Screening of antiviral activity of samples from chaga  Inonotus obliquus  and humic acid from brown coal on  Vero  cell culture against ectromelia virus (Poxviridae:  Orthopoxvirus ; ECTV)

Tamara V. Teplyakova; Теплякова Тамара Владимировна; Alexey S. Kabanov; Кабанов Алексей Сергеевич; Alena S. Ovchinnikova; Овчинникова Алена Сергеевна; Dmitry A. Odnoshevskyh; Одношевский Дмитрий Александрович; Irina F. Petrovskaya; Петровская Ирина Федоровна; Tatiana S. Nepomnyashchikh; Непомнящих Татьяна Сергеевна; Oleg V. Pyankov; Пьянков Олег Викторович

doi:10.36233/0507-4088-174

Screening of antiviral activity of samples from chaga Inonotus obliquus and humic acid from brown coal on Vero cell culture against ectromelia virus (Poxviridae: Orthopoxvirus; ECTV)

Authors: Teplyakova T.V.¹, Kabanov A.S.¹, Ovchinnikova A.S.¹, Odnoshevskyh D.A.¹, Petrovskaya I.F.¹, Nepomnyashchikh T.S.¹, Pyankov O.V.¹
Affiliations:
1. State Research Center of Virology and Biotechnology “Vector” of Rospotrebnadzor
Issue: Vol 68, No 4 (2023)
Pages: 277-282
Section: ORIGINAL RESEARCH
Submitted: 26.05.2023
Published: 21.09.2023
URL: https://virusjour.crie.ru/jour/article/view/10570
DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-174
EDN: https://elibrary.ru/scsivx
ID: 10570

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Introduction. The mouse-specific orthopoxvirus, ectromelia virus, is one of the best models that can be used to study key issues of pathogenesis, prevention, and treatment of smallpox, and to develop measures to increase virulence, transmissibility, or the ability to overcome vaccine immunity.

The aim of the work is to screen the antiviral activity of samples from Inonotus obliquus chaga and humic acid from brown coal in vitro against ectromelia virus.

Materials and methods. We used ectromelia virus, strain K-1 (reg. No V-142), obtained from the State Collection of Pathogens of Viral Infections and Rickettsioses of the State Scientific Center of Virology and Biotechnology “Vector”; Vero Е6 cell culture (No 70) from the Collection of cell cultures of the State Scientific Center of Virology and Biotechnology “Vector”. Nine samples from chaga I. obliquus and humic acid from brown coal were used to evaluate the changes in the infectivity of the ectromelia virus on cell culture using 2 schemes of application of drugs and virus (preventive and therapeutic schemes), and to assess their cytotoxicity and antiviral activity.

Results. 50% cytotoxic concentration, 50% virus-inhibiting concentrations and selectivity index were determined for all samples. The studied samples were shown to be non-toxic to the monolayer of Vero cell culture in a dilution of 300 and more micrograms/ml, while demonstrated high antiviral activity against strain K-1 of ectromelia virus in two application schemes – preventive and curative.

Conclusion. All samples tested for ectromelia virus in vitro can be considered promising for further development of drugs against diseases caused by orthopoxviruses.

Keywords

chaga, Inonotus obliquus, melanin, humic acid, ectromelia virus, in vitro, antiviral activity

Full Text

Введение

Натуральная оспа – высококонтагиозная вирусная инфекция, характеризующая тяжёлым течением, лихорадкой, сыпью на коже и слизистых оболочках, нередко оставляющая после себя рубцы. Вирус, вызывающий заболевание, относится к семейству Poxviridae подсемейства Chordopoxvirinae рода Orthopoxvirus. Семейство Poxviridae включает в себя большое количество вирусов, в том числе патогенных для человека: вирус натуральной оспы, вирус оспы обезьян, вирус оспы коров, вирус эктромелии (ВЭ) и др. После завершения беспрецедентной международной программы глобальной ликвидации оспы, проходившей под эгидой Всемирной организации здравоохранения, прошло более 40 лет. За это время по всему миру резко возросло количество людей, утративших специфический иммунитет против данного заболевания. Несмотря на искоренение оспы, угроза её возникновения существует и сегодня, поскольку невозможно исключить наличие нелегального хранения вируса натуральной оспы и преднамеренного использования данного патогена в целях биотерроризма. Не следует также забывать, что существует множество мест погребения умерших от неё людей, часть из которых находятся на территории вечной мерзлоты, что не исключает возможности оттаивания данных регионов в условиях резко меняющегося климата и дальнейшего распространения вируса. При этом близкие по структуре к вирусу натуральной оспы зоонозные ортопоксвирусы также представляют опасность для человека.

ВЭ – это специфичный для мыши ортопоксвирус, который вызывает летальную инфекцию у некоторых линий мышей. ВЭ – возбудитель мышиной оспы – впервые был описан в Англии в 1930 г. и вызвал смертельную болезнь у лабораторных мышей. Восприимчивость к ВЭ зависит от факторов хозяина, таких как линия мыши, возраст, пол и иммунный статус, а также от вирусных факторов [1].

Инфекция ВЭ у мышей была тщательно изучена, её патогенез с локализованной репликацией и системным распространением аналогичен патогенезу вируса натуральной оспы у людей [2]. ВЭ, возможно, является лучшей моделью для изучения оспы на мелких лабораторных животных. Эта модель может использоваться для изучения основных вопросов патогенеза, оценки профилактических и терапевтических методов лечения оспы, а также разработки контрмер против ортопоксвирусов, созданных с помощью биоинженерии, для повышения вирулентности, трансмиссивности или способности преодолевать вакцинный иммунитет [3].

Цель работы – скрининг противовирусной активности образцов из чаги Inonotus obliquus и гуминовой кислоты из бурого угля на культуре клеток Vero в отношении ВЭ с определением противовирусной эффективности препаратов при использовании двух схем внесения препаратов и ВЭ – профилактической и лечебной. Образцы, проверенные в отношении ВЭ in vitro, будут рассматриваться как перспективные для разработки препаратов от ортопоксвирусов и в дальнейшем исследованы в отношении ВЭ in vivo.

Материалы и методы

Вирусы

В работе использовали ВЭ, штамм К-1 (рег. номер V-142), полученный из Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии (ГНЦ ВБ) «Вектор» Роспотребнадзора. Вирус нарабатывали в культуре клеток Vero, его концентрацию в культуральной жидкости определяли путём титрования методом бляшек на культуре клеток Vero (шифр коллекционный 70), рассчитывали и выражали в десятичных логарифмах бляшкообразующих единиц в миллитрах (lg БОЕ/мл). Концентрация вируса, использованного в работе, составляла 6,4 lg БОЕ/мл. В предварительных экспериментах на культуре клеток Vero была подобрана минимальная доза ВЭ, вызывающая 100% цитопатическое действие в лунке. Такая доза составила 1000 БОЕ/лунка. Наработанный и использованный в исследовании вирус с указанным титром хранили при –70 °С.

Клеточные культуры

В работе использовали клетки почки взрослой африканской зелёной мартышки (Vero Е6), полученные из Коллекции культур клеток ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. Монослой клеток Vero выращивали в среде Игла (ООО «БиолоТ», Россия) в присутствии 5% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (HyClone, США) с добавлением пенициллина (100 МЕ/мл) и стрептомицина (100 мкг/мл). В качестве поддерживающей при культивировании клеток с вирусом использовали ту же среду, но с добавлением 2% сыворотки [4].

Исследуемые образцы

Для исследования были использованы водные экстракты природной чаги, меланин из чаги, а также гуминовая кислота из бурого угля. Масса сухого вещества каждого из экстрактов составляла 2 мг/мл. В целом было исследовано 3 водных экстракта чаги, 3 образца меланина и 3 образца гуминовой кислоты. Подробное описание образцов, приведенных в таблице, представлено в патентах [5–7].

Таблица. Противовирусная активность образцов из чаги и гуминовой кислоты из бурого угля в отношении вируса эктромелии штамма К-1 в двух схемах применения

Table. The antiviral activity of samples from chaga and humic acid from brown coal against strain K-1 of ectromelia virus in 2 application schemes

Код образца Sample code	Масса сухого вещества, мг/мл Dry matter weight, mg/mL	Вещество Substance	Схема применения, культура клеток Application scheme, Cell culture	ЦТД₅₀, мкг/мл CC₅₀, µg/mL	ЭД₅₀, мкг/мл IC₅₀, µg/mL	ХТИ SI
20-13	2,0	Экстракт чаги Chaga extract	Профилактическая, Vero E6, 6 сут. Preventive, Vero E6, 6 days	>300	2,84	105,6
20-13	2,0	Экстракт чаги Chaga extract	Лечебная, Vero E6, 6 сут. Therapeutic,Vero E6, 6 days	300	2,25	133,3
20-15	2,0	Экстракт чаги Chaga extract	Профилактическая, Vero E6, 6 сут. Preventive, Vero E6, 6 days	>300	2,08	144,2
20-15	2,0	Экстракт чаги Chaga extract	Лечебная, Vero E6, 6 сут. Therapeutic,Vero E6, 6 days	300	1,97	152,3
20-17	2,0	Экстракт чаги Chaga extract	Профилактическая, Vero E6, 6 сут. Preventive, Vero E6, 6 days	>300	2,91	103
20-17	2,0	Экстракт чаги Chaga extract	Лечебная, Vero E6, 6 сут. Therapeutic,Vero E6, 6 days	>300	2,89	103,8
20-24	2,0	Меланин Мelanin	Профилактическая, Vero E6, 6 сут. Preventive, Vero E6, 6 days	>300	2,33	128,7
20-24	2,0	Меланин Мelanin	Лечебная, Vero E6, 6 сут. Therapeutic,Vero E6, 6 days	>300	3,38	88,7
20-29	2,0	Меланин Мelanin	Профилактическая, Vero E6, 6 сут. Preventive, Vero E6, 6 days	>300	3,41	88
20-29	2,0	Меланин Мelanin	Лечебная, Vero E6, 6 сут. Therapeutic,Vero E6, 6 days	>300	3,58	83,8
20-30	2,0	Меланин Мelanin	Профилактическая, Vero E6, 6 сут. Preventive, Vero E6, 6 days	>300	3,17	94,6
20-30	2,0	Меланин Мelanin	Лечебная, Vero E6, 6 сут. Therapeutic,Vero E6, 6 days	>300	3,02	99,3
20-50	2,0	Гуминовая кислота Нumic acid	Профилактическая, Vero E6, 6 сут. Preventive, Vero E6, 6 days	300	2,24	134
20-50	2,0	Гуминовая кислота Нumic acid	Лечебная, Vero E6, 6 сут. Therapeutic,Vero E6, 6 days	>300	2,29	131
20-51	2,0	Гуминовая кислота Нumic acid	Профилактическая, Vero E6, 6 сут. Preventive, Vero E6, 6 days	>300	2,88	104
20-51	2,0	Гуминовая кислота Нumic acid	Лечебная, Vero E6, 6 сут. Therapeutic,Vero E6, 6 days	>300	3,14	95,5
20-55	2,0	Гуминовая кислота Нumic acid	Профилактическая, Vero E6, 6 сут. Preventive, Vero E6, 6 days	>300	3,05	98,4
20-55	2,0	Гуминовая кислота Нumic acid	Лечебная, Vero E6, 6 сут. Therapeutic,Vero E6, 6 days	>300	3,51	85,5

Примечание. ЦТД₅₀ – 50% цитотоксическая концентрация; ЭД₅₀ – 50% эффективные дозы; ХТИ – химиотерапевтический индекс.

Note. CC₅₀ – 50% cytotoxic concentration; IC₅₀ – 50% inhibitory (effective) concentration; SI –selectivity index.

Определение 50% цитотоксических и 50% ингибирующих вирус эктромелии концентраций образцов in vitro

Противовирусная эффективность исследуемых препаратов оценивалась по изменению инфекционности ВЭ (титра) в монослое клеток Vero Е6 при использовании двух схем внесения препаратов и ВЭ – профилактической и лечебной [4].

Профилактическая схема. На монослой культуры клеток вносили по 0,1 мл соединений и помещали в термостат на 2 ч при температуре 37 °С. После двухчасовой обработки монослоя препаратами вносили по 0,1 мл вируса в дозе 1000 БОЕ/лунка. При профилактической схеме конечная концентрация препаратов в лунке была 300; 100; 33,33; 11,11 и 3,70 мкг/мл.

Лечебная схема. Заражение клеточного монослоя осуществляли тройным разведением ВЭ (1000 БОЕ/лунка) в объёме 0,1 мл. Планшет с внесённым вируссодержащим материалом помещали в термостат на 1 ч при 37 °С для адсорбции вируса на культуру клеток. После адсорбции в лунки вносили разведения препарата в объеме 0,1 мл. При лечебной схеме конечная концентрация препаратов в лунке была 300; 100; 33,33; 11,11 и 3,70 мкг/мл. Каждая схема применения препаратов in vitro была воспроизведена в 4 повторах.

Метод определения 50% цитотоксических и 50% ингибирующих вирус эктромелии концентраций образцов

Оценку противовирусной эффективности препаратов проводили по адаптированной и модифицированной нами методике [8]. В лунки 96-луночных планшетов, содержащих монослой клеток Vero, сначала вносили по 100 мкл серийных разведений исследуемых соединений и по 100 мкл разведения штамма ВЭ в дозе 1000 БОЕ/лунка в соответствии со схемой внесения. Токсическая активность соединений определялась по гибели клеток под воздействием препарата в лунках планшета, в которые вирус не вносили. В качестве контроля использовали монослой клеток в лунках планшета, в которые вносили вирус без соединений (контроль вируса) и монослой клеток в лунках, в которые не вносили ни вирус, ни соединения (контроль культуры клеток). После инкубирования в течение 6 суток монослой клеток прокрашивали витальным красителем (нейтральным красным) в течение 2 ч. После удаления красителя и отмывки лунок от его несвязавшейся фракции добавляли лизирующий буфер. Количество красителя, адсорбированное живыми клетками монослоя, оценивали по оптической плотности, которая является показателем количества неразрушенных под влиянием вируса клеток в монослое. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре Emax (Molecular Devices, США) при длине волны 490 нм. Учёт результатов проводили с использованием планшетного спектрофотометра Emax и компьютерной программы SoftMaxPro 4.0, результаты оптической плотности представляли в полулогарифмической системе координат. На основании полученных данных рассчитывали 50% цитотоксическую концентрацию (ЦТД₅₀) и 50% эффективные дозы (ЭД₅₀) для исследуемых препаратов, где ЦТД₅₀ – величина концентрации определённого образца препарата в лунке планшета, под воздействием которого разрушается 50% клеточного монослоя; ЭД₅₀ – величина концентрации определённого образца препарата в лунке планшета, под воздействием которого сохраняется 50% жизнеспособного клеточного монослоя. Полученные данные дают возможность рассчитать химиотерапевтический индекс препарата (ХТИ) по формуле: ХТИ = ЦТД₅₀/ЭД₅₀. Активными считаются соединения с ХТИ ≥ 8 [9].

Статистическая обработка результатов

Статистическую обработку и сравнение результатов осуществляли стандартными методами [10]. В случаях, когда при титровании на монослое клеток ВЭ не выявлялся из-за существующего порога чувствительности метода, использовали значение минимального титра ВЭ, выявляемого при данном методе титрования (10 БОЕ/мл, т.е. 1 lg БОЕ/мл). Сравнение показателей средних титров ВЭ в монослое клеток Vero проводили с применением непараметрического U-критерия Манна–Уитни [10]. Различия считали достоверным при 95% уровне надежности (p ≤ 0,05). Результаты представлены в таблице.

Результаты и обсуждение

Как видно из таблицы, исследуемые образцы не являются токсичными для монослоя культуры клеток Vero Е6 в разведении 300 мкг/мл и более. Все образцы показали высокую противовирусную активность в отношении ВЭ штамма К-1 в двух схемах применения – профилактической и лечебной.

В 4 из 9 исследованных экстрактов ХТИ в двух схемах применения был выше 100, это образцы 20-13, 20-15, 20-17 и 20-50. Водный экстракт чаги под номером 20-15 проявил выраженное противовирусное действие. В лечебной схеме применения при концентрации соединения всего 1,97 мкг/мл он вызывал 50% ингибирующее действие. Следует отметить, что ХТИ у этого соединения был самым высоким и составил в профилактической схеме применения 144,2, а в лечебной – 152,3. Образец меланина из чаги 20-24 и образец гуминовой кислоты из бурого угля 20-51 также показали противовирусное действие с высоким ХТИ при профилактической схеме применения. Остальные три соединения под номерами 20-29, 20-30 и 20-55 показали сравнительно высокую противовирусную активность в двух схемах применения. Данные эксперименты проводились в четырёх повторениях с интервалом в 1 неделю. Все результаты были сопоставимы.

Заключение

Все образцы, проверенные в отношении ВЭ in vitro, могут рассматриваться как перспективные для разработки препаратов от ортопоксвирусов. Ранее мы имели возможность провести исследования по оценке водных экстрактов грибов и некоторых гуминовых соединений на вирус натуральной оспы и осповакцины [11]. Нами было отмечено, что чага содержит широкий спектр различных биологически активных веществ. Основным компонентом является хромоген-полифенолоксикарбоновый комплекс, близкий по физико-химическим характеристикам к гуминовой кислоте. Водные экстракты чаги и меланин проявляли противовирусный эффект ко всем исследуемым нами вирусам, в том числе ко многим штаммам вируса гриппа и коронавирусу SARS-CоV-2, вызвавшему эпидемию COVID-19 [12].

Безусловно, необходимо дальнейшее изучение гриба чаги и некоторых его компонентов с целью разработки на их основе лекарственных и профилактических препаратов против заболеваний, вызываемых ортопоксвирусами.