Influence of siRNA complexes on the reproduction of influenza A virus (Orthomyxoviridae: Alphainfluenzavirus) in vivo

Full Text

Введение

Данная статья является продолжением работ по созданию эффективных и безопасных средств терапии вирусных инфекций, начатых в 2019 г. группой ученых Научно-исследовательского института вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова (НИИ ВС им. И.И. Мечникова, Россия) [1–3].

Одними из наиболее распространённых инфекционных заболеваний верхних дыхательных путей и лёгких являются инфекции, вызванные вирусом гриппа А. Ежегодно от гриппа страдает до 20% мирового населения, а также отмечается до 650 000 случаев летальных исходов [4]. Появление новых вирулентных штаммов способно спровоцировать развитие пандемий, что, в свою очередь, может привести к многомиллионным жертвам, как это было во время пандемий гонконгского и испанского гриппа [5, 6]. Использование вакцинных препаратов в качестве профилактической меры не способно полностью предотвратить заболеваемость среди населения ввиду формирования иммунитета лишь к определённым штаммам вирусов, что снижает эффективность их применения по отношению к новым эмерджентным штаммам. Помимо этого, есть и другие причины, снижающие положительный эффект от применения вакцин: низкий уровень доверия населения к вакцинопрофилактике, антипрививочная пропаганда, а также пациенты, чья вакцинация не представляется возможной по причине определённых противопоказаний [7–9]. Использование иных противогриппозных препаратов несёт профилактический и терапевтический эффект, однако их широкое применение ограничено постоянным появлением резистентных к ним вариантов вирусов и риском развития нежелательных побочных эффектов [10–13].

Исходя из этого, на сегодняшний день существует острая потребность в принципиально новом противовирусном препарате, для которого не будет иметь значения образование новых резистентных штаммов. Разрабатываемые препараты, чей механизм действия основан на явлении РНК-интерференции, могут стать решением проблемы вирусной резистентности.

РНК-интерференция – внутриклеточный процесс, в результате которого происходит деградация матричной РНК (мРНК) посредством молекул малых интерферирующих РНК (миРНК). В клетках млекопитающих РНК-интерференция может быть запущена как синтетическими миРНК, так и полученными в результате нарезки эндонуклеазой Dicer чужеродной двухцепочечной РНК [14]. РНК-интерференция протекает в несколько этапов: экзогенная мРНК разделяется белком-эндонуклеазой Dicer на короткие (20–25 п.н.) последовательности, которые являются миРНК. Далее миРНК связывается с белковым комплексом RISC (RNA-induced silencing complex). Полученный комплекс миРНК и RISC подвергает целевую мРНК деградации [15].

Ввиду того что миРНК обеспечивают снижение экспрессии любого выбранного гена, в настоящее время они представляют собой класс молекул, имеющих важное медицинское значение. В ряде независимых исследований уже был показан противовирусный эффект в отношении таких заболеваний, как респираторно-синцитиальная вирусная инфекция, ВИЧ-инфекция, гепатит B и C, грипп [16–20]. Был также показан терапевтический эффект от применения препаратов Патисиран (Patisiran) и Гивосиран (Givosiran), применяемых в терапии генетически обусловленных заболеваний – амилоидной полинейропатии и острой печеночной порфирии [21, 22]. Точно также ранее нами было показано, что миРНК, направленные к клеточным генам FLT4, Nup98 и Nup205, играющим важную роль в процессах эндоцитоза вируса гриппа и в импорте и экспорте сегментов вирусной РНК (вРНК) в полость ядра, способны ингибировать репродукцию вируса гриппа А в культуре клеток лёгких А549 [1–3]. Для разработки и создания препаратов миРНК, допустимых к применению у людей, необходимо провести оценку противовирусного действия миРНК на животной модели. Дополнительно препараты миРНК не должны обладать выраженным токсическим действием и побочным эффектом на фоне подавления экспрессии генов клетки-хозяина.

Резюмируя вышесказанное, следует отметить, что вирусные респираторные инфекции на сегодняшний день являются одним из наиболее актуальных источников заболеваемости и смертности в мире. Ввиду ограниченного эффекта от применения имеющихся в настоящее время вакцин и противовирусных препаратов особо важной задачей для отечественного здравоохранения становится разработка принципиально новых методов терапии и профилактики респираторных вирусных инфекций. Одним из потенциально перспективных методов терапии гриппозной инфекции является применение миРНК, направленных к клеточным генам, косвенно принимающим участие в вирусной репродукции. Исходя из этого, целью работы является оценка профилактического потенциала миРНК, направленных к клеточным генам FLT4, Nup98 и Nup205 in vivo, в отношении гриппозной инфекции.

Материалы и методы

миРНК

Подбор миРНК осуществлялся к кодирующим областям мРНК, а конкретно к экзонсодержащим областям, и обусловливался тем, что после сплайсинга экзоны соединяются между собой, образуя зрелую мРНК (промежуточный продукт экспрессии гена). Уже зрелая мРНК подвергается воздействию со стороны миРНК, в результате чего на стадии трансляции не происходит синтеза конечного продукта экспрессии гена – белка.

Дизайн миРНК осуществляли с помощью ресурса siDirect 2.0¹. Олигорибонуклеотиды («Синтол», Россия) разводили водой до концентрации 100 пмоль/мкл. Далее комплементарные олигонуклеотиды («Синтол», Россия) смешивали, инкубировали в термостате при 60 °С в течение 1 мин, затем охлаждали до комнатной температуры. Готовые РНК-дуплексы хранили при температуре −70 °С. Все работы с готовыми дуплексами проводились с использованием холодового штатива. Последовательности используемых миРНК представлены в таблице. Каждый олигорибонуклеотид имеет два дезоксинуклеотида на 3’-конце. Это необходимо для минимизации отрицательного влияния ферментов-экзонуклеаз. В качестве неспецифического контроля использовалась миРНК siL2, специфичная к гену светляковой люциферазы и не влияющая на жизненный цикл клеток А549.

 

Таблица. Последовательности миРНК, использованные в работе

Table. Sequences of siRNAs used in the study

миРНК / siRNA	Последовательность / Sequence
FLT4.1	5’-UCACAUAGAAGUAGAUGAGdTdC-3’ 5’-CUCAUCUACUUCUAUGUGAdCdC-3’
FLT4.2	5’-UGUGAAUUAGGAUCUUGAGdCdT-3’ 5’-CUCAAGAUCCUAAUUCACAdTdC-3’
Nup98.1	5’-UUUGUACUGAUGUUAGUGCdTdA-3’ 5’-GCACUAACAUCAGUACAAAdGdC-3’
Nup98.2	5’-AUCCAAAUUUAGAUUUGUCdAdA-3’ 5’-GACAAAUCUAAAUUUGGAUdGdA-3’
Nup205.1	5’-AUCUACAAAAUCUUCAAGCdTdG-3’ 5’-GCUUGAAGAUUUUGUAGAUdCdA
siL2 (неспецифическая миРНК / nonspecific siRNA)	5’-UUUCCGUCAUCGUCUUUCCdTdT-3’ 5’-GGAAAGACGAUGACGGAAAdTdT-3’

 

Вирус

В работе использован вирус гриппа A/California/7/09 (H₁N₁), полученный из коллекции вирусов НИИ ВС им. И.И. Мечникова. Культивирование и определение титра вируса проводилось на культуре клеток MDCK.

Культуры клеток

В работе использовались клетки почек кокер-спаниеля MDCK (Институт Пастера, Франция) и клетки мышиных фибробластов L929 (НИИ ВС им. И.И. Мечникова, Россия). Клетки MDCK выращивали в среде MEM («ПанЭко», Россия), содержащей 5% эмбриональной сыворотки коров (ЭСК) Gibco (Fisher Scientific, Новая Зеландия), 40 мкг/мл гентамицина («ПанЭко», Россия) и 300 мкг/мл L-глутамина («ПанЭко», Россия) при 37 °С в CO₂-инкубаторе. Клетки L929 выращивали в среде DMEM («ПанЭко», Россия), содержащей 5% ЭСК, 40 мкг/мл гентамицина и 300 мкг/мл L-глутамина при 37 °С в CO₂-инкубаторе.

Мыши

Мышей линии BALB/C – самок с массой тела 17–20 г – получали из питомника «Столбовая» (Московская обл., Россия). Животные содержались в виварии на стандартном рационе со свободным доступом к брикетированному корму и воде. Содержание соответствовало правилам по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник. Маркировка мышей производилась с помощью красителей.

Авторы подтверждают соблюдение институциональных и национальных стандартов по использованию лабораторных животных в соответствии с Consensus author guidelines for animal use (IAVES, July 23, 2010). Исследование одобрено этическим комитетом ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» (протокол № 04-21 от 18.02.2021).

Введение комплексов миРНК мышам с последующим заражением вирусом гриппа A/California/7/09 H₁N₁

Мышей заражали в возрасте от 7 до 9 недель. Рекомендуемое количество вещества миРНК составило 1,5 нмоль/мкл [23]. миРНК вводились мышам интраназально под наркозом по 30 мкл на особь. Введение миРНК осуществлялось без использования носителя. Через 4 ч после интраназального введения миРНК проводилось заражение мышей вирусом гриппа A/California/7/09 H₁N₁ в дозе LD₅₀. Объём введённой вируссодержащей жидкости составил 30 мкл для каждой особи кроме тех, которые были включены в отрицательный контроль.

Получение лёгких мышей

На 3-й день после введения комплексов миРНК и инфицирования вирусом гриппа мышей умерщвляли и в стерильных условиях извлекали лёгкие. После промывки в растворе Хенкса проводилась гомогенизация лёгких. Далее гомогенат осветляли от клеточного детрита центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5 мин. Полученный супернатант использовали для определения вирусного титра и изменения количества вРНК.

Выявление вРНК

вРНК выделяли из лёгочного гомогената мышей набором ExtractRNA (Evrogen, Россия). Для постановки реакции обратной транскрипции (ОТ) применяли набор реагентов ОТ-1 («Синтол», Россия). Изменение концентрации вРНК контролировали с помощью количественной ОТ-ПЦР-РВ (полимеразной цепной реакции с ОТ в реальном времени) с набором праймеров и зондов к М-гену вируса гриппа А. Для ПЦР-РВ использовали набор реагентов для проведения ПЦР-РВ в присутствии красителя EVA Green и референсного красителя ROX («Синтол», Россия). Рабочая концентрация праймеров и зондов составила 10 и 5 пмоль/мкл соответственно. Реакция ПЦР-РВ проводилась в амплификаторе ДТ-96 («ДНК-технология», Россия). Температурно-временной режим составил 95 °С 5 мин (1 цикл), 62 °С – 40 с, 95 °С – 15 с (40 циклов). Праймеры и зонды («Синтол», Россия) представлены в нашем раннем исследовании [1].

Расчёт экспрессии целевого гена с использованием критерия 2^−ΔΔCt

Оценка изменения экспрессии целевого гена проводилась с использованием критерия 2^−ΔΔCt. Проводился расчёт разницы трёх повторов пороговых циклов ПЦР (∆Ct) между исследуемыми генами отрицательного контроля и геном домашнего хозяйства GAPDH:

∆Ct = Ct (интересующий ген) – Ct (GAPDH).

Аналогичный расчёт ∆Ct проводился для клеток, обработанных миРНК. Полученные данные усреднялись.

После определения ∆Ct для всех групп исследования полученные с трёх повторов данные ∆Ct усреднялись, а затем рассчитывалось значение ∆∆Ct относительно среднего значения ∆Ct для клеток, обработанных миРНК:

∆∆Ct = ∆Ct (обработанный образец) – ∆Ct (отрицательный контроль).

Для определения критерия 2^−ΔΔCt необходимо 2 возвести в полученное значение ∆∆Ct для каждого исследуемого гена [24]. Далее данные 2^–ΔΔCt будут представлены в процентах. Расчёт изменения экспрессии проводился относительно изменения экспрессии целевых генов (FLT4, Nup98 и Nup205) в неинфицированной культуре клеток, трансфицированной миРНК L2, неспецифичной по отношению к указанным мышиным.

Титрование вируса по конечной точке цитопатического действия

Вирусный титр определялся по крайней точке визуального проявления цитопатического эффекта в культуре клеток MDCK. Клетки MDCK сеяли в 96-луночные планшеты с посевной концентрацией 1 × 10⁴/см². Через двое суток питательная среда удалялась из лунок, вносили 10-кратные последовательные разведения вирусного материала в поддерживающей среде без трипсина и инкубировали на протяжении четырех суток в СО₂-инкубаторе при 37 °С. На четвертые сутки проводили визуальный учёт результатов титрования под микроскопом на наличие специфического цитопатического эффекта для вируса гриппа (изменение, деформация, открепление мёртвых клеток со дна лунки). Вирусный титр рассчитывался по M.A. Ramakrishnan [25] и выражался как логарифм тканевых цитопатогенных доз (lg ТЦД₅₀/мл).

Статистическая обработка данных

Статистическую значимость полученных результатов определяли с помощью критерия Манна–Уитни. Разница считалась достоверной при p ≤ 0,01 и p ≤ 0,05.

Результаты

Оценка ингибирующего эффекта миРНК на экспрессию целевых генов

Промежуточным продуктом экспрессии гена является мРНК, а конечным – белок [26]. Для оценки подавляющего влияния миРНК на экспрессию генов FLT4, Nup98 и Nup205 была взята культура L929 и проведена трансфекция миРНК в эту культуру. Продукты экспрессии отобранных генов активно взаимодействуют с вирусом гриппа на разных этапах его репродукции [27–29]. Далее выполнялась проверка способности полученных синтетических миРНК ингибировать экспрессию целевых генов. При трансфекции миРНК Nup98.1 и Nup205.1 экспрессия целевых генов в среднем снижалась на 61% на первые сутки и на 44% на вторые сутки относительно неспецифического контроля L2. Снижение экспрессии на 34% на третьи сутки отмечалось при использовании миРНК Nup98.1 и Nup205.1 относительно неспецифического контроля L2. В качестве неспецифического контроля было принято изменение экспрессии генов Nup98 и Nup205 в неинфицированной культуре клеток, обработанных миРНК L2, направленной к гену светляковой люциферазы. За 100% транскрипции клеточных генов Nup98 и Nup205 было принято изменение экспрессии данных генов в неинфицированной культуре клеток, обработанных миРНК L2. Применение миРНК FLT4.1, FLT4.2 и Nup98.2 не приводило к какому-либо изменению экспрессии относительно неспецифической миРНК L2. Оценка подавления экспрессии генов проводилась с использованием метода 2^–∆∆Ct [30]. На рис. 1 показана эффективность нокдауна мРНК в клетках L929.

 

Рис. 1. Влияние миРНК на экспрессию генов Nup98 и Nup205.По оси абсцисс указаны названия миРНК, направленных к одноимённым генам. По оси ординат показано изменение экспрессии генов Nup98 и Nup205 после обработки клеток комплексами миРНК относительно неспецифической миРНК L2 (в %). *р ≤ 0,05. Fig. 1. Effect of siRNA on the expression of genes FLT4, Nup98, and Nup205. The X-axis shows the names of siRNAs targeting the genes of the same name. The Y-axis shows the changes in the expression of the FLT4, Nup98 and Nup205 genes after treatment of cells with siRNA complexes relative to nonspecific siRNA L2, expressed (in %). *р ≤ 0.05.

 

Влияние одиночных комплексов миРНК на изменение массы тела после заражения

Одним из критериев эффективности применения противовирусных препаратов является снижение потери массы тела в результате инфекции. После заражения мышей вирусом гриппа A/California/7/09 (H₁N₁) не наблюдалось выраженных различий в потере массы тела между контрольными группами мышей и мышами, обработанными молекулами миРНК. После интраназального введения мышам миРНК Nup205.1 не отмечалось выраженной потери массы, а на третьи сутки после интраназального введения миРНК показатель массы мышей в этих группах был достоверно различим по сравнению с группами неспецифического и вирусного контроля. Полученные данные представлены на рис. 2.

 

Рис. 2. Влияние комплексов миРНК на изменение массы мышей в течение трёх суток после заражения вирусом гриппа A/California/7/09 (H1N1) в динамике.На оси абсцисс представлены миРНК и их одноимённые целевые клеточные гены. На оси ординат представлено изменение массы тела в (в %). *р ≤ 0,05. Fig. 2. The effect of siRNA complexes on dynamic changes of mice body weight during three days after infection with the influenza A/California/7/09 (H₁N₁) virus. The X-axis shows siRNAs and respective target cellular genes of the same name. The Y-axis shows the changes in body weight, expressed (in %). *р ≤ 0.05.

 

Влияние комплексов миРНК на репродукцию вируса гриппа A/California/7/09 (H₁N₁) in vivo

Далее проводилась оценка противовирусного эффекта комплексов миРНК в отношении вируса гриппа A/California/7/09 (H₁N₁). Мышей забивали на третьи сутки после интраназального введения миРНК и заражения, после чего извлекали лёгкие, выделяли из них вирус и проводили его титрование. Было установлено, что при LD₅₀ использование всех миРНК приводило к снижению вирусной репродукции. Применение миРНК Nup98.1 приводило к снижению вирусной репродукции на третьи сутки на 2,3 lg ТЦД₅₀/мл по отношению к неспецифическому и вирусному контролю. На 2,1 lg ТЦД₅₀/мл достоверно снижался вирусный титр по отношению к контрольным группам соответственно при использовании миРНК Nup205.1. Полученные данные представлены на рис. 3.

 

Рис. 3. Влияние подавления генов Nup98 и Nup205 посредством миРНК на репродукцию вируса гриппа A/California/7/09 (H1N1) на третьи сутки с момента трансфекции при LD50.По оси абсцисс – названия миРНК. По оси ординат представлен показатель вирусного титра. *р ≤ 0,05. Fig. 3. Effect of siRNA suppression of the Nup98 and Nup205 genes on the reproduction of influenza A/California/7/09 (H₁N₁) virus on the third day after infection with LD₅₀. The X-axis shows the name of the siRNA. The Y-axis shows the viral titers. *р ≤ 0.05.

 

Влияние комплексов миРНК на динамику вРНК вируса гриппа A/California/7/09 (H₁N₁) in vivo

Далее было проведено определение изменения вРНК при обработке клеток миРНК. При оценке влияния миРНК на изменение количества вРНК при использовании штамма A/California/7/09 (H₁N₁) было установлено, что обработка клеток миРНК Nup98.1 и Nup205.1 приводила к достоверно эффективному снижению вРНК на третьи сутки после заражения клеток по сравнению с неспецифическим и вирусным контролем в 6,6 и 2,9 раза соответственно. Полученные данные представлены на рис. 4.

 

Рис. 4. Влияние подавления генов Nup98 и Nup205 посредством миРНК на изменение вРНК на третьи сутки с момента трансфекции при LD50.По оси абсцисс – названия миРНК. По оси ординат представлено количество вРНК. *р ≤ 0,05. Fig. 4. Effect of siRNA suppression of Nup98 and Nup205 genes on concentration of viral RNA on the third day after infection with LD₅₀.  The X-axis shows the names of siRNAs. The Y-axis shows the concentration of viral RNA. *р ≤ 0.05.

 

Влияние пула миРНК на репродукцию вируса гриппа A/California/7/09 (H₁N₁) in vivo

Исходя из полученных результатов, нами были отобраны две миРНК, наиболее эффективно показавшие себя в качестве одиночных противовирусных молекул, – Nup98.1 и Nup205.1 (Nup98/Nup205). Из этих двух миРНК был создан пул, одновременно направленный к одноимённым генам. Далее мы интраназально ввели данный комплекс мышам, после чего заразили их вирусом гриппа A/California/7/09 (H₁N₁). Мышей забивали на третьи сутки, после чего из лёгких выделяли вирус для последующего титрования, а также определяли количество вРНК. При оценке вирусной репродукции было получено, что у мышей, которым интраназально вводился комплекс Nup98.1/Nup205.1 (Nup98/Nup205), вирусный титр был достоверно ниже (на 1,4 lg ТЦД₅₀/мл) по сравнению с неспецифическим контролем. Полученные данные представлены на рис. 5.

 

Рис. 5. Влияние пула миРНК Nup98.1/Nup205.1 на репродукцию вируса гриппа A/California/7/09 (H1N1) на третьи сутки с момента трансфекции при LD50.По оси абсцисс – названия миРНК. По оси ординат представлен показатель вирусного титра. *р ≤ 0,05. Fig. 5. Effect of the Nup98.1/Nup205.1 siRNA pool on the reproduction of influenza A/California/7/09 (H₁N₁) virus on the third day after infection with LD₅₀. The X-axis shows the names of the siRNAs. The Y-axis shows the viral titers. *р ≤ 0.05.

 

Влияние пула миРНК Nup98.1/Nup205.1 на изменение вРНК на третьи сутки с момента трансфекции при LD₅₀

Наряду с этим было получено, что при снижении вирусного титра также наблюдалась и достоверная разница (в 2 раза) между клетками, обработанными поликомплексом миРНК, и клетками с неспецифическим контролем siL2. Полученные данные представлены на рис. 6.

 

Рис. 6. Влияние подавления генов Nup98 и Nup205 посредством миРНК на изменение вРНК на третьи сутки с момента трансфекции при LD50.По оси абсцисс – названия миРНК. По оси ординат представлено количество вРНК. *р < 0,05. Fig. 6. Effect of siRNA suppression of Nup98 and Nup205 genes on concentration of viral RNA on the third day after challenge with LD₅₀. The X-axis shows the names of siRNAs. The Y-axis shows the concentration of viral RNA. *p < 0.05.

 

Обсуждение

Данное исследование является частью цикла работ по оценке противовирусной активности миРНК, направленных к клеточным генам, продукты экспрессии которых принимают непосредственное участие в процессе вирусной репродукции. Была проведена серия экспериментов по оценке эффективности подавления экспрессии как одного гена, так и одновременно нескольких клеточных генов с использованием комплексов миРНК, направленных к генам Nup98 и Nup205. В ходе экспериментов были получены данные о том, что как одиночное, так и групповое применение миРНК приводит к достоверному снижению вирусной репродукции. Наиболее эффективный противовирусный эффект наблюдался при использовании миРНК Nup98 (подобраны к области 8-го экзона одноимённого гена (позиция экзона – 28 811...28 974)) и Nup205 (подобраны к области 17-го экзона одноимённого гена (позиция экзона – 30 466...30 565)), направленных к кодирующим областям мРНК. Подбор миРНК к областям экзона обусловлен тем, что после сплайсинга экзоны соединяются между собой, образуя зрелую мРНК (промежуточный продукт экспрессии гена). Далее миРНК подвергает мРНК деградации, в результате чего на стадии трансляции не происходит синтеза белка. Для оценки эффективности комплексов миРНК использовалось два методических подхода: титрование вируса по цитопатическому действию и ОТ-ПЦР-РВ, которые согласовывались между собой. Полученные данные коррелировали друг с другом: при снижении вирусного титра наблюдалось и снижение вРНК.

Параллельно с этим была проведена оценка изменения массы тела заражённых мышей после интраназального введения им миРНК. Было получено, что достоверное нарастание мышиной массы отмечается на третьи сутки после заражения при использовании миРНК Nup205.1. При введении мышам поликомплекса миРНК Nup98.1/Nup205.1 не было достоверной разницы изменения массы тела по сравнению контрольными группами, однако отмечалось достоверное снижение вирусного титра на 1,4 lg ТЦД₅₀/мл. Несмотря на столь небольшое снижение вирусного титра, имеется ряд исследований, в которых показано, что такое снижение вирусной активности повышает выживаемость при заражении животных летальными дозами вируса гриппа [31, 32]. Выраженный противовирусный эффект мог быть также индуцирован и активацией неспецифических факторов врождённого иммунитета, таких как интерфероны или другие провоспалительные эффекторы. Одной из причин активации данного звена иммунитета может быть то, что при попадании в организм, помимо противовирусного эффекта, миРНК оказывает ещё и иммуномодулирующий эффект, связываясь с Toll-подобными рецепторами 3-го типа, в результате чего происходит активация ряда провоспалительных цитокинов [33, 34].

Важность полученных результатов опосредуется ещё и тем, что мышам миРНК вводились всего один раз за 4 ч до заражения и отсутствовал носитель для осуществления трансфекции. Дополнительно для заражения использовались те дозы вируса, которые, вероятно, выше тех, с которыми человек может встретиться в повседневной жизни.

Заключение

На сегодняшний день особо актуальным является вопрос разработки и создания средств экстренной и эффективной профилактики и терапии респираторных вирусных инфекций. В настоящем исследовании получены данные о том, что применение миРНК, одиночно или комплексно направленных к клеточным генам на модели in vivo, способно достоверно приводить к снижению вирусной репродукции, а также к повышению выживаемости лабораторных животных. Дополнительно в данном исследовании получены результаты, показывающие, что блокировка вирусной репродукции на стадии ядерного импорта и экспорта приводит к наиболее эффективному снижению вирусной репродукции. Полученные результаты, показывающие высокую противовирусную эффективность миРНК на модели in vivo, а также данные наших прошлых исследований [1–3] позволяют рекомендовать миРНК в качестве основного действующего компонента перспективного прототипа препарата для клинических испытаний. При этом важно понимать, что при дальнейшей оптимизации молекул миРНК, условии трансфекции и подавлении активности клеточных генов, а также использовании в более высоких концентрациях миРНК могут оказаться ещё более мощным ингибитором развития не только гриппозной, но и любой другой респираторной вирусной инфекции. В глобальном масштабе результаты проведённого исследования способствуют разработке принципов быстрого конструирования и наработке специфических и эффективных противовирусных миРНК. Это позволит экстренно реагировать на развитие эпидемий и пандемий, индуцируемых вирусами, относящимися к разным таксономическим группам, а также эффективно противостоять им.

¹siDirect version 2.0. Highly effective, target specific siRNA online design site. Available from: https://sidirect2.rnai.jp.

About the authors

Evgeny A. Pashkov

Sechenov First Moscow State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation (Sechenov University); I.I. Mechnikov Scientific and Research Institute of Vaccines and Sera

Author for correspondence.
Email: pashckov.j@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5682-4581

postgraduate of microbiology, virology and immunology department; junior researcher laboratory of virology applied

Russian Federation, 119991, Moscow; 105064, Moscow

Viktoriia Y. Momot

Sechenov First Moscow State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation (Sechenov University)

Email: momot_v_yu@student.sechenov.ru
ORCID iD: 0000-0003-3476-5485

student of the Institute of Medical Biochemistry

Russian Federation, 119991, Moscow

Anastasia V. Pak

Sechenov First Moscow State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation (Sechenov University)

Email: dcnnpk@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-4295-7858

student of the Institute of Clinical Medicine

Russian Federation, 119991, Moscow

Roman V. Samoilikov

I.I. Mechnikov Scientific and Research Institute of Vaccines and Sera

Email: roma_sam78@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6405-1390

researcher laboratory of molecular immunology

Russian Federation, 105064, Moscow

George A. Pashkov

Sechenov First Moscow State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation (Sechenov University)

Email: georgp2004@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0392-9969

student of the Institute of Children Health

Russian Federation, 119991, Moscow

Galina N. Usatova

Sechenov First Moscow State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation (Sechenov University)

Email: g.n.usatova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8955-3570

Ph. D., private-docent Professor of Microbiology, Virology and Immunology department

Russian Federation, 119991, Moscow

Elena O. Kravtsova

Sechenov First Moscow State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation (Sechenov University)

Email: elenakravtsov@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-9100-0422

Ph. D., private-docent Professor of Microbiology, Virology and Immunology department

Russian Federation, 119991, Moscow

Alexander V. Poddubikov

I.I. Mechnikov Scientific and Research Institute of Vaccines and Sera

Email: poddubikov@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-8962-4765

Ph. D., The Head of laboratory of opportunistic pathogenic bacteria

Russian Federation, 105064, Moscow

Firaya G. Nagieva

I.I. Mechnikov Scientific and Research Institute of Vaccines and Sera

Email: fgn42@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-8204-4899

MD, private-docent, The Head of laboratory of hybrid cell cultures

Russian Federation, 105064, Moscow

Alexander V. Sidorov

I.I. Mechnikov Scientific and Research Institute of Vaccines and Sera

Email: sashasidorov@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-3561-8295

Ph. D., The Head of laboratory of DNA viruses

Russian Federation, 105064, Moscow

Evgeny P. Pashkov

Sechenov First Moscow State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation (Sechenov University)

Email: 9153183256@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4963-5053

MD, Professor of Microbiology, Virology and Immunology department

Russian Federation, 119991, Moscow

Oxana A. Svitich

Sechenov First Moscow State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation (Sechenov University); I.I. Mechnikov Scientific and Research Institute of Vaccines and Sera

Email: svitichoa@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1757-8389

Corresponding member of RAS, MD, The head; Professor of Microbiology, Virology and Immunology department

Russian Federation, 119991, Moscow; 105064, Moscow

Vitaliy V. Zverev

Sechenov First Moscow State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation (Sechenov University); I.I. Mechnikov Scientific and Research Institute of Vaccines and Sera

Email: vitalyzverev@outlook.com
ORCID iD: 0000-0002-0017-1892

Academician of RAS, Doctor of Biological Sciences, Scientific Adviser; Professor, The Leader of Microbiology, Virology and Immunology department

Russian Federation, 119991, Moscow; 105064, Moscow

References

Supplementary files