении субъединичных вирусспецифических антигенов. Исследована способность этих носителей встраивать антигены субъединичной вакцины Инфлювак в ЛСМ. Изучена также возможность повышения адъювантной активности ТИ-комплексов путем дополнительного встраивания в ЛСМ молекул эхинохрома А (ЭХА), обладающих антиоксидантной активностью и способных повышать устойчивость липидсодержащих ТИ-комплексов к перекисному окислению. Материалы и методы В работе использовали крыс линии Вистар (самки массой 220-250 г). Животные содержались в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986). МГДГ получали из морской травы Ulva fenestrata согласно данным в работе [3]. КД (кукумариозид A2-2) - тритерпеновый гликозид из C. japonica был любезно предоставлен В. М. Богуславским (лаборатория химии морских природных соединений ТИБОХ ДВО РАН (зав. лабораторией акад. РАН В. А. Стоник). ТИ-комплексы получали методом гидратации липидных пленок [4]. В качестве антигена (АГ) использовали вакцинный препарат Инфлювак (“Solvay Pharma”, Нидерланды), содержащий субъединичные антигены гемагглюти-нин (ГА) вирусов гриппа типов A и B в дозе 90 мкг/мл и нейраминидазу. Дозировку вирусных АГ определяли по содержанию ГА. Введение АГ в ТИ-комплексы осуществляли путем добавления раствора смеси АГ вакцины Инфлювак к суспензии ЛСМ [4]. Для исследования включения АГ в ТИ-комплексы были приготовлены препараты состава МГДГ-холестерин-КД-АГ (соотношение 6:2:3:1,5 по массе). Полученные препараты ТИ-комплексов с вакцинными АГ центрифугировали в течение 25 мин (6000 g при комнатной температуре). Концентрацию несвязанного белка определяли в супернатанте по методу Лоури. Эффективность включения АГ в ТИ-комплексы контролировали по активности ГА в реакции гемагглютинации (РГА). В качестве тест-системы использовали 0,5% взвесь эритроцитов человека группы 0 (I). Эффективность включения нейраминидазы не оценивали. Морфологию ЛСМ и ТИ-комплексов (ЛСМ с антигеном) изучали с помощью метода трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) при негативном контрастировании фосфорновольфрамовокислым калием (ФВК). Исследование образцов и фотографирование проводили на трансмиссионном электронном микроскопе JEM-100S (“Jeol”, Япония). Модификацию матрицы ТИ-комплексов производили ЭХА - полигидроксинафтохиноном, выделенным из плоского морского ежа Scaphechinus mirabi-lis, по разработанной ТИБОХ ДВО РАН технологии. ЭХА добавляли к матрице одновременно с АГ. При иммунизации животных модифицированными ТИ-комплексами дозы ЭХА были эквивалентны 4 мг на 1 кг массы тела. Сформированы 5 экспериментальных групп по 10 животных в каждой: К - контрольная группа крыс, получавших только инъекцию фосфатно-солевого буфера (ФСБ); АГ - крысы, иммунизированные антигенами вакцины; (АГ + ТИ) - крысы, иммунизированные антигенами вакцины в составе ТИ-комплексов; (АГ + ТИ + ЭХА) - крысы, иммунизированные антигенами вакцины в составе ТИ-комплексов, модифицированных ЭХА; (АГ + ЭХА) - крысы, иммунизированные антигенами вакцины в смеси с ЭХА. Животных иммунизировали однократно подкожно (п/к) в дозе, соответствующей 1 мкг ГА на крысу (в объеме 0,2 мл ФСБ). Содержание специфических антител определяли в сыворотке крови крыс через 10 и 30 сут после иммунизации методом иммуноферментного анализа (ИФА). Сенсибилизацию твердой фазы производили антигенами вакцины Инфлювак из расчета 1 мкг ГА на лунку 96-луночного планшета. Концентрацию антител выражали в единицах оптической плотности (ОП) при длине волны 450 нм. Параллельно исследуемые сыворотки крови тестировали в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) по общепринятой методике. Титры антигемагглютинирующих антител выражали в log по основанию 2. Статистическую обработку результатов проводили с использованием прикладной программы SPSS 11/0 с определением критерия достоверности Фишера-Стьюдента. Различия между двумя средними считали достоверными при p < 0,05. Уровень надежности составлял 95% и более. Результаты и обсуждение При изучении включения АГ в ТИ-комплексы установлено, что белковые АГ вакцины Инфлювак включаются в состав ТИ-комплексов с высокой эффективностью. При весовом соотношении 1 часть ТИ-комплексов и 0,5 части АГ (расчет проводили по содержанию ГА) эффективность включения вакцинных белков составила 72%. Гемагглютинирующая активность ТИ-комплексов, сенсибилизированных вирусными АГ, составляла 86,7% от соответствующей активности вакцины Инфлювак, взятой в объеме, эквивалентном добавленному к ТИ-комплексам. Это позволяет говорить о возможности построения вакцинных конструкций на основе ТИ-комплексов и субъединичных вирусных АГ. Тот факт, что ТИ-комплексы, сенсибилизированные АГ, проявляют 86,7% гемагглютинирующей активности относительно исходного препарата Инфлювака (при 72% общей эффективности включения белков), позволяет предположить, что происходит более интенсивное включение именно ГА в сравнении с нейраминидазой и сопутствующими альбуминами. Гемагглютинирующая активность ТИ-комплексов, сенсибилизированных вакцинными АГ, сохранялась не более 1 мес в условиях хранения приготовленного препарата при 4oC. При увеличении срока хранения комплекс проявляет признаки неустойчивости и легко подвергается деградации. Очевидно, это является следствием большой молекулярной массы (м. м.) вакцинных АГ и их амфифильных свойств. При использовании АГ с гидрофобными свойствами и меньшей м. м. (например, субъединичного мономера порового белка Yersinia pseudotuberculosis, имеющего м. м. 30 кДа) комплекс сохраняет свою активность более 6 мес. Можно предположить, что использование отдельных эпитопов вирусных АГ с относительно небольшой м. м. позволит получать вакцинные препараты на основе ТИ-комплексов, способные к длительному сохранению своей иммуногенной активности. Механизм встраивания АГ вакцины Инфлювак в ТИ-комплексы требует отдельного детального изучения. На данном этапе, учитывая большую м. м. и амфифильные свойства вакцинных АГ, можно предположить, что реализуются механизмы адсорбционного типа преимущественно за счет водородных связей и, возможно, ионных взаимодействий молекул АГ с сульфатными группами КД, входящего в состав ТИ-комплексов. Исследование препаратов ТИ-комплексов, содержащих вакцинные АГ, методом ТЭМ показало, что на торцах частиц возникают характерные “шапочки” (рис. 1). Молекулы ГА при встраивании в ТИ-комплексы, очевидно, подвергаются определенным конформа- Рис. 1. Электронная микрофотография ТИ-комплексов, нагруженных антигенами вакцины Инфлювак. Метод: ТЭМ. Окрашивание: негативное контрастирование ФВК. Калибровочная шкала 100 нм. Ув. 160 000. ТИ - ТИ-комплексы; ЛА -локализация антигена в ТИ-комплексах. ционным изменениям. Однако их активные центры остаются функциональными: они сохраняют гемагглютинирующую способность. При этом ге-магглютинирующая активность препаратов ТИ-комплексов определяется количеством введенного в них ГА. Способность ГА в составе ТИ-комплексов агглютинировать эритроциты свидетельствует о локализации молекул ГА на внешний поверхности ТИ-комплексов. Вероятным местом локализации этого АГ являются “шапочки”, появляющиеся на ТИ-комплексах с АГ и отсутствующие на частицах ЛСМ. В экспериментах in vivo показано, что иммунизация животных вакциной Инфлювак вызывает индукцию гуморального иммунного ответа, приводящего к образованию специфических антител, определяемых в Ряд 1 Ряд 2 Рис. 2. Содержание противогриппозных антител в сыворотке крови крыс линии Вистар через 10 и 30 дней после иммунизации антигенами вакцины Инфлювак из расчета 1 мкг ГА/мышь. По оси абсцисс - экспериментальные группы животных (см. в тексте). По оси ординат - ОП при 450 нм. Ряд 1 - данные, полученные через 10 сут после иммунизации; ряд 2 -данные, полученные через 30 сут после иммунизации. сыворотке животных методом ИФА через 10 дней после однократной иммунизации (рис. 2). Иммунный ответ не характеризовался высокой напряженностью, имел место умеренный прирост антител. В параллельно поставленной РТГА титр антител составлял 7,9 ± 0,6 log2. Иммуногенность вакцины при таком режиме иммунизации можно охарактеризовать как умеренную. В случае иммунизации АГ в составе ТИ-комплекса иммунный ответ был более выраженным (p < 0,05). Разница в содержании противовирусных антител сохранялась и через 30 дней после иммунизации, однако уже не была статистически достоверной (см. рис. 2). Таким образом, применение ТИ-комплексов позволяет достигнуть именно более раннее и более интенсивное развитие гуморального иммунного ответа при использовании малых доз АГ вакцины. В целях усиления адъювантных свойств ТИ-комплекса произведена его модификация: в его структуру был дополнительно введен нафтохино-новый препарат ЭХА, обладающий широким спектром медико-биологической активности, но наиболее известный как природный антиоксидант [2, 7]. Комбинация ТИ-комплекса с ЭХА оказалась более эффективной адъювантной конструкцией в отношении АГ вакцины, приводя к повышению при экспериментальной иммунизации уровня специфических антител (p < 0,01). Повышенные титры противогриппозных антител в этой группе сохранялись и через 30 дней после иммунизации (см. рис. 2). Данный эффект молекул ЭХА, обладающих высоким сродством к липидам, по-видимому, обусловлен его стабилизирующим действием на липидные компоненты ТИ-комплексов, имеющие высокое содержание полиненасыщенных жирных кислот [3]. Благодаря предотвращению перекисного окисления липидов происходит общая стабилизация ТИ-комплекса и защита АГ от действия протеолитических ферментов внутренней среды организма. В результате может иметь место пролонгация экспозиции АГ и усиление иммунного ответа. Такая трактовка эффекта ЭХА в составе ТИ-комплекса обусловлена тем обстоятельством, что ЭХА не проявил самостоятельную адъювантную активность. При иммунизации животных смесью АГ и ЭХА иммунный ответ на вакцинные АГ оказался более слабым, чем в случае иммунизации только АГ. Эта негативная тенденция проявлялась через 10 дней после иммунизации, а к 30-м суткам исчезала, в результате чего уровень иммунного ответа оказывался сопоставимым с показателями животных, иммунизированных только АГ. Наиболее вероятно, что этот транзиторный эффект торможения антителогенеза обусловлен ярко выраженными антиоксидантными и противовоспалительными свойствами ЭХА [2, 7], приводящими в итоге к снижению специфического иммунного ответа как гуморального, так и клеточного типа (это ранее было подтверждено нами в серии работ по иммунизации экспериментальных животных стандартным тест-антигеном - эритроцитами барана). Таким образом, в результате проведенных экспериментов установлено, что АГ вакцины Инфлювак способны встраиваться в ТИ-комплексы, сохраняя при этом свою иммуногенность и гемагглютинирую-щую активность. ТИ-комплексы, являясь носителем и адъювантом для этих АГ, обеспечивают усиление специфического иммунного ответа гуморального типа. Встраивание ЭХА в ТИ-комплексы приводит к повышению их иммуноадъювантного потенциала путем активации гуморального звена иммунного ответа. При этом ЭХА не проявляет собственную имму-ноадъювантную активность в отношении АГ вируса гриппа. Результаты работы подтверждают возможность использования ТИ-комплексов как носителя и адъюванта для комплекса АГ вакцинного препарата Инфлю-вак, содержащего субъединичные АГ вируса гриппа. Логическим развитием полученных в данной работе результатов будет проведение дальнейших экспериментов, посвященных возможности построения на основе ТИ-комплексов вакцинных препаратов, содержащих индивидуальный гриппоспецифический ГА и его отдельные эпитопы. Работа поддержана грантом Правительства РФ (ГК № 11.G34.31.001) и грантом аналитической ведомственной целевой программы “Развитие научного потенциала высшей школы” (2009-2010 гг.) по проекту № 2.2.2/603.

References

Supplementary files