Intranasal vaccine against COVID-19 based on a recombinant variant of the Sendai virus (Paramyxoviridae: Respirovirus) strain Moscow

Full Text

Введение

Пандемия COVID-19, вызванная вирусом SARS-CoV-2, сделала разработку вакцин главным биомедицинским приоритетом современного здравоохранения. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), на конец 2022 г. 199 вакцинных препаратов находились на стадии доклинических испытаний и 175 вакцин – на стадии клинических испытаний [1]. Различные платформы использовались для создания вакцин на основе шиповидного S-белка SARS-CoV-2 и его рецептор-связывающего домена (RBD), включая ДНК и РНК, векторные и белковые субъединичные вакцины [2]. Векторные вакцины на основе непатогенных или слабопатогенных для человека респираторных вирусов обладают рядом преимуществ и могут имитировать природную инфекцию соответствующего патогена.

Поскольку входными воротами для SARS-CoV-2 являются слизистые оболочки, для остановки этой инфекции огромное значение приобретает именно мукозальная иммунизация. По сравнению с инъекционными вакцинами, на производстве которых сосредоточены огромные усилия фармацевтических компаний, интраназальные вакцины обеспечивают дополнительные уровни защиты, такие как секреторные димерные IgA (sIgA) и резидентные В- и Т-клетки памяти в слизистой оболочке дыхательных путей [3].

При создании мукозальных вакцин принципиальным является наличие в них живых вирусов, которые способны преодолевать многочисленные барьеры слизистой оболочки и достигать лимфатических фолликулов, где происходит формирование полноценного иммунного ответа [4]. Живые вирусные частицы плотно упакованы и содержат на своей поверхности гликопротеины, полисахаридные цепочки которых защищают белки от ферментативной деградации. Вирус Сендай (парагрипп мышей I типа, род Respirovirus, семейство Paramyxoviridae) как нельзя лучше подходит для этих целей, поскольку является респираторным вирусом и способен, не вызывая заболевания, ограниченно реплицироваться в клетках бронхиального эпителия человека, а также в некоторых категориях дендритных клеток. В процессе ограниченной репликации рекомбинантные варианты вируса Сендай способны индуцировать в организме человека специфический иммунный ответ на экспрессируемые ими протективно значимые чужеродные вирусные антигены [5]. Использование вируса Сендай в качестве вакцинного вектора также обеспечивает неспецифическую противовирусную защиту организма, поскольку он является одним из лучших природных индукторов интерферонов и применялся для производства человеческого лейкоцитарного интерферона до начала эпохи рекомбинантных белков [6, 7].

Важным преимуществом вируса Сендай как вакцинного вектора является высокая стабильность его генома. Стабильность связана с необычным свойством генома вируса Сендай, так же как и других парамиксовирусов, которое называется правилом шести и обозначает строгую полигексамерность длины генома (6n + 0, где n – один нуклеотид). Это свойство способствует особенно низкой частоте гомологичной рекомбинации геномных РНК парамиксовирусов [8]. Кроме того, репликация вируса Сендай происходит исключительно в цитоплазме, а не в ядре клетки, и риск генетической интеграции вирусного генома в геном хозяина минимален [9].

Вакцинные свойства вируса Сендай активно исследуются в мировой практике. Так, интраназальные вакцины на его основе успешно прошли клинические испытания против парагриппа человека I типа и респираторно-синцитиального вируса [10]. Целый ряд рекомбинантных вирусов Сендай проходят доклинические исследования в качестве вакцин против респираторных инфекций человека [11], включая COVID-19 [9].

Ранее нами была разработана векторная система для получения рекомбинантных вариантов вируса Сендай российского штамма Москва [12]. Векторная система включает четыре плазмидные конструкции, содержащие:

1) полноразмерную ДНК-копию генома вируса с сайтом для встройки трансгенов между генами P и M;

2) ген N;

3) ген Р;

4) ген L [13].

Экспрессия генов N, P и L является необходимым элементом оживления рекомбинантных вариантов вируса, они кодируют белки репликативного комплекса, который синтезирует геномную РНК.

Целью настоящей работы являлось конструирование и изучение вакцинных свойств рекомбинантного варианта вируса Сендай штамма Москва, экспрессирующего секретируемый рецептор-связывающий домен S-белка SARS-CoV-2 штамма дельта, при однократной интраназальной иммунизации.

Материалы и методы

Культуры клеток

В работе использовали 293-Т7 – дериват культуры клеток почки эмбриона человека 293, конститутивно продуцирующий полимеразу фага Т7; LLC-MK₂ – культуру клеток почки макаки-резуса; Vero E6 – клетки почки африканской зелёной мартышки. Культуры клеток 293, LLC-MK₂ и Vero E6 получены из ATCC (American Type Culture Collection). Культура клеток 293-T7 получена нами ранее путём встройки в хромосомную ДНК клеток 293 оптимизированного трансгена полимеразы Т7 (Т7opt). Кратко: последовательность гена T7opt была выделена с использованием рестриктаз EcoRI – BglII из коммерческой плазмиды pCAGGS [14] и клонирована по сайтам EcoRI – BglII/BamHI в плазмиду pCDH-EF1a-MCS-IRES-zeo [15]. Получившаяся плазмида pCDH-T7opt была использована для трансформации клеток 293, в результате чего получен клон клеток 293-Т7 со встроенным в хромосомную ДНК трансгеном T7opt.

Плазмиды

Плазмиду pVL3-RBDdelta получали на основе плазмиды pVEAL2-RBD, кодирующей рецептор-связывающий домен (RBD) (308V–541F) S-белка SARS-CoV-2 варианта Wuhan [16]. Для этого в нуклеотидную последовательность, кодирующую RBD, вводили мутации, приводящие к аминокислотным заменам T479K и L452R. Мутацию T479K вводили по методу перекрывающейся полимеразной цепной реакции (ПЦР). На матрице pVEAL2-RBD с использованием пар праймеров T479K_F – IRES-RBD-R и URBD-F – T479K-R (таблица) получали фрагменты RBD, отжигали и затем проводили ПЦР с фланкирующими праймерами URBD-F и IRES-RBD-R и последующий гидролиз фрагмента рестриктазами Bsp13I и AspA2I. Для введения мутации L452R проводили ПЦР на матрице pVEAL2-RBD с использованием пары праймеров URBD-F – L452R-R (таблица) и последующий гидролиз рестриктазами AsuNHI и Bsp13I. Вектор pVL3 гидролизовали AsuNHI и AspA2I и встраивали одновременно обе вставки, содержащие соответствующие мутации.

 

Таблица. Последовательности нуклеотидов, использованные в работе

Table. Oligonucleotide sequences used in the study

Название Name	Последовательность 3’–5’ Sequence 3’–5’	Сайты рестриктаз Restriction sites
T479K-F	atcaggccggcagcaAGccttgtaac	–
IRES-RBD-R	ggttgtggccatattatcatcgtg	AspA2I
URBD-F	ctatagggagacccaagctgg	AsuNHI
T479K_R	gttacaaggCTtgctgccggcctgat	–
L452R-R	tggacttccggaacagccggtacCggtaattgtagttg	Bsp13I
Delta-F	cggaattcgtacgccaccatgtttgtttttcttgttttattgccacta	BsiWI
Delta-R	tttatgcatgcgcgctatgtgtaatgtaatttgactcctttgagc	BssHII

 

Вирусы

Рекомбинантные варианты вируса Сендай получали на основе штамма Москва [12] с использованием набора плазмидных конструкций, описанных в [13]. Рекомбинантный вирус Сендай Sen2-EGFP(М), несущий встройку зелёного флуоресцентного белка перед геном М, получен ранее [13]. Рекомбинантные вирусы нарабатывали в аллантоисной жидкости 11-дневных куриных эмбрионов в течение 72 ч при 37 °С. Позитивные в реакции гемагглютинации с эритроцитами петуха пробы объединяли, осветляли центрифугированием при 1150 × g 10 мин и однократно замораживали при –40 °С. После разморозки пробирки с аллантоисной жидкостью центрифугировали при 12 000 × g 30 мин при 6 °С (осветление). Вирус из надосадочной жидкости концентрировали центрифугированием при 100 000 × g 45 мин при 6 °С. Полученный осадок суспендировали в фосфатно-солевом буфере (1/10 от исходного объёма) с добавлением MgCl₂ до конечной концентрации 1 мМ. Полученную суспензию обрабатывали ультразвуком при частоте колебаний наконечника 22 кГц, амплитуде 14–16 мкм и мощности 300 Вт. Обработку ультразвуком проводили 3 раза по 1 мин с охлаждением после каждой обработки в течение 30 сек во льду. Препарат расфасовывали и хранили при –40 °С.

Титрование вируса Сендай проводили методом бляшек на культуре клеток LLC-MK₂ с использованием для визуализации вируса эритроцитов морской свинки, как описано в [17]. Титр вируса выражали в количестве бляшкообразующих единиц (БОЕ) на 1 мл суспензии. Титр очищенного концентрированного препарата вируса Сендай обычно составляет 1,0–1,5 × 10⁹ БОЕ/мл.

Для оценки иммуногенности и протективности вакцины использовали дельта- и гамма-штаммы SARS-CoV-2: hCoV-19/Russia/MOS-2406/2021 (Delta VOC) и hCoV-19/Russia/SA-17620-080521/2021 (Gamma VOC).

Куриные эмбрионы и эритроциты животных

Куриные эмбрионы 11-дневного возраста получали в ЗАО «Птицефабрика Ново-Барышевская» (с. Барышево, Новосибирская обл., Россия).

Кровь петуха и морской свинки была получена из вивария ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Роспотребнадзор) (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»). Промывание эритроцитов и подготовку рабочей 0,1–1% суспензии осуществляли 0,9% раствором хлорида натрия (физиологический раствор).

Работа с лабораторными животными

Все работы с животными проводили в помещениях виварного блока лаборатории биологической защиты 2-го (BSL-2) и 3-го уровня (BSL-3). В работе использовали 16 сирийских хомяков Mesocricetus auratus (самки, возраст 6 недель, масса 80–110 г) и 26 мышей линии BALB/c Mus musculus strain BALB/c (самки, возраст 8 недель, масса 18–22 г), свободных от посторонней микрофлоры, которые были получены из питомника лабораторных животных ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Животных содержали на стандартном рационе питания и свободном доступе к воде. Манипуляции с животными, включая иммунизацию, отбор смывов и крови, осуществляли после премедикации раствором золетила (Valdepharm, Франция). Иммунизацию проводили интраназально, объём каждого инокулята составлял 100 мкл для хомяков (по 50 мкл в каждую ноздрю) и 10 мкл для мышей. Контрольным группам вводили аналогичное количество фосфатно-солевого буфера, на котором проводили разведение вируса. Забор крови у животных осуществляли через 28 дней после вакцинации для выявления общих и вируснейтрализующих антител к SARS-CoV-2.

Определение общих антител класса IgG к коронавирусу проводили с использованием тест-системы «Вектор ИФА SARS-CoV-2-ΑΤ» («Вектор-Бест», Россия). Для детекции IgG использовали пероксидазный конъюгат Goat Anti-Mouse IgG (Biomedicals, США). Нейтрализующую активность сывороток крови определяли на культуре клеток Vero E6 против вируса hCoV-19/Russia/MOS-2406/2021 (Delta VOC), как описано в [16].

На 30-й день после однократной иммунизации проводили интраназальную инокуляцию опытных и контрольных групп вирусом SARS-CoV-2 в дозе 50 ИД₅₀ на одно животное в соответствии с ранее полученными данными о восприимчивости сирийских хомяков [18] и мышей BALB/c [19]. Контроль клинического состояния после заражения проводили ежедневно, у всех животных фиксировали массу и брали смывы из носовой полости. Животных выводили из эксперимента по достижении максимума вирусной нагрузки в тканях лёгких: на 6-е сутки после заражения хомяков и на 5-е сутки – мышей, извлекали лёгкие и ткани носовой полости, готовили 10% гомогенаты. Фрагменты лёгких фиксировали в формалиново-фосфатном буфере для микроскопического исследования. Репликацию вируса SARS-CoV-2 в смывах из носовой полости и гомогенатах тканей оценивали методом ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР-РВ) с использованием набора реагентов «Вектор-ПЦРрв-nCoV-RG» (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», Россия). Амплификацию проводили на приборе Rotor-Gene 6000 (BioRad, США) с детекцией количества ПЦР-продукта по каналу FAM. Вирусная нагрузка была определена в миллилитре (копий/мл) для смывов и в миллиграмме (копий/мг) для тканей органов по значениям порога цикла (ct). В качестве стандарта использованы серийные разведения стандартизированного положительного контроля, поставляемого с набором реагентов для ПЦР.

Авторы подтверждают соблюдение институциональных, национальных и международных стандартов по использованию лабораторных животных в соответствии с Consensus Author Guidelines for Animal Use (IAVES, July 23, 2010). Протокол исследования одобрен биоэтической комиссией организации (протокол № 3 от 28.12.2022).

Микроскопические исследования

Для светооптического исследования фиксированные в 4% растворе параформальдегида на растворе Хенкса фрагменты лёгких хомяков обезвоживали стандартным методом в серии растворов этанола нарастающей концентрации, изопропаноле и ксилоле с использованием гистологического автомата Sakura Tissue-Tek II (Sakura, Япония) и заключали в среду для заливки «Гистомикс» («БиоВитрум», Россия), формируя блоки. Из блоков готовили срезы толщиной 3–4 мкм на микротоме Leica RM 2255 (Leica, Германия), которые монтировали на обезжиренные предметные стекла и высушивали на воздухе. Для окраски срезы депарафинировали в ксилоле и проводили по растворам этилового спирта нисходящей концентрации, промывали в дистиллированной воде. Окраска гематоксилином и эозином: срезы окрашивали гематоксилином Эрлиха в течение 30 сек, промывали в проточной воде, затем окрашивали эозином (1%) в течение 2 мин.

Статистическая обработка данных

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы Statistica 13.0. Достоверность различий между группами оценивали при помощи непараметрических методов сравнения. Для двух групп использован U-критерий Манна–Уитни, при большем количестве – тест множественного сравнения Данна. Различия считались значимыми при двустороннем p < 0,05.

Результаты

Рекомбинантный вариант Sen-RBDdelta(M) вируса Сендай штамма Москва

Создание рекомбинантного варианта Sen-RBDdelta(M) вируса Сендай штамма Москва осуществляли с использованием ранее сконструированного набора из четырёх плазмидных ДНК, три из которых экспрессируют гены N, P и L вируса Сендай штамма Москва (вспомогательные плазмиды), а четвёртая содержит полноразмерную копию ДНК геномной РНК вируса Сендай штамма Москва (GenBank Acc. KP717417.1), в состав которой введён структурный элемент для встройки и экспрессии трансгенов между генами P и M (pSen2-MCS(M)) (рис. 1) [13]. Структурный элемент включает полилинкер из пяти уникальных сайтов для крупнощепящих эндонуклеаз рестрикции BsiWI, NruI, ClaI, AscI, BssHII, за которым следует сигнал терминации транскрипции трансгена и сигнал реинициации транскрипции последующего гена (M) для РНК-полимеразы вируса Сендай. Экспрессия генов N, P и L вируса Сендай штамма Москва, так же как и синтез геномных РНК рекомбинантных штаммов вируса Сендай, осуществляется с соответствующих плазмидных ДНК под контролем полимеразы фага Т7 в клетках 293-Т7. Точность размера геномных РНК контролируется рибозимами, расположенными по её 3’- и 5’-концам.

 

Рис. 1. Схема конструирования рекомбинантного варианта Sen-RBDdelta(M) вируса Сендай штамма Москва с введением трансгена RBDdelta между генами Р и М. Синтез геномной РНК рекомбинантных штаммов вируса Сендай осуществляется с плазмидной ДНК под контролем полимеразы фага Т7 (указано стрелкой). рТ7 – промотор; ТТ7 – терминатор полимеразы Т7; rib – рибозим.

 

В качестве трансгена для получения вакцинного конструкта использовали последовательность рецептор-связывающего домена S-белка SARS-CoV-2 штамма дельта (RBDdelta, участок S-белка 308V–541F), слитую вместе с сигнальным пептидом (участок S-белка 1M–15C), которую получали методом ПЦР с использованием в качестве матрицы плазмиды pVL3-RBDdelta и пары праймеров Delta-F – Delta-R (таблица). Этот ампликон (трансген RBDdelta и сигнальный пептид S-белка в его N-концевой части) был встроен рестриктазно-лигазным методом по сайтам BsiWI – BssHII в полилинкер геномной плазмиды pSen2-MCS(M) с последующим получением инфекционного рекомбинантного вируса Sen-RBDdelta(M) со встройкой трансгена RBDdelta между генами Р и М (рис. 1). Полногеномное секвенирование подтвердило ожидаемую первичную структуру рекомбинантного варианта.

Экспрессию RBDdelta в составе рекомбинантного варианта Sen-RBDdelta(M) оценивали методом вестерн-блоттинга. В рекомбинантном варианте RBDdelta сконструирован в виде секретируемого белка (содержит лидерный домен в N-концевой части), поэтому для вестерн-блоттинга мы использовали аллантоисную жидкость 11-дневных куриных эмбрионов (рис. 2 а, в) или культуральную среду клеток LLC-MK₂ (рис. 2 б) после их инфицирования штаммом Sen-RBDdelta(M).

 

Рис. 2. Вестерн-блоттинг экспрессии RBDdelta рекомбинантным вирусом Sen-RBDdelta(M): а, в – в аллантоисной жидкости 11-дневных куриных эмбрионов; б – в культуральной среде клеток LLC-MK2. В качестве первичных антител использована поликлональная сыворотка крови мыши, иммунизированной RBDdelta, разведение 1 : 500 (а, б), или сыворотка крови вакцинированного реконвалесцента COVID-19, разведение 1 : 200 (в). М – контроль молекулярной массы; 1 – отрицательный контроль аллантоисной жидкости неинфицированных куриных эмбрионов (а, в) или культуральной среды неинфицированных клеток (б); 2 – положительный контроль RBD (200 нг, 35 кДа), экспрессированного в клетках CHO-К1; 3 – пустая дорожка; 4 – аллантоисная жидкость куриных эмбрионов, инфицированных Sen-RBDdelta(M), 15 мкл (а, в), или культуральная среда клеток, инфицированных Sen-RBDdelta(M) (б).

 

Как следует из рис. 2 а, в, RBDdelta выявляется в аллантоисной жидкости куриных эмбрионов в виде белка с молекулярной массой 39 кДа и взаимодействует как с антителами иммунной мыши, так и с сывороткой крови человека, прошедшего двукратную вакцинацию «Спутником-V», а через полгода переболевшего в лёгкой форме COVID-19. В культуральной среде LLC-MK₂ клеток, инфицированных рекомбинантным штаммом Sen-RBDdelta(M), также выявляется RBDdelta (риc. 2 б) с использованием в качестве первичных антител иммунной сыворотки мыши.

Оценка протективности и иммуногенности Sen-RBDdelta(M) на модели хомяков

Экспериментальной группе золотистых китайских хомяков (n = 8) однократно проводили интраназальную иммунизацию вирусом Sen-RBDdelta(M) в дозе 10⁷ БОЕ/животное. Контрольной группе (n = 8) интраназально вводили фосфатный буферный раствор, на котором проводили разведение вируса. Вирус Сендай является природным патогеном мышей, но он также патогенен и для других грызунов, включая хомяков [20]. В связи с этим всех животных ежедневно наблюдали на предмет побочных клинических реакций после введения рекомбинантного вируса. Иммунизированные животные в 1-ю неделю демонстрировали клинические ухудшения в виде потускнения и локальной потери шерстяного покрова. К 7-м суткам зафиксирована смерть одного вакцинированного животного. В последующие дни клиника системного ответа регрессировала.

Через 28 дней после иммунизации у всех животных измеряли уровень общих и вируснейтрализующих антител класса IgG против вируса SARS-CoV-2 штамма hCoV-19/Russia/MOS-2406/2021 (Delta VOC). У 100% вакцинированных индукции иммунного ответа не выявлено. Показатель титра общих антикоронавирусных антител cоставил менее 1 : 50 (ниже порога определения), показатель титра вируснейтрализующих антител – менее 1 : 7 (ниже порога определения).

На 30-й день после иммунизации группам вакцинированных хомяков и контроля проводили интраназальную инокуляцию вирусом SARS-CoV-2 штаммом hCoV-19/Russia/MOS-2406/2021 (Delta VOC). Контроль клинического состояния после заражения проводили ежедневно, у всех животных фиксировали массу (рис. 3 а). Репликацию коронавируса оценивали методом ОТ-ПЦР-РВ в смывах из полости носа ежедневно со 2-х по 5-е сутки после заражения (рис. 3 б) и на 6-е сутки после окончания эксперимента в тканях лёгких и носовой полости (рис. 3 в).

 

Рис. 3. Клиническое заболевание у хомяков после интраназального заражения штаммом дельта SARS-CoV-2: а – динамика изменения массы тела в процентах, точки – медианные значения, вертикальные линии – 95% доверительные интервалы; б – вирусная нагрузка (копий/мл) в смывах носовой полости; в – вирусная нагрузка (копий/мг) в гомогенатах тканей носовой полости и лёгких, точки – индивидуальные значения, горизонтальные линии – медианы, вертикальные линии – 95% доверительные интервалы. Значения p указаны для статистически значимых различий (p < 0,05) в U-тесте Манна–Уитни.

 

Как показано на рис. 3 а, у всех животных, инфицированных SARS-CoV-2, после заражения наблюдалась прогрессирующая потеря массы тела, у неиммунизированного контроля достигающая к 6-м суткам после заражения 6%, у вакцинированных – 4,2% без значимых различий между группами. Исследование методом ОТ-ПЦР-РВ образцов смывов носовой полости cо 2-х по 5-е сутки (рис. 3 б) и образцов тканей полости носа на 6-е сутки (рис. 3 в) показало присутствие генетического материала вируса SARS-CoV-2 у всех животных без достоверных межгрупповых различий. В тканях лёгких на 6-е сутки в группе иммунизированных выявлено достоверное снижение количества копий вирусной РНК относительно контроля (p = 0,0093, тест Манна–Уитни), разница медиан составила 1,18 lg копий/мг (рис. 3 в).

Патоморфологический анализ показал, что основное различие в состоянии лёгких животных вакцинированной и контрольной групп состояло в преобладании в контрольной группе выраженного нарушения сосудистой проницаемости в форме плазморрагии, достигающей 43–67% от общей площади срезов (рис. 4 а). В лёгких вакцинированных хомяков обширных локусов плазморрагии и геморрагии не обнаруживалось (рис. 4 б).

В группе вакцинированных животных отмечалась наименьшая степень выраженности воспалительно-клеточной инфильтрации. С более слабой воспалительно-клеточной реакцией у вакцинированных хомяков связано и заметное сохранение воздушности лёгочной ткани (рис. 4 б). В контрольной группе наблюдалась потеря воздушности лёгких, которая сопровождалась максимальными проявлениями плазморрагии (рис. 4 а).

 

Рис. 4. Гистологический срез лёгкого сирийского хомяка из контрольной (а) и вакцинированной группы (б).

 

Оценка протективности и иммуногенности Sen-RBDdelta(M) на модели мышей линии BALB/c

В эксперименте использовали 26 мышей линии BALB/c, разделённых на 3 группы: 1-ю группу (n = 9) интраназально иммунизировали рекомбинантом Sen-RBDdelta(M) в дозе 10⁵ БОЕ/мышь; мышам 2-й группы (n = 8) аналогично вводили рекомбинант Sen2-EGFP(М) (контроль вакцинного вектора); 3-й группе (n = 9, отрицательный контроль) интраназально вводили фосфатно-солевой буфер, использованный для получения вирусных суспензий.

Основываясь на ранее полученных данных о патогенности высокой дозы вируса Сендай для хомяков, доза иммунизации мышей была снижена до 10⁵ БОЕ/мышь. При такой дозе иммунизации видимых признаков заболевания и летальность мышей не наблюдали на протяжении всего исследуемого периода. Через 28 дней после иммунизации у всех животных измеряли уровень общих (рис. 5 а) и вируснейтрализующих (рис. 5 б) антител класса IgG против вируса SARS-CoV-2 штамма hCoV-19/Russia/MOS-2406/2021 (Delta VOC).

IgG к коронавирусу были выявлены у всех вакцинированных животных при отрицательных результатах в группах вектора и контроля (рис. 5 а). Вируснейтрализующие антитела (рис. 5 б) выявлены у всех вакцинированных животных, средний геометрический титр составил 127 ± 1,41.

 

Рис. 5. Общие и нейтрализующие антитела класса IgG против дельта-штамма SARS-CoV-2 в сыворотках иммунизированных мышей линии BALB/c: a – значение оптической плотности (OП₄₅₀), определённое методом ИФА; точки – индивидуальные значения, вершины гистограммы – медианы, вертикальные линии – 95% доверительные интервалы; б – титры нейтрализации (HT₅₀), точки – индивидуальные значения, вершины гистограмм – средние геометрические значения, вертикальные линии – стандартные отклонения, горизонтальная пунктирная линия – пороговое значение титра (HT₅₀ < 1 : 10). Значения p указаны для статистически значимых различий (p < 0,05) в тесте множественного сравнения Данна.

 

Протективность вакцины Sen-RBDdelta(M) оценивали в отношении гамма-штамма SARS-CoV-2 hCoV-19/Russia/SA-17620-080521/2021 (Gamma VOC). Выбор гамма-штамма обусловлен восприимчивостью к нему мышей линии BALB/c. Предшествующие эксперименты по заражению вариантом дельта SARS-CoV-2 показали отсутствие развития инфекционного процесса у мышей линии BALB/c [19]. Результаты представлены на рис. 6, из которого следует, что в группе вакцинированных (Sen-RBDdelta(M)) происходит достоверное снижение вирусной нагрузки в обоих органах-мишенях относительно интактного контроля, разница медиан в тканях полости носа составила 3,17 lg копий/мг (p = 0,0012), в тканях лёгких – 2,03 lg копий/мг (p = 0,0377). Группа контроля вектора, иммунизированная рекомбинантом Sen2-EGFP(М), имела больший уровень вирусной нагрузки по сравнению с группой Sen-RBDdelta(M) и меньший в сравнении с интактным контролем без статистически значимых различий между группами.

 

Рис. 6. Вирусная нагрузка (копий/мг) в гомогенатах тканей носовой полости и лёгких мышей BALB/c на 5-е сутки после заражения штаммом гамма SARS-CoV-2. На диаграмме точки – индивидуальные значения, горизонтальные линии – медианы, вертикальные линии – 95% доверительные интервалы. Значения p указаны для статистически значимых различий (p < 0,05) в тесте множественного сравнения Данна.

 

Обсуждение

В качестве антигена для создания интраназальной вакцинной конструкции против COVID-19 на основе вируса Сендай мы использовали секретируемую форму рецептор-связывающего домена S-белка SARS-CoV-2 высокопатогенного штамма дельта (RBDdelta). Секретируемая форма RBDdelta содержит на N-конце сигнальный пептид S-белка MFVFLVLLPLVSSQC, который обеспечивает выход белка во внеклеточное пространство [21]. Ранее было показано, что секретируемая форма рекомбинантного RBD SARS-CoV-2, полученного в клетках яичников китайского хомяка CHO-K1, специфически взаимодействует с человеческим рецептором – ангиотензинпревращающим ферментом 2 и сывороточными IgG реконвалесцентов COVID-19, а также обеспечивает индукцию специфического гуморального иммунного ответа у мышей при двукратной внутрибрюшинной иммунизации с использованием в качестве адъюванта гидроокиси алюминия [16].

Полученный нами рекомбинантный вариант вируса Сендай штамма Москва Sen-RBDdelta(M) эффективно продуцирует RBDdelta в культуральную среду и аллантоисную жидкость при заражении клеток LLC-MK₂ и куриных эмбрионов соответственно. Это свидетельствует о стабильности экспрессии трансгена RBDdelta в составе рекомбинантного вируса Сендай в разных клеточных системах. Продуцируемый RBDdelta взаимодействует как с антителами иммунной мыши, так и с сывороткой крови человека, прошедшего двукратную вакцинацию «Спутником-V», а через полгода переболевшего COVID-19 в лёгкой форме. Это свидетельствует об иммуноидентичности секретируемого рекомбинантным вариантом Sen-RBDdelta(M) белка RBDdelta и RBD домена вирионного S-гликопротеина SARS-CoV-2.

Для оценки иммуногенности и протективности рекомбинантного штамма Sen-RBDdelta(M) в отношении вируса SARS-CoV-2 мы использовали два вида лабораторных животных: высокочувствительных к коронавирусной инфекции хомяков и избирательно чувствительных к некоторым штаммам SARS-CoV-2 мышей линии BALB/c. В обоих случаях мы использовали однократное интраназальное введение препарата Sen-RBDdelta(M), поскольку такой путь вакцинации является наилучшим в плане простоты использования, а также наименее травматичным и безопасным в сравнении с парентеральным введением.

При вакцинации сирийских хомяков препаратом Sen-RBDdelta(M) не выявлено достоверных признаков индукции гуморального ответа в отношении вируса SARS-CoV-2 через 4 недели после вакцинации. Однако последующее заражение вакцинированных хомяков дельта-вариантом SARS-CoV-2 показало наличие протективного эффекта исследуемой вакцины в тканях лёгких, в 15 раз (на 1,18 lg) снизив репликационную активность вируса SARS-CoV-2 относительно неиммунизированного контроля на 6-е сутки после заряжания. Выраженное нарушение сосудистой проницаемости (плазморрагии) тканей лёгких, выявленное у животных контрольной группы, являлось основным патоморфологическим признаком тяжести инфекционного процесса.

Полученные данные согласуются с данными литературы о слабой восприимчивости хомяков к иммунизации RBD шиповидного белка SARS-CoV-2 как в виде субъединичных вакцин [22], так и в составе векторной конструкции [23]. Выявленный протективный эффект может быть связан с индуцированным вакциной специфическим клеточным иммунным ответом, как было показано в работе [24].

На модели мышей линии BALB/c показано, что однократная интраназальная иммунизация рекомбинантным вирусом Sen-RBDdelta(M) индуцирует гуморальный ответ с формированием нейтрализующих антител класса IgG к дельта-варианту SARS-CoV-2 через 4 недели после иммунизации. Заражение вакцинированных мышей патогенным для них гамма-штаммом SARS-CoV-2 продемонстрировало высокую протективность вакцины Sen-RBDdelta(M). В результате анализа вирусной нагрузки на 5-е сутки после заражения в сравнении с контролем определено достоверное снижение количества РНК вируса SARS-CoV-2 в 107 раз (на 2,09 lg) в тканях лёгких и в 1497 раз (на 3,27 lg) в тканях носовой полости. Важно отметить, что интраназальное введение вектора Sen2-EGFP(М) также обладало хорошим защитным эффектом, обеспеченным, как мы полагаем, известными иммуностимулирующими свойствами самого вируса Сендай [5, 9].

Заключение

Проведённое нами исследование подтвердило имеющиеся в литературе данные, что хомяки не являются адекватной моделью для оценки иммуногенности вакцин, основным антигеном которых является RBD шиповидного белка SARS-CoV-2. Несмотря на отсутствие гуморального иммунитета, однократная интраназальная вакцинация хомяков рекомбинантным вариантом Sen-RBDdelta(M) обеспечивает защиту лёгких от развития пневмонии, останавливая инфекцию коронавируса в верхних дыхательных путях. На модели мышей линии BALB/c показана эффективная индукция вируснейтрализующих антител после однократной интраназальной иммунизации вирусом Sen-RBDdelta(M), а также его высокая протективность в отношении коронавирусной инфекции, существенный вклад в которую вносит векторный компонент рекомбинантного конструкта.

Таким образом, полученный нами рекомбинантный вариант вируса Сендай штамма Москва Sen-RBDdelta(M) является перспективным вакцинным конструктом в отношении вируса SARS-CoV-2 и обладает протективными свойствами уже при однократном интраназальном введении. Дальнейшие доклинические исследования, включающие расширение круга модельных животных, оптимизацию дозы вакцинации, оценку параметров мукозального и клеточного иммунного ответа, позволят однозначно оценить вакцинный потенциал рекомбинантного варианта Sen-RBDdelta(M) вируса Сендай штамма Москва.

About the authors

Gleb A. Kudrov

State Research Center of Virology and Biotechnology “Vector” of Rospotrebnadzor

Email: kudrov_ga@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0002-8251-7040

junior research assistant

Russian Federation, 630559, Koltsovo, Novosibirsk Region

Sergei S. Zainutdinov

State Research Center of Virology and Biotechnology “Vector” of Rospotrebnadzor

Email: zaynutdinov_ss@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0001-5818-4402

researcher

Russian Federation, 630559, Koltsovo, Novosibirsk Region

Antonina A. Grazhdantseva

State Research Center of Virology and Biotechnology “Vector” of Rospotrebnadzor

Email: gaa@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0001-7712-3699

PhD, senior researcher

Russian Federation, 630559, Koltsovo, Novosibirsk Region

Andrey V. Shipovalov

State Research Center of Virology and Biotechnology “Vector” of Rospotrebnadzor

Email: shipovalov_av@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0003-1201-8307

researcher

Russian Federation, 630559, Koltsovo, Novosibirsk Region

Galina F. Sivolobova

State Research Center of Virology and Biotechnology “Vector” of Rospotrebnadzor

Email: sgf@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0002-8362-0314

PhD, senior researcher

Russian Federation, 630559, Koltsovo, Novosibirsk Region

Anastasiya V. Semenova

State Research Center of Virology and Biotechnology “Vector” of Rospotrebnadzor

Email: tkacheva_av@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0001-7767-0537

PhD, senior researcher

Russian Federation, 630559, Koltsovo, Novosibirsk Region

Iuliia A. Merkuleva

State Research Center of Virology and Biotechnology “Vector” of Rospotrebnadzor

Email: merkuleva_yua@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0002-6974-0686

PhD, junior research assistant

Russian Federation, 630559, Koltsovo, Novosibirsk Region

Dmitry N. Shcherbakov

State Research Center of Virology and Biotechnology “Vector” of Rospotrebnadzor

Email: scherbakov_dn@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0001-8023-4453

PhD, head of laboratory

Russian Federation, 630559, Koltsovo, Novosibirsk Region

Oleg S. Taranov

State Research Center of Virology and Biotechnology “Vector” of Rospotrebnadzor

Email: taranov@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0002-6746-8092

head of department

Russian Federation, 630559, Koltsovo, Novosibirsk Region

Anna V. Zaykovskaya

State Research Center of Virology and Biotechnology “Vector” of Rospotrebnadzor

Email: zaykovskaya_av@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0002-0450-5212

PhD, senior researcher

Russian Federation, 630559, Koltsovo, Novosibirsk Region

Irina S. Shulgina

State Research Center of Virology and Biotechnology “Vector” of Rospotrebnadzor

Email: Shulgina_is@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0002-6850-338X

graduate student

Russian Federation, 630559, Koltsovo, Novosibirsk Region

Oleg V. Pyankov

State Research Center of Virology and Biotechnology “Vector” of Rospotrebnadzor

Email: pyankov@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0003-3340-8750

PhD, head of department

Russian Federation, 630559, Koltsovo, Novosibirsk Region

Galina V. Kochneva

State Research Center of Virology and Biotechnology “Vector” of Rospotrebnadzor

Author for correspondence.
Email: kochneva@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0002-2420-0483

Dr. Sci. (Biol.), head of laboratory

Russian Federation, 630559, Koltsovo, Novosibirsk Region

References

Supplementary files