Genetic diversity of capsid protein (p24) in human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) variants circulating in the Russian Federation

Full Text

Введение

ВИЧ-инфекция остаётся актуальной проблемой во всём мире. В результате широкого применения современной антиретровирусной терапии в настоящее время продолжительность жизни ВИЧ-инфицированных людей практически сопоставима со средней продолжительностью жизни в общей популяции [1]. Тем не менее методов полного излечения пока не существует, и лечение ВИЧ-инфекции предполагает ежедневный пожизненный приём комбинированных схем терапии, включающих в среднем 2–3 антиретровирусных препарата разных классов [2–4]. Проблемы лекарственной устойчивости ВИЧ, токсичности препаратов и становящийся всё более актуальным вопрос межлекарственных взаимодействий формируют постоянную необходимость в создании новых антиретровирусных препаратов.

Одной из основных характеристик ВИЧ является его чрезвычайное генетическое разнообразие, которое обеспечивается высокой скоростью возникновения мутаций и рекомбинацией и является результатом работы вирусного фермента – обратной транскриптазы, осуществляющей синтез ДНК на матрице вирусной РНК [5]. В мире существуют разнообразные субтипы и рекомбинантные формы ВИЧ, которые крайне неравномерно распределены по всему земному шару [6, 7]. Генетические различия между различными вариантами ВИЧ-1 определяются мутациями полиморфизма, понимаемыми как единичные замены с частотой встречаемости более 1% и не связанными с лечением [8]. Вопрос о возможном влиянии полиморфных мутаций и субтипа ВИЧ-1 на функциональные свойства вируса, в том числе на скорость возникновения и степень лекарственной устойчивости к антиретровирусной терапии, обсуждается уже много лет и до сих пор остаётся нерешённым [9–11].

Состав вариантов ВИЧ-1, циркулирующих в России, кардинально отличается от других стран. На протяжении многих лет доминирующим циркулирующим вариантом ВИЧ-1 является суб-субтип А6, а наиболее часто встречающимся не-А-вариантом – субтип В [12, 13]. Кроме того, на территорию России попал вариант вируса субтипа G, вызвав нозокомиальную вспышку ВИЧ-инфекции в нескольких городах юга России в 1988–1990 гг.; в настоящее время варианты ВИЧ-1 субтипа G выявляются крайне редко [14]. Как и во всём мире, в последнее время в России отмечается тенденция к появлению и распространению рекомбинантных форм вируса. Например, ранее выявляемая в Калининградской области рекомбинантная форма CRF_03AB в настоящее время доминирует в Вологодской области [15, 16]. Рекомбинантная форма CRF_02AG детектируется с небольшой частотой в различных регионах России [13, 17–19], при этом возникшая в результате рекомбинации между CRF_02AG и суб-субтипом А6 рекомбинантная форма CRF63_02A6 активно распространяется в Сибирском регионе [18, 20–22].

Проведённые ранее исследования гена pol [23, 24], области гена gag, кодирующей белок SP1 [25], области гена env, кодирующей белки gp 41 [26] и gp120 [27], а также генов, кодирующих некоторые неструктурные белки [28, 29], показали, что циркулирующие в России варианты ВИЧ-1 обладают рядом особенностей и определили характерные для них мутации полиморфизма. Некоторые из выявленных мутаций полиморфизма связаны с лекарственной устойчивостью ВИЧ [30–32] и изменением функциональных свойств вирусных белков [29].

Капсидный белок p24, играющий важную структурную и функциональную роль в жизненном цикле ВИЧ, является как объектом диагностических тестов, так и мишенью для разработки новых антиретровирусных препаратов и терапевтических вакцин [33–37]. Кроме формирования капсида, p24 активно участвует в различных этапах жизненного цикла вируса: обратной транскрипции ВИЧ, цитоплазматическом переносе посредством микротрубочек, декапсидации и ядерном импорте преинтеграционного комплекса вируса, интеграции вирусной ДНК в геном клетки-хозяина и сборке вириона, а также взаимодействует с несколькими факторами клетки-хозяина, которые могут как способствовать, так и предотвращать развитие вирусной инфекции [33, 34, 38].

Белок p24 (капсидный белок) кодируется участком гена gag. При экспрессии этого гена образуются два возможных варианта полипротеина: предшественник внутренних белков ВИЧ Pr55^Gag и общий предшественник внутренних белков и всех трёх ферментов – Gag-Pol в соотношении 20 : 1 (рис. 1); этот феномен объясняется рибосомным сдвигом рамки считывания. Pr55^Gag, имеющий молекулярную массу ~55 кДа, содержит четыре основных домена: матрикс (MA), капсид (CA), нуклеокапсид (NC) и p6 и два небольших спейсерных пептида SP1 и SP2. Gag-Pol с молекулярной массой 160 кДа содержит те же домены Gag, за исключением домена p6, вместо которого имеется межрамочный домен, известный как p6*, или p6pol. Кроме того, Gag-Pol включает домены протеазы (PR), обратной транскриптазы (RT) и интегразы (IN) [33, 34].

 

Рис. 1. Экспрессия гена gag: 5’ LTR и 3’ LTR – длинные концевые повторы в составе провирусной ДНК на 5’- и 3’-концах соответственно; gag – область гена gag; pol – область гена pol; env – область гена env; RNA – вирусная РНК на рибосоме; Gag-Pol – общий предшественник внутренних белков и трёх ферментов ВИЧ-1; Pr55^Gag – предшественник внутренних белков ВИЧ-1; MA – матрикс; CA – капсид; SP1 – спейсерный пептид 1; NC – нуклеокапсид; SP2 – спейсерный пептид 2; p6 – белок p6; p6pol – межрамочный домен p6pol; PR – протеаза; RT – обратная транскриптаза; IN – интеграза.

Fig. 1. Gag gene expression: 5’ LTR and 3’ LTR – long terminal repeats in proviral DNA at the 5’ and 3’ ends, respectively; gag – gag gene; pol – pol gene; env – env gene; RNA – viral RNA (ribonucleic acid) on the ribosome; Gag-Pol – common precursor for internal proteins and three HIV-1 enzymes; Pr55^Gag – precursor for HIV-1 internal proteins; MA – matrix; CA – capsid; SP1 – spacer peptide 1; NC – nucleocapsid; SP2 – spacer peptide 2; p6 – p6 protein; p6pol – p6pol trans-frame domain; PR – protease; RT – reverse transcriptase; IN – integrase.

 

Структура зрелого капсида имеет форму фуллеренового конуса, который состоит примерно из 1100 мономеров p24, собранных в гексамерной решётке. Каждая молекула p24 ВИЧ-1 состоит из двух доменов: N-концевого домена (NTD), состоящего из 146 аминокислот, и C-концевого домена (CTD), состоящего из 85 аминокислот (рис. 2). NTD состоит из N-концевой β-шпильки и 7 следующих за ней α-спиралей, в то время как CTD имеет 4 α-спирали и С-концевую неструктурированную область из 11 остатков. NTD и CTD соединены междоменной линкерной областью (остатки 146–150). CTD содержит высококонсервативный среди различных ретровирусов регион, состоящий из 20 аминокислот (АК), остатки 153–172, называющийся основной областью гомологии (MHR) [34, 39]. В NTD находится CypA-связывающая петля (85–93 АК), которая связывает клеточный белок циклофилин А [34], регулирующий инфекционность ВИЧ-1 [40]. Проведённые ранее исследования показали высокую консервативность капсида и вместе с тем уязвимость его функциональных свойств к возникающим мутациям [34, 39], а также определили мутации, способные повлиять на его функциональность [41].

 

Рис. 2. Вторичная структура p24: N-domain – N-концевой домен; C-domain – C-концевой домен; β-hairpin – N-концевая β-шпилька; H1 – H11 – α-спирали 1–11 соответственно; loop – CypA-связывающая петля; IDR – междоменная линкерная область; MHR – основная область гомологии.

Fig. 2. Secondary structure of p24: N-domain – N-terminal domain; C-domain – С-terminal domain; β-hairpin – N-terminal β-hairpin; H1 – H11 – α-helices 1–11 respectively; loop – CypA-binding loop; IDR – interdomain linker region; MHR – the major homology region.

 

Среди препаратов, применяемых для лечения ВИЧ-инфекции, до недавнего времени не было лекарств, имеющих мишенью внутренние белки вируса, однако недавно появился первый экспериментальный препарат класса ингибиторов капсида (p24) – ленакапавир, который одновременно воздействует на три стадии жизненного цикла ВИЧ: «раздевание» вириона после его проникновения в клетку, доставку преинтеграционного комплекса в ядро и правильное формирование капсида в ходе созревания. Планируется применение ленакапавира в составе инъекционной терапии пролонгированного действия с интервалом введения до 6 месяцев либо в схемах с пероральным применением с интервалом между приёмами до 7 суток [42].

В настоящее время ленакапавир проходит фазу II/III клинических испытаний [43]. На стадии доклинических испытаний в культуре клеток был определён перечень мутаций в белке p24, ассоциированных с лекарственной устойчивостью к препарату: L56I, M66I, Q67H, K70N, N74D, N74S и T107N [44, 45]. Анализ последовательностей ВИЧ-1 субтипа В, суб-субтипа А1, субтипа F1, субтипа D и рекомбинантной формы CRF02_AG, полученных из клинических образцов как наивных, так и ранее леченных ВИЧ-инфицированных пациентов, не выявил наличия мутаций лекарственной устойчивости к ленакапавиру [46]. Более позднее исследование вариабельности белка p24 во всех 4 группах ВИЧ-1 (M, N, O, P) и её возможного влияния на эффективность ленакапавира показало, что естественная резистентность ВИЧ к ленакапавиру на сегодняшний день маловероятна [34]. Вместе с тем детальный анализ генетических особенностей белка p24 у вариантов ВИЧ-1, циркулирующих в России, до сих пор не проводился.

Целью данной работы является исследование особенностей белка p24 у вариантов ВИЧ-1, циркулирующих на территории России (суб-субтипа А6, рекомбинантных форм CRF63_02A6, CRF_03AB, CRF02_AG и субтипа G):

– проведение филогенетического анализа фрагмента гена gag, кодирующего белок p24;

– анализ особенностей консенсусных последовательностей белка p24 для каждого варианта вируса;

– сравнение профиля естественных полиморфизмов p24 наиболее широко распространённого в России суб-субтипа А6 с наиболее изученным в мире субтипом В и с наиболее близким ему вариантом – суб-субтипом А1;

– анализ наличия мутаций лекарственной устойчивости к ленакапавиру.

Полученные данные помогут спрогнозировать эффективность применения ленакапавира в России, обозначат характерные особенности белка p24 у вариантов ВИЧ-1, циркулирующих в России, что может стать платформой для создания новых лекарственных препаратов в будущем.

Материалы и методы

Из международной базы данных Los Alamos (www.hiv.lanl.gov/content/index) были отобраны 962 нуклеотидные последовательности фрагмента гена gag, кодирующего белок p24, из них 200 – суб-субтипа А6, 180 – суб-субтипа А1, 229 – субтипа В, 200 – субтипа С, 73 – субтипа G, 22 – рекомбинантной формы CRF63_02A6, 7 – рекомбинантной формы CRF03_A6B, 51 – рекомбинантной формы CRF02_AG. Субтиповая принадлежность указанных последовательностей была дополнительно проверена с применением программы идентификации рекомбинантных форм RIP (RIP 3.0 submission form (lanl.gov)). Попарное и множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей было выполнено с помощью алгоритма программы MEGA v.10.2.2. Затем для всех отобранных последовательностей был проведён филогенетический анализ методом максимального правдоподобия (Maximum Likelihood, ML) c использованием программы IQ-TREE [47].

При проведении исследования особенностей консенсусных последовательностей белка p24 вариантов ВИЧ-1, циркулирующих в России (суб-субтипа А6, CRF63_02A6, CRF_03AB, CRF02_AG и субтипа G), проводили сравнение консенсусных последовательностей каждого варианта с референс-штаммом HXB2 (K03455), с консенсусной последовательностью субтипа В и между собой. Для каждого варианта вируса консенсусные последовательности были сформированы при помощи программного обеспечения Advanced Consensus Maker tool на сайте базы данных Los Alamos (https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/CONSENSUS/AdvCon.html) с последующей «ручной» проверкой собранных консенсусов и анализом с применением программы MEGA v.10.2.2.

Для проведения сравнения естественных полиморфизмов суб-субтипа А6 и субтипа В первоначально посредством программы MEGA v.10.2.2 выявляли естественные полиморфизмы обоих вариантов относительно референсного штамма HXB2; под полиморфизмами понимали мутации – единичные замены, встречающиеся в ≥ 1% наблюдений [8]. Далее с применением программного модуля Nonparametric Statistics из пакета Statistica 8.0 (StatSoft Inc., США) выявляли сайты со статистически достоверными различиями (p < 0,05 при использовании критерия χ²). В дальнейшем анализе для большей наглядности из выявленных позиций со статистически значимыми различиями учитывали только те, в которых частота полиморфизма одного из сравниваемых вариантов составляла 20% и более. Аналогично проводили сравнение естественных полиморфизмов между суб-субтипами А6 и А1.

При исследовании наличия мутаций лекарственной устойчивости к ленакапавиру у вариантов ВИЧ-1, циркулирующих в России, анализировали последовательности области гена gag, кодирующие белок p24, как загруженные из международной базы данных Los Alamos (суб-субтипа А6, рекомбинантных форм CRF63_02A6, CRF_03AB, CRF02_AG и субтипа G), так и полученные de novo из 30 клинических образцов наивных ВИЧ-инфицированных пациентов (табл. 1). Все пациенты наблюдались в ГКУЗ Московской области «Центр по профилактике и борьбе со СПИДом и инфекционными заболеваниями». Весь полученный клинический материал использовали с информированного добровольного согласия пациентов на основании одобрения Комитета по биомедицинской этике ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации (протокол № 16 от 08.02.2019). Забор клинических образцов осуществляли в 2019–2020 гг. Анализ мутаций лекарственной устойчивости проводили с применением программы MEGA v.10.2.2. на основе перечня мутаций, выявленных в экспериментах in vitro в культуре клеток: L56I, M66I, Q67H, K70N, N74P, N74S, T107S [44, 45].

 

Таблица 1. Эпидемиологические и демографические характеристики пациентов

Table 1. Epidemiological and demographic characteristics of patients

Показатель Characteristic	n
Общее число пациентов Total number of patients	30
Средний возраст, лет Average age, years	39
Пол/Gender: – мужской/male; – женский/female	18 12
Путь инфицирования/Route of infection: – гетеросексуальный/heterosexual; – мужчины, имеющие секс с мужчинами/MSM; – потребители инъекционных наркотиков/people who inject drugs	19 8 3
Генотипы ВИЧ-1/HIV-1 genotypes*: – A6; – B; – G	28 1 1

Примечание. *Субтип ВИЧ-1 был предварительно определён на основе анализа области гена pol.

Note. *The HIV-1 subtype was preliminarily determined based on the analysis of the pol gene region.

 

Выделение геномной ДНК, включающей интегрированную провирусную ДНК, из клеток крови ВИЧ-инфицированных пациентов проводили методом высаливания [48]. Получение ПЦР-продуктов (ПЦР – полимеразная цепная реакция) области гена gag, кодирующей белок p24, проводили методом гнездовой ПЦР при помощи подобранных праймеров: два внешних праймера – p24F1 (5’-CTCTATTGTGTACATCAACGGATAG-3’ 1042 → 1066) и p24R1_v1 (5’-CTAGGTGTCCTTCTTTGCCACAGTTG-3’ 1968 → 1993) и два внутренних – p24F2 (5’-GACACCAAGGAAGCTTTAG-3’ 1075 → 1093) и p24R2_v1 (5’-GTACTTGACTCATTGCCTCGG-3’ 1880 → 1900), после чего были получены и секвенированы 30 p24-ампликонов. Полученные последовательности анализировали, как описано выше.

Результаты

Анализ с применением программы RIP и последующий филогенетический анализ подтвердили субтиповую специфичность отобранных из международной базы Los Alamos нуклеотидных последовательностей.

В результате проведения филогенетического анализа было сформировано 6 кластеров: A1, A6, CRF02_AG + CRF63_02A6, G, B и C (рис. 3).

 

Рис. 3. Результаты филогенетического анализа фрагмента гена gag, кодирующего белок p24, методом максимального правдоподобия: А1 – кластер, сформированный нуклеотидными последовательностям ВИЧ-1 суб-субтипа А1; А6 – кластер, преимущественно сформированный нуклеотидными последовательностями ВИЧ-1 суб-субтипа А6; CRF_02AG+CRF63_02A6 – кластер, сформированный нуклеотидными последовательностями ВИЧ-1 рекомбинантных форм CRF_02AG и CRF63_02A6; CRF63_02A6 – подкластер, сформированный нуклеотидными последовательностями ВИЧ-1 рекомбинантной формы CRF63_02A6; G – кластер, сформированный нуклеотидными последовательностями ВИЧ-1 субтипа G; Ru – подкластер, сформированный нуклеотидными последовательностями ВИЧ-1 субтипа G, полученными в России; C – кластер, сформированный нуклеотидными последовательностями ВИЧ-1 субтипа C; B – кластер, сформированный нуклеотидными последовательностями ВИЧ-1 субтипа B.

Fig. 3. Maximum-likelihood phylogeny of the fragment of gene gag encoding the p24 protein; A1 – the cluster formed by the nucleotide sequences of sub-subtype A1 HIV-1; A6 – the cluster mainly formed by the nucleotide sequences of sub-subtype A6 HIV-1; CRF_02 AG + CRF63_02 A6 – the cluster formed by the nucleotide sequences of HIV-1 recombinant forms – CRF_02 AG and CRF63_02A6; CRF63_02A6 – the subcluster formed by nucleotide sequences of HIV-1 CRF63_02A6 recombinant form; G – the cluster formed by the nucleotide sequences of subtype G HIV-1; Ru – the subcluster formed by the nucleotide sequences of HIV-1 obtained from Russia; C – the cluster formed by the nucleotide sequences of subtype G HIV-1 subtype C; B – the cluster formed by the nucleotide sequences of subtype B HIV-1.

 

В кластер А6 вошли все последовательности суб-субтипа А6, две последовательности варианта CRF63_02A6 и все последовательности рекомбинантной формы CRF_03AB. В кластер CRF02_AG + CRF63_02A6 вошли все последовательности рекомбинантной формы CRF02_AG, при этом две из двух последовательностей, полученных от пациентов из России, сгруппировались в середине кластера CRF02_AG, а 20 из 22 нуклеотидных последовательностей CRF63_02A6 сформировали подкластер. Для двух последовательностей CRF63_02A6, сгруппировавшихся с субтипом А6, дополнительно из базы данных Los Alamos были загружены полногеномные последовательности и проанализированы с применением программы RIP. Результаты анализа подтвердили их принадлежность к рекомбинантной форме CRF63_02A6.

В кластере G 24 из 25 последовательностей, полученных от российских пациентов, сформировали подкластер. Принимая это во внимание, для формирования консенсуса субтипа G и последующего анализа мутаций лекарственной устойчивости к ленакапавиру были использованы только нуклеотидные последовательности, полученные от пациентов из России.

При анализе особенностей консенсусных последовательностей вариантов ВИЧ-1, циркулирующих в России, была определена 31 позиция АК, в которых анализируемые консенсусы отличались от референс-последовательности HXB2 (K03455) (табл. 2).

 

Таблица 2. Аминокислотные позиции в белке p24, в которых аминокислоты в консенсусных последовательностях вариантов ВИЧ 1, циркулирующих в России, отличались от аминокислот в референс-последовательности HXB2 (K03455), и аминокислоты в соответствующих позициях консенсусной последовательности субтипа В*

Table 2. Amino acid positions in p24, in which the amino acids of the consensus sequences of HIV-1 variants circulating in Russia differed from the amino acids in reference sequence HXB2 (K03455), and the amino acids in the corresponding positions of the consensus sequence of subtype B*

Регион	HXB2	A6	CRF63_02A6	CRF03_A6B	CRF02_AG	G	B
β-шпилька β-hairpin	I6	I6A	I6A	I6A	I6A	I6A	I6L
	V11	V11T	V11T	V11I	–	–	–
	A14	A14S	A14S	A14S	A14S	–	–
	I15	I15M	I15M	I15M	I15M	–	–
H1	V27	V27I	V27I	V27I	V27I	–	–
H2	S41	–	S41T	–	–	–	–
H3	T54	T54M	T54M	T54M	T54M	–	–
	T58	T58I	T58I	T58I	T58I	–	–
H4	E71	E71D	E71D	E71D	E71D	E71D	–
	T72	–	–	–	–	T72A	–
	V83	V83L	V83T	V83L	–	V83L	V83L
CypA-связывающая петля CypA binding loop	V86	V86A	–	V86A	–	V86P	–
	H87	H87Q	–	H87Q	–	H87Q	–
	I91	I91F	I91N	I91F	–	–	–
	A92	A92P	A92P	A92P	A92P	–	–
H6	G116	–	–	–	–	G116T	–
	N120	N120S	–	N120S	N120S	N120S	–
H7	E128	E128D	–	E128D	–	–	–
	I135	–	I135V	–	I135V	–	–
	L136	–	–	–	–	L136M	–
IDR	T148	T148V	T148V	T148V	T148V	T148V	–
MHR	R154	–	R154K	–	–	R154K/R	–
	Y169	Y169F	Y169F	Y169F	Y169F	Y169F	–
	S178	S178T	S178T	S178T	S178T	S178T	–
H9	E180	E180D	–	E180D	–	–	–
	N183	–	–	–	–	N183G	–
	E187	–	–	–	–	E187D	–
H10	T200	–	T200S	–	T200S	–	–
	K203	K203R	K203R	K203R	K203R	K203R	–
	A208	A208G	A208G	A208G	A208G	A208G	–
	G225	–	–	–	–	G225S	–

Примечание. *Прочерк – аминокислота соответствует аминокислоте в референс-последовательности HXB2 (K03455).

Note. *Dash means that the amino acid corresponds to amino acid in the reference sequence HXB2 (K03455).

 

Сравнение профилей естественных полиморфизмов суб-субтипа А6 и субтипа В показало, что 83 из 231 позиции АК в белке p24 у обоих вариантов вируса были полностью консервативны, т.е. не содержали АК замен относительно референс-штамма HXB2. Дополнительно только у суб-субтипа А6 полностью консервативными были 52 позиции АК, а только у субтипа В – 23, при этом было выявлено 29 мутаций со статистически значимыми различиями в частоте встречаемости в 24 позициях АК (табл. 3).

 

Таблица 3. Частота встречаемости мутаций (единичных замен) в белке p24 вариантов ВИЧ-1 суб-субтипов А6 и субтипа B, %

Table 3. Frequency of mutations (single substitutions) in p24 variants of sub-subtype A6 and subtype B HIV-1, %

Мутация Mutation	Частота встречаемости Frequency		Мутация Mutation	Частота встречаемости Frequency		Мутация Mutation	Частота встречаемости Frequency
	A6	B		A6	B		A6	B
I6A	99,5	0	T54M	95,5	0	T148V	88,5	20,1
I6L	0	76	T58I	96	0	R154K	17	28,4
V11T	38	0	E71D	99	2,2	Y169F	100	0
V11I	20	0,4	V83L	75	86,5	S178T	98	11,8
A14S	82	0,9	V86A	81,5	6,1	E180D	67	30,6
A14P	7	29,3	H87Q	100	24,9	K203R	89	0,4
I15M	64	2,6	I91F	82	0	P207S	26,5	0
I15L	6,5	27,9	I91V	1,5	24,5	A208G	97	21
V27I	100	28,8	A92P	97,5	6,1	G225S	13	22,7
S41T	31	18,3	N120S	80,5	24,5	–	–	–

 

Примечание. Мутациями считали замены в указанных позициях в сравнении с референс-штаммом HXB2. Жирным шрифтом выделены позиции, в которых замены у суб-субтипа А6 встречались более чем в 80%, при этом у субтипа В обнаружены не были.

Note. Mutations were defined as substitutions in the indicated positions in comparison with the reference strain HXB2. The positions in which substitutions in the A6 subtype were found in more than 80%, while absent in the subtype B, are shown in bold.

 

Сравнение профилей естественных полиморфизмов суб-субтипов А6 и А1 показало, что 93 из 231 позиции АК в белке p24 у обоих вариантов вируса были полностью консервативны. Дополнительно только у суб-субтипа А6 полностью консервативными были 39 позиции АК, а только у суб-субтипа А1 – 19, при этом было выявлено 29 мутаций со статистически значимыми различиями в частоте встречаемости в 25 позициях АК (табл. 4).

 

Таблица 4. Частота встречаемости мутаций (единичных замен) в белке p24 вариантов суб-субтипов А6 и А1 ВИЧ-1, %

Table 4. Frequency of mutations (single substitutions) in p24 variants sub-subtypes A6 and A1 HIV-1, %

Мутация Mutation	Частота встречаемости Frequency		Мутация Mutation	Частота встречаемости Frequency		Мутация Mutation	Частота встречаемости Frequency
	A6	A1		A6	A1		A6	A1
V11T	38	5	V83L	75	88,3	T148V	88,5	95,6
V11I	20	61,7	V86A	81,5	6,7	R154K	17	91,1
A14S	82	30,6	H87Q	100	25	S178T	98	85,6
A14N	0	26,1	I91F	82	2,2	E180D	67	26,1
I15M	64	7,8	A92P	97,5	81,1	N183G	0	66,1
I15L	6,5	71,1	L111P	0	76,7	T200S	8	80
V27I	100	94,4	I115L	0	21,7	K203R	89	79,4
A31G	5	26,1	N120S	80,5	48,9	P207T	2	36,7
S41T	31	3,9	N120G	5,5	39,4	G225S	13	26,7
T54M	95,5	83,3	E128D	77,5	89,4	–	–	–

Примечание. Мутациями считали замены в указанных позициях в сравнении с референс-штаммом HXB2. Жирным шрифтом выделены позиции, в которых замены у суб-субтипа А6 встречались в 4 и более раза чаще.

Note. Mutations were defined as substitutions in the indicated positions in comparison with the reference strain HXB2. The positions in which substitutions in the A6 subtype were found ≥4 times more often are shown in bold.

 

Анализ мутаций лекарственной устойчивости к ленакапавиру у вариантов ВИЧ-1, циркулирующих в России, в последовательностях, загруженных из базы данных Los Alamos, выявил 4 случая наличия мутаций лекарственной устойчивости T107S, из них три последовательности принадлежали субтипу G и одна – рекомбинантной форме CRF03_A6B. Кроме этого, две последовательности содержали альтернативные замены в значимой T107 позиции АК: замена T107V была обнаружена в последовательности рекомбинантной формы CRF02_AG и замена T107A – в последовательности вируса субтипа G.

При исследовании клинических образцов, полученных от ВИЧ-инфицированных пациентов, субтип-специфичность вирусов, указанная в табл. 1, подтверждалась анализом полученных нуклеотидных последовательностей области гена gag, кодирующих белок p24, с применением программы COMET-1 [49] и онлайн программы определения рекомбинантных форм RIP (RIP 3.0 submission form (lanl.gov)). Мутаций лекарственной устойчивости ВИЧ-1 к ленакапавиру в клинических образцах обнаружено не было.

Полученные нуклеотидные последовательности были депонированы в GenBank под регистрационными номерами OP726083 – OP726112.

Обсуждение

В экономически развитых странах Европы, США и Австралии, где генотипирование ВИЧ широко используется в рутинной практике, а в последнее время активно применяются и методы полногеномного секвенирования, наиболее распространён субтип В, поэтому именно он в настоящее время является наиболее широко изученным вариантом [6, 7]. Молекулярная эпидемиология ВИЧ-инфекции в России имеет уникальный характер, однако генотипирование ВИЧ-1 на настоящий момент не является обязательным [4] и проводится, как правило, только по гену pol, который кодирует основные белки-мишени антиретровирусной терапии. Полногеномное секвенирование в небольших масштабах могут себе позволить лишь единичные лаборатории в рамках выполнения научных проектов. Таким образом, фрагменты генома за пределами гена pol у вариантов ВИЧ, циркулирующих в России, остаются малоизученными. Вместе с тем в мире активно продолжается разработка новых антиретровирусных препаратов [33, 50, 51] и терапевтических вакцин [36, 37, 52, 53], нацеленных на альтернативные белки-мишени ВИЧ, в том числе на капсидный белок p24 [33, 36, 37]. Эта работа была посвящена изучению особенностей капсидного белка p24 у вариантов ВИЧ-1, циркулирующих на территории России.

В результате филогенетического анализа было сформировано 6 кластеров – A1, A6, CRF02_AG + CRF63_02A6, G, B и C (рис. 1), что свидетельствует о существующей гетерогенности фрагмента гена gag, кодирующего белок p24, между различными вариантами ВИЧ-1 и о наличии отличий у вариантов ВИЧ-1, циркулирующих в России (суб-субтипа А6, рекомбинантных форм CRF63_02A6, CRF_03AB, CRF02_AG и субтипа G), от наиболее изученного субтипа В.

Последовательности рекомбинантной формы CRF_03AB сгруппировались с последовательностями субтипа А6, так как CRF_03AB является продуктом рекомбинации суб-субтипа А6 и субтипа В и в области гена gag CRF_03AB соответствует суб-субтипу А6 [54].

Из 22 последовательностей рекомбинантной формы CRF63_02A6 20 сформировали общий кластер с последовательностями CRF02_AG, так как CRF63_02A6 являются продуктом рекомбинации CRF02_AG и субтипа А6 [55]. Тем не менее последовательности CRF63_02A6 сформировали отдельный подкластер в кластере CRF02_AG+CRF63_02A6, что свидетельствует о наличии некоторых особенностей в области гена gag, кодирующей белок p24, отличающих CRF63_02A6 от CRF02_AG.

В кластере G 24 из 25 последовательностей, полученных от пациентов из России, сформировали кладу. Дополнительный анализ данных литературы показал, что эти последовательности были получены от пациентов, инфицированных во время нозокомиальной вспышки в 1988–1990 гг. на юге России [14, 56].

В консенсусных последовательностях вариантов ВИЧ-1, циркулирующих на территории РФ, были обнаружены замены АК в 31-й позиции относительно референсной последовательности HXB2 и консенсусной последовательности субтипа В (табл. 2). При этом замены были выявлены практически во всех участках p24, за исключением H5, H8 и H11, что согласуется с данными о том, что наиболее консервативными структурами в группе M ВИЧ-1 являются области H5 и H8 [34]. Наибольшее число замен обнаружено в области CypA-связывающей петли, тогда как в регионе MHR были найдены замены только в двух сайтах – 154 и 169. В целом консенсусные последовательности белка p24 вариантов ВИЧ-1, циркулирующих на территории РФ, содержали как общие замены, так и отличия, количество и качество которых менялись в зависимости от варианта вируса, при этом каждый вариант вируса имел уникальный профиль замен.

При сравнении профилей полиморфизмов суб-субтипа А6 и субтипа В, суб-субтипов А6 и А1 были определены достоверные статистически значимые отличия, которые свидетельствуют о наличии индивидуальных особенностей в профиле полиморфизма суб-субтипа А6 и генетическом разнообразии белка p24 внутри субтипа А.

Отдельно следует отметить три мутации (V86A, H87Q, I91F), которые у суб-субтипа А6 выявлялись более чем в 80% случаев, и в 4 и более раза чаще, чем у субтипа В и суб-субтипа А1 (табл. 3 и 4), вследствие чего их можно обозначить в качестве характеристических замен для суб-субтипа А6. Мутации V86A, H87Q, I91F располагаются в области CypA-связывающей петли, которая отвечает за взаимодействие p24 с клеточным белком циклофилином А, предотвращающим ограничение репликации ВИЧ-1 путём блокировки клеточного фактора TRIM5α [34, 57]. При этом ранее было показано, что замена H87Q снижает эффективность связывания p24 с циклофилином А [41].

Также дополнительно необходимо выделить замену в 92-м положении – A92P, которая встречалась у суб-субтипов А6 и А1 в 97,5 и 81,1% случаев соответственно, в то время как у субтипа B – лишь в 6,1% случаев. Ранее было показано, что замена A92E влияет на репликацию вируса [41]. Хотя данных о значимости мутации A92P пока нет, эту замену следует отметить для дальнейшего изучения.

При исследовании наличия мутаций лекарственной устойчивости к ленакапавиру у вариантов ВИЧ, циркулирующих в России, в последовательностях, загруженных из базы данных Los Alamos, в одной из 7 последовательностей рекомбинантной формы CRF03_A6B и в трёх из 25 последовательностей субтипа G была обнаружена мутация T107S. Последовательности ВИЧ-1 субтипа G, согласно приложенным к ним описаниям, были получены от разных пациентов, хотя и инфицированных в результате одной нозокомиальной вспышки [56]. Наличие единичной мутации T107S не приводит к развитию лекарственной устойчивости к ленакапавиру, необходимо сочетание с мутацией Q67H [44], однако неизвестно, может ли под воздействием ленакапавира наличие T107S ускорить возникновение мутации Q67H. Кроме того, обращает на себя внимание выявление T107S у CRF03_AB в одной из 7 последовательностей (14,3%), а у субтипа G – в трёх из 25 (12%). Небольшая выборка последовательностей не позволяет определить частоту встречаемости T107S у этих вариантов ВИЧ-1, тем не менее полученный результат может поспособствовать дальнейшему исследованию распространённости мутаций лекарственной устойчивости к ленакапавиру у рекомбинантной формы CRF03_A6B и вариантов ВИЧ-1 субтипа G, циркулирующих на территории РФ.

В клинических образцах, полученных от пациентов, мутации лекарственной устойчивости к ленакапавиру обнаружены не были. В целом результаты анализа свидетельствуют о низкой вероятности предсуществования мутаций лекарственной устойчивости к ленакапавиру у вариантов ВИЧ-1, циркулирующих в России, что согласуется с общемировыми данными [34, 46].

Заключение

В результате проведённого исследования обозначены особенности белка p24 у вариантов ВИЧ-1, циркулирующих на территории России. Для наиболее широко распространённого в России суб-субтипа А6 определены характеристические замены и обозначены достоверные отличия естественных полиморфизмов от наиболее близкого ему суб-субтипа А1 и наиболее хорошо изученного субтипа В. Полученные данные смогут быть учтены при разработке антиретровирусных препаратов и терапевтических вакцин на основе белка p24 в будущем. Показано, что предсуществование мутаций лекарственной устойчивости к ленакапавиру у всех вариантов ВИЧ-1, циркулирующих на территории РФ, маловероятно. Прогноз применения ленакапавира в будущем в России в целом благоприятный.

 

Участие авторов: Кузнецова А.И. – методология, анализ и интерпретация полученных данных, подготовка и редактирование текста, разработка окончательного варианта; Мунчак Я.М. – проведение экспериментов, работа с базой данных Los Alamos; Лебедев А.В. – литературный поиск, анализ и интерпретация полученных данных; Туманов А.С. – проведение экспериментов; Ким К.В. – работа с базой данных Los Alamos, статистическая обработка; Антонова А.А. – литературный поиск, филогенетический анализ; Ожмегова Е.Н. – литературный поиск, филогенетический анализ; Пронин А.Ю. – сбор данных, редактирование текста; Дробышевская Е.В. – сбор данных, редактирование текста; Казеннова Е.В. – методология, разработка окончательного варианта; Бобкова М.Р. – разработка концепции, редактирование, разработка окончательного варианта.

Финансирование. Исследование выполнено за счёт гранта Российского научного фонда № 22-15-00117, https://rscf.ru/project/22-15-00117/.

Благодарности. Авторы выражают благодарность д.б.н., заведующему лабораторией молекулярной генетики ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России Прилипову Алексею Геннадьевичу за оказанную помощь в секвенировании провирусной ДНК ВИЧ-1.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Этическое утверждение. Исследование проводилось при добровольном информированном согласии пациентов. Протокол исследования одобрен комитетом по биомедицинской этике ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России (протокол № 16 от 08.02.2019 г. и № 20 от 17.03.2022 г.).

Contribution: Kuznetsova A.I. – methodology, data analysis and interpretation, text preparation and editing, final version development; Munchak Ia.M. – conducting of the experiments, working with Los Alamos database; Lebedev A.V. – thematic literature search, data analysis and interpretation; Tumanov A.S. – conducting of the experiments; Kim K.V. – working with Los Alamos database, statistical analysis; Antonova A.A. – thematic literature search, phylogenetic analysis; Ozhmegova E.N. – thematic literature search, phylogenetic analysis; Pronin A.Yu. – data collection, text editing; Drobyshevskaya E.V. – data collection, text editing; Kazennova E.V. – methodology, final version development; Bobkova M.R. – conceptualization, text editing, final version development

Funding. The research was carried out at the expense of the grant of the Russian Science Foundation No. 22-15-00117, https://rscf.ru/project/22-15-00117/.

Acknowledgement. The authors are grateful to Dr Sci. (Biol.), chief of the Laboratory of Molecular Genetics of D.I. Ivanovsky Institute of Virology of FSBI “National Reseach Center for Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya”, 123098, Moscow, Russia Alexey G. Prilipov for assistance in sequencing HIV-1 proviral DNA.

Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.

Ethics approval. The study was conducted with the informed consent of patients. The protocol of the study was approved by the Committee on Biomedical Ethics of the D.I. Ivanovsky Institute of Virology of FSBI «National Reseach Center for Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya», 123098, Moscow, Russia (Protocol No.16 of 02/08/2019 and No. 20 of 03/17/2022).

About the authors

A. I. Kuznetsova

D.I. Ivanovsky Institute of Virology of FSBI “National Reseach Center for Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya”

Author for correspondence.
Email: a-myznikova@list.ru
ORCID iD: 0000-0001-5299-3081

PhD, Leading Researcher, Laboratory of T-Lymphotropic Viruses

Россия, 123098, Moscow

I. M. Munchak

D.I. Ivanovsky Institute of Virology of FSBI “National Reseach Center for Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya”

Email: a-myznikova@list.ru
ORCID iD: 0000-0002-4792-8928

Junior Researcher, Laboratory of T-Lymphotropic Viruses, Ivanovsky Institute of Virology

Россия, 123098, Moscow

A. V. Lebedev

D.I. Ivanovsky Institute of Virology of FSBI “National Reseach Center for Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya”

Email: a-myznikova@list.ru
ORCID iD: 0000-0001-6787-9345

PhD, Researcher, Laboratory of T-Lymphotropic Viruses

Россия, 123098, Moscow

A. S. Tumanov

D.I. Ivanovsky Institute of Virology of FSBI “National Reseach Center for Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya”

Email: a-myznikova@list.ru
ORCID iD: 0000-0002-6221-5678

Researcher, Laboratory of T-Lymphotropic Viruses

Россия, 123098, Moscow

K. V. Kim

D.I. Ivanovsky Institute of Virology of FSBI “National Reseach Center for Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya”

Email: a-myznikova@list.ru
ORCID iD: 0000-0002-4150-2280

Junior Researcher, Laboratory of T-Lymphotropic Viruses

Россия, 123098, Moscow

A. A. Antonova

D.I. Ivanovsky Institute of Virology of FSBI “National Reseach Center for Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya”

Email: a-myznikova@list.ru
ORCID iD: 0000-0002-9180-9846

Researcher, Laboratory of T-Lymphotropic Viruses

Россия, 123098, Moscow

E. N. Ozhmegova

D.I. Ivanovsky Institute of Virology of FSBI “National Reseach Center for Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya”

Email: a-myznikova@list.ru
ORCID iD: 0000-0002-3110-0843

Researcher, Laboratory of T-Lymphotropic Viruses

Россия, 123098, Moscow

A. Yu. Pronin

Moscow Regional Center for the Prevention and Control of AIDS and Infectious Diseases

Email: a-myznikova@list.ru
ORCID iD: 0000-0001-6673-1218

PhD, Head Physician

Россия, 129110, Moscow

E. V. Drobyshevskaya

Moscow Regional Center for the Prevention and Control of AIDS and Infectious Diseases

Email: a-myznikova@list.ru
ORCID iD: 0000-0002-0654-8646

Deputy Head Physician

Россия, 129110, Moscow

E. V. Kazennova

D.I. Ivanovsky Institute of Virology of FSBI “National Reseach Center for Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya”

Email: a-myznikova@list.ru
ORCID iD: 0000-0002-7912-4270

Dr Sci, Leading Researcher, Laboratory of T-Lymphotropic Viruses

Россия, 123098, Moscow

M. R. Bobkova

D.I. Ivanovsky Institute of Virology of FSBI “National Reseach Center for Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya”

Email: a-myznikova@list.ru
ORCID iD: 0000-0001-5481-8957

Dr Sci, Chief Researcher, Chief of the Laboratory of T-Lymphotropic Viruses

Россия, 123098, Moscow

References

Supplementary files