A new unique HIV-1 recombinant form detected in Belarus

Abstract

The paper presents data on the molecular genetic characteristics of a new HIV-1 recombinant form. The study has shown that the virus is referred to as HIV-1 subtype B in terms of the gag gene and HIV-1 subtype A in terms of the pol and env genes. At the same time the new isolate is closer, in terms of the gag gene, to the HIV-1 DQ207943 strain isolated in Georgia, in terms of the pol gene, to the HIV-1 AF413987.1 strain isolated in Ukraine and, in terms of the env gene to the HIV-1 AY500393 strain isolated in Russia. Thus, the described new HIV-1 recombinant form has the following structure: BgagApolAenv The gag, pol, and env gene sequences from the new unique HIV-1 recombinant form have been registered in the international database EMBL/Genbank/DDBJ under accession numbers FR775442.1, FN995656.1, and FR775443.1.

Full Text

В настоящее время в мире, по расчетным данным ЮНЭЙДС, проживают более 30 млн больных с ВИЧ/ СПИДом, а ежегодные потери от данного заболевания составляют около 3 млн человек [1]. В Республике Беларусь на 1.05.11 официально зарегистрировано 12 133 случая ВИЧ-инфекции (128 на 100 тыс. населения). В течение последних лет в стране наблюдается стабильно высокий прирост случаев ВИЧ/СПИДа - более 1000 новых случаев ежегодно [www.aids.by]. Филогенетический анализ штаммов ВИЧ-1, изолированных в разных географических регионах, показал, что все эти вирусы могут быть разделены на группы, субтипы и циркулирующие рекомбинантные формы (CRFs) [17, 19]. Выделяют 3 группы, или линии, ВИЧ-1: M (Major), N (non-M, non-O или New) и O (Outliers). Большинство изолятов ВИЧ-1, ответственных за пандемию ВИЧ-инфекции, относятся к группе М. Вирусы группы О эндемичны и выявляются в основном в Камеруне и соседних странах Западной и Центральной Африки [13, 15]. Группа N объединяет вирусы, изолированные в Камеруне [3, 20]. Внутри группы M все вирусы филогенетически делят на субтипы. В настоящее время выделяют 9 субтипов, обозначенных латинскими буквами: A-D, F-H, J и K. Вирусы группы O не делятся на субтипы, поскольку при филогенетическом анализе не выявляется такое же разнообразие геномов ВИЧ, как в группе M. Как оказалось, все субтипы ВИЧ-1 ассоциированы с различными территориями и континентами. Субтип В типичен для Северной и Южной Америки, Западной Европы, Африки, ЮгоВосточной Азии, Австралии, Японии; A, C и D -для Африки (С описан также в Индии, Бразилии, России); E (CRF01_AE) - для Таиланда; F описан в Румынии и Бразилии; G - в Центральной Африке, на Тайване, в Заире и Элисте (Россия); H - в Центральной Африке, Заире и Восточной Европе; I - на Кипре, Ближнем Востоке; J - в Центральной Африке [6, 7, 9, 10]. При инфицировании человека несколькими субтипами ВИЧ-1 в процессе репликации в организме такого инфицированного в геноме вируса могут происходить рекомбинантные события, приводящие к появлению рекомбинантных форм вируса, имеющих мозаичную структуру генома. Такие вирусы в настоящее время выделены в отдельную группу и называются «циркулирующие рекомбинантные формы» (circulating recombinant forms - CRFs) [10]. В настоящее время описаны 14 рекомбинантных форм ВИЧ-1, которые встречаются на разных континентах и в разных странах. Например, CRF01_AE была впервые описана в Таиланде и Центральной Африке, CRF02_AG - в Африке, но встречается в Западной Европе, России, а также описана нами в Беларуси [2, 5]. CRF03_AB впервые была выявлена у инъекционных наркопотребителей в Калининграде в конце 90-х годов прошлого века, а позднее была описана в Беларуси [4, 8, 12]. В настоящей статье представлены данные по выявлению и характеристике новой рекомбинантной формы ВИЧ-1, выявленной и описанной впервые в мире. Материалы и методы Плазма крови в объеме 3-5 мл была собрана из цельной крови с ЭДТА после низкоскоростного центрифугирования при 1000 об/мин в течение 20 мин. Вирус был выделен из 500 мкл плазмы высокоскоростным центрифугированием при 23 000 g и +4°C в течение 60 мин на центрифуге Avanti J 30 I, “Beckman Coulter”, США. РНК ВИЧ-1 изолировали с использованием модуля для выделения РНК тест-системы ViroSeq “HIV-1 Genotyping System v.2.0”, Celera Diagnostics, “Abbot”, США. Полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) проводили с использованием модуля коммерческой тест-системы ViroSeq “HIV-1 Genotyping System v.2.0” Celera Diagnostics, “Abbot”, США. Фрагменты вирусной ДНК после ПЦР очищали на колонках, прилагающихся к тест-системе Viro-Seq “HIV-1 Genotyping System v.2.0” Celera Diagnostics, “Abbot”, США, и производства фирмы “Sigma”, США. Секвенирующую ПЦР проводили с использованием модуля коммерческой тест-системы ViroSeq “HIV-1 Genotyping System v.2.0” Celera Diagnostics, “Abbot”, США. Очистку фрагментов ДНК ВИЧ после секвениру-ющей ПЦР выполняли этанол-ацетатной преципитацией. Электрофорез фрагментов гена pol ВИЧ-1 размером 1800 н. о. (протеаза и 2/3 обратной транскрип-тазы) после секвенирующей ПЦР проводили на генетическом анализаторе ABI Prism 3100-Avant “Applied Biosystems”, США. Для анализа последовательностей фрагмента гена pol и определения мутаций резистентности использовали базу данных, прилагаемую к тест-системе ViroSeq “HIV-1 Genotyping System” software v.2.6, Celera Diagnostics, “Abbot”, США, а также программы “Sequencing Analysis” v.5.1.1, BioEdit, SeqScape, “HIV Drug Resistance Database” Stanford University. Синтез праймеров генов gag и env. Пары праймеров синтезировали на автоматическом синтезаторе “Expedite™ 8900 Nucleic Acid Synthesis System”, “PerSeptive Biosystems”, США. Были синтезированы 3 праймера гена gag, 4 гена env, а в качестве внутреннего контроля качества - пара праймеров у-актина. gag: A0493-1 (5'gag-1); A0492 (gag-21-Sp6); A0491 (gagAE3 T7); env: A0909-1 (3'V3Not); A0908-1 (5'V3Not); A0910 (Sp6 5'Ksi); A0911 (T75'Ksi); y-Actin: A0652 (3'HcyActin); A0651 (5'HcyActin). ОТ-ПЦР для последующего секвенирования. Обратную транскрипцию проводили в амплификаторе Gene Amp PCR System 2700 (“Applied Biosystems”) с использованием праймеров генов gag (3'A0309 - SK39), env (0909 - 3' V3 Not), а также гексамеров в объеме 20 мкл (14 мкл РНК; 8 мкл 5 х ОТ-буфера; 3,2 мкл дНТП; 3,6 мкл РНАазин; 2 мкл MuLV - RT). Реакционную смесь инкубировали при 42°С 45 мин, 95°С 5 мин и охлаждали при 4°С. Первый раунд ПЦР выполняли в конечном объеб а 61 100 24 23 98 92 L 98 r be 45 100 69 56 65 99 L 95 61 92 L 70 L 55 г AY158534 South Africa —AF067159 India C-U52953 Brazil 31 99 84 63 г 92 100 53 98 г 31 0,02 80 Г 98 65 37 |- U88823 Rwanda -H-AF190127 Belgium - J-AF082394 -CRF02 AG FN995208 Belarus -A-AF004885 Kenya -AY772535 Cameroon -G-AF084936 DRC 77l-FR686469 CRF06_cpx Belarus -FR686468 CRF06_cpx Belarus -DQ400856 CRF06_cpx Russia 801-AY535660 Estonia Consensus IDU-A I — AF413987 Ukraine > A -A-FR729474 Belarus [ FN995656 Mos. J AF414006 CRF03_AB Belarus AF193276 CRF03_AB KAL153 -D-K03454 -AY682547 Russia - DQ207943 Georgia -AY819715 Russia -DQ823364 Ukraine —AY835766 USA -B-K03455 (HXB2) -F-AF077336 _K-AJ249235 • AY500393 Russia "S 44 31 С 37 L 100 - U88823 Rwanda -C-U52953 Brazil — AF067159 India -AY158534 South Africa -H-AF190127 Belgium - J-AF082394 - AY772535 Cameroon - G-AF084936 - CRF02_AG FN995208 Belarus - A-AF004885 Kenya - DQ400856 CRF06_cpx Russia - AY535660 Estonia — AF414006 CRF03_AB Belarus AF193276 CRF03_AB KAL153 AY500393 Russia — AF413987 Ukraine - AY835766 USA -B-K03455 (HXB2) -DQ823364 Ukraine - FR775442_ Mos. - DQ207943 Georgia - AY682547 Russia — AY819715 Russia - D-K03454 - F-AF077336 - K-AJ249235 - AF484522 Uganda 100 Г 71 0,01 - AY772535 -G-AF084936 33 г - DQ400856 CRF06_cpx Russia 38 - AY535660 Estonia -J-AF082394 28 83 L 62r 661 L 44 26 - F-AF077336 - C-U52953 Brazil -AF067159 India - AY158534 South Africa -H-AF190127 Belgium -U88823 Rwanda - A-AF004885 Kenya -CRF-02_AG FN995208 BelarusV -FR775443 Mos. 86 - AY500393 03 Russia 99 100 - K-AJ249235 -AY819715 Russia -AY682547 Russia -DQ823364 Ukraine AF413987 Ukraine -AY835766 USA -B-K03455 (HXB2) AF414006 CRF03_AB Belarus AF193276 CRF03_AB KAL153 DQ207943 -D-K03454 61 96 65 E si- 99 66 0,05 ме 50 мкл по следующей прописи: 4 мкл 10х ПЦР-буфера; 0,5 мкл MgCl2, 0,4 мкл Taq-полимеразы; 0,5 мкл 5' праймера (для гена gag - A0493 (5' gag-1); для env-гена - A0908-1 (5'V3 Not)); к реакционной смеси добавляли 10 мкл кДНК. Реакцию проводили по сле- Рис. 1. Филогенетический анализ последовательностей ДНК изолята Mos по гену pol (а); филогенетический анализ последовательностей ДНК изолята Mos по участку p17/p24 гена gag (б); филогенетический анализ последовательностей ДНК изолята Mos по V3 петле gp120 ВИЧ-1 (в). Референс-последовательности ВИЧ-1 и вирусы, специфичные для эпидемии ВИЧ/СПИДа на территории Беларуси, были взяты из международной базы данных GenBank со своими номерами. Древа были построены по методу Neighbor-Joining и двум параметровым дистанциям по методу Kimura. дующей прописи: 95°С - 5 мин; (95°С - 1 мин, 55°С - 1 мин, 72°С - 2 мин) - 40 циклов; 72°С - 10 мин и хранили при 4°С. Второй раунд - гнездовую ПЦР выполняли в конечном объеме 50 мкл по следующей прописи: 5 мкл 10х ПЦР-буфера; 1,2 мкл MgCl2 (100 мМ); 0,4 мкл дНТП; 0,2 мкл Taq-полимеразы; по 0,5 мкл 5' праймеров (100 нг/мкл) - gag A0328 - gag21-Sp6, env A0627 - (5'Ksi) и 3' праймеров (100 нг/мкл) - A0373 (gagAE3), A0624 (3'Ksi). Продукт первой ПЦР добавляли к реакционной смеси в количестве 5 мкл. Реакцию проводили в следующем режиме: 95°С - 5 мин; (95°С - 1 мин, 55°С - 1 мин, 72°С - 2 мин) - 25 циклов; 72°С - 10 мин; хранение при 4°С. Электрофорез в агарозном геле. Анализ продуктов амплификации проводили в 1% агарозном геле на трис-боратном буфере, содержащем бромид этидия 1,5 мкл (10 мг/мл) на 150 мл буфера. Секвенирование. Секвенирование ВИЧ по генам gag (850 п. н.) и env (380 п. н.) проводили на генетическом анализаторе модели ABI Prism 3100-Avant, “Applied Biosystems”. Анализ результатов секвенирования выполняли с помощью программ ClustalX (1.8) и BioEdit. Нуклеотидные последовательности амплифицированных фрагментов были выровнены, в них были найдены рамки считывания и получены соответствующие аминокислотные последовательности. Для филогенетического анализа полученные нуклеотидные последовательности были выровнены с нуклеотидными последовательностями референсных изоля-тов ВИЧ-1 из базы данных полных нуклеотидных последовательностей геномов различных штаммов ВИЧ-1 с помощью программы Clustal W. Для филогенетического анализа полученных результатов использовали программу MEGA 4.1 по методу Neighbour-Joining и Kimura 2-параметру. Рекомбинантную природу вируса оценивали с использованием программ Comet HIV-1 и SimPlot (Similarity Plotting). Последовательности нового варианта ВИЧ-1/Mos по генам gag, pol и env были зарегистрированы в Международной базе данных EMBL/Genbank/DDBJ под номерами FR775442.1; FN995656.1, FR775443.1. Результаты и обсуждение Эпидемия ВИЧ/СПИДа в бывшем СССР началась со вспышек в Одесской (субтип А) и Николаевской (субтип В) областях Украины. В обоих случаях вспышки были связаны с заражением через инфицированный наркотик инъекционных наркопотребителей [8]. Рекомбинация ВИЧ-1 субтипов А и В привела к образованию новой рекомбинантной формы вируса CRF03_AB (gagA/envB), которая вызывала вспышку ВИЧ-инфекции среди инъекционных наркоманов в Калининграде, а позднее была выявлена в других регионах Российской Федерации и Беларуси [5-7, 9]. BootScan-Query: Mos-gag BootScan-Query: Mos-pol А В Position Position A1 — В — Con-A1 -A1 ....... B-Georgia -B-Belarus Window: 200 bp, Step: 20 bp, GapStrip: On, Reps: 100, Kimura (2-parameter), T/t: 2,0, Neighbor-Joining Рис. 2. BootScan-анализ последовательностей генов pol (а) и gag (б) изолята Mos. В апреле 2010 г. для исследования на резистентность в нашу лабораторию поступил образец плазмы крови от ВИЧ-инфицированного ребенка Mos, 6 лет, рожденного ВИЧ-инфицированной матерью. У больной не были выявлены резистентные штаммы ВИЧ-1. При проведении филогенетического анализа фрагмента ДНК по гену pol ВИЧ-1, изолированного от пациентки Mos, нами было обнаружено, что вирус относился к субтипу А ВИЧ-1, но кластрировался отдельно от других образцов субтипа А и референс-последовательностей субтипа A (AF004885) (рис. 1, а). Исследования последовательностей гена pol изолята Mos с использованием программы Comet HIV-1 показали, что вирус относится к рекомбинантной форме ВИЧ-1 А1В. Средние р-дистанции между последовательностями ВИЧ-1 субтипа А из Украины, России, консенсусной последовательностью IDU-A и последовательностями ДНК пациентки составили 0,068, а с референс-последовательностями субтипа В - 0,094. Последовательности ДНК изолята Mos были более близки к референс-последовательностям ВИЧ-1 AF413987.1 из Украины (субтип А), р-дистанции составили 0,066. Эти данные подтвердили, что изо-лят Mos по гену pol относится к субтипу А ВИЧ-1. Сравнительный анализ последовательностей изоля-та Mos с референс-последовательностями рекомбинантной формы CRF03_AB (AF414006.1 Belarus и AF193276.1 CRF03_AB KAL153) показал, что средние р-дистанции между вирусами составили 0,090. В то же время р-дистанции между референс-после-довательностями рекомбинантной формы CRF03_AB, описанными в Калининградской области и Беларуси AF193276.1 и AF414006.1, соответственно составили всего 0,009. Таким образом, по гену pol новый изолят был отнесен к субтипу А ВИЧ-1.