The prospects for the use of drugs based on the phenomenon of RNA interference against HIV infection

Full Text

Введение

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ, HIV) является одной из наиболее актуальных проблем мирового здравоохранения на сегодняшний день. С момента регистрации первого случая в 1978 г. ВИЧ унёс жизни более 35 млн человек, а число инфицированных сегодня достигает 37 млн человек [1]. Возбудитель ВИЧ-инфекции принадлежит к семейству Retroviridae, роду Lentivirus и делится на два вида – ВИЧ-1 и ВИЧ-2 [2]. Особую клиническую значимость представляет ВИЧ-1, поскольку он распространён по всему миру, в то время как ВИЧ-2 менее патогенен и встречается в основном в районах Западной Африки [3]. При отсутствии высокоактивной антиретровирусной терапии ВИЧ-инфекция характеризуется неуклонным снижением количества CD4⁺ Т-лимфоцитов, однако её проявления способны затронуть центральную нервную, сердечно-сосудистую, пищеварительную, эндокринную и мочеполовую системы [4–9]. Помимо этого, у пациентов с выраженной иммуносупрессией особую опасность представляют осложнения, индуцированные представителями патогенной и условно-патогенной микрофлоры, которые могут привести к развитию сопутствующих бактериальных, грибковых и вирусных инфекций [10–12]. Также важно учитывать, что при сниженной активности иммунитета у ВИЧ-положительных пациентов повышается риск развития таких злокачественных новообразований, как аногенитальный рак, саркома Капоши, B- и T-клеточные лимфомы [13–15].

Долгое время лечение ВИЧ-инфицированных пациентов считалось затруднительным, поскольку при создании и применении терапевтических препаратов человечество столкнулось с проблемой развития побочных эффектов от этих лекарств и появления вирусной резистентности в результате склонности ВИЧ к высокой мутационной изменчивости [16]. Совокупность этих факторов негативно влияет на терапию ВИЧ-инфекции и сегодня.

В настоящее время для терапии ВИЧ-инфекции существует пять групп антиретровирусных препаратов [17, 18]. В контексте настоящего обзора особый интерес представляют специфические препараты, направленные на подавление репродукции ВИЧ на разных стадиях и разрешённые для клинического применения.

Антиретровирусные препараты, разрешённые для клинического применения

Нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (НИОТ) – препараты этого ряда, проникая в инфицированную клетку, конвертируются в соответствующие нуклеозид-3-фосфаты и, включаясь в растущую часть вирусной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), терминируют её, поскольку их структура построена таким образом, что дальнейшее удлинение цепи невозможно. В результате действия этих препаратов также конкурентно ингибируется активность обратной транскриптазы ВИЧ-1 и ВИЧ-2 [19]. Следует, однако, учитывать, что многие из препаратов этого класса обладают токсическими и побочными эффектами на организм человека. В отчете U.S. Food and Drug Administration приводятся данные о том, что применение ламивудина у ряда пациентов сопровождалось головной болью, тошнотой, кашлем и утомляемостью [20]. Также при его использовании у пациентов с почечной недостаточностью необходим тщательный подбор дозировки, а в некоторых случаях у ряда пациентов существует риск развития панкреатита [21, 22]. Тенофовир приводит к нефротоксическому эффекту, нарушению структуры костной ткани и повышению уровня липопротеинов низкой (ЛПНП) и высокой плотности [23–26]. Применение зидовудина также вызывает ряд побочных эффектов, таких как жировой гепатоз печени, лактоацидоз, анемия, нейтропения и миелосупрессия [27, 28]. Дополнительным недостатком препаратов этого ряда является то, что ВИЧ способен быстро приобретать к ним резистентность посредством избирательного ускользания обратной транскриптазы от включения аналогов нуклеотидов ДНК. Наиболее распространённые мутации в этой категории включают K65R, L74V, Q151M и M184V [29–31].

Ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (ННИОТ) являются неконкурентными ингибиторами фермента, которые связываются с аллостерическим центром обратной транскриптазы, влияющим на мобильность и гибкость центра полимеризации, приводя к резкому снижению эффективности обратной транскриптазы ВИЧ-1 [32]. Препараты ННИОТ также имеют ряд побочных эффектов. Эфавиренз способен вызвать повышение уровня трансаминаз в крови, гиперлипидемию, а также депрессивные состояния у пациентов, преимущественно чернокожих [33–35]. Использование рилпивирина, по данным C. Cohen и соавт., связано с нарушением сердечного ритма, возникновением психических и неврологических расстройств [36]. Резистентность к ННИОТ обусловлена нарушением связывания обратной транскриптазы с компонентом лекарственного препарата в результате стерического препятствия размещению ННИОТ в сайте связывания, утраты взаимодействия с аминокислотными остатками внутри сайта связывания и опосредованного уменьшения скорости связывания ННИОТ с ОТ [37–39].

Ингибиторы протеаз (ИП) ингибируют репродукцию ВИЧ, связываясь с активным центром фермента протеазы ВИЧ. Известно, что приём этих препаратов способен спровоцировать развитие сахарного диабета, повысить уровень ЛПНП крови. Помимо этого, существуют побочные эффекты со стороны пищеварительной системы: диарея, рвота, тошнота, боль в животе [40, 41].

Антагонисты хемокиновых рецепторов препятствуют связыванию вириона ВИЧ с клеткой человека путём ингибирования блокировки CCR5 корецептора, предотвращая связывание с ним вирусного белка gp120 и таким образом нарушая проникновение вируса в клетку [17]. Следует иметь в виду, что препарат не влияет на рецептор CXCR4, который также используется вирусом для входа в клетку. По данным клинических исследований, не отмечалось достоверной разницы между применением препарата маравирок и плацебо [42].

Исходя из этого, в настоящее время остро стоит вопрос формирования вирусной резистентности к противовирусным препаратам и возникновения нежелательных побочных эффектов. Для решения этих проблем необходимы принципиально новые антивирусные препараты. Одна из таких перспективных технологий создания специфических противовирусных препаратов основана на механизме РНК-интерференции (рибонуклеиновая кислота).

На сегодняшний день существуют несколько препаратов, используемых для терапии заболеваний инфекционного характера либо находящихся на стадии клинических испытаний. Были показаны многообещающие результаты при испытаниях таких препаратов, как ARC-520 (терапия вирусного гепатита В), Miravirsen (терапия вирусного гепатита С), ALN-RSV01 (терапия инфекции, вызванной респираторно-синцитиальным вирусом) [43–45]. Следует иметь в виду, что на стадии клинических испытаний также находится миРНК-препарат (малые интерферирующие (некодирующие) РНК), потенциально пригодный для терапии ВИЧ-инфекции – pHIV7-shITAR-CCR5RZ [45].

РНК-интерференция – один из регуляторных путей, при котором происходит снижение экспрессии гена-мишени в результате нокдауна целевой матричной РНК (мРНК). Также показано, что при РНК-интерференции мРНК двухцепочечная РНК (дцРНК), которая определяет комплементарный участок мишени мРНК, эффективнее, чем одноцепочечная РНК (оцРНК), и что для нокдауна генов достаточно лишь короткого фрагмента дцРНК. Механизм РНК-интерференции заключается в том, что белок-эндонуклеаза Dicer разрезает чужеродную дцРНК на отдельные двухцепочечные фрагменты длинной до 25 пар нуклеотидов, которые и являются миРНК. Затем происходит связывание миРНК с комплексом белков RISC (RNA-induced silencing complex) с последующим распознаванием и разрушением этой структурой мРНК-мишени [46].

Целью данного обзора является оценка перспективности создания и клинического применения препаратов на основе миРНК, направленных на подавление репродукции ВИЧ.

Разработка малых интерферирующих (некодирующих) РНК-препаратов

Стандартным подходом к разработке противовирусных средств на основе явления РНК-интерференции является подбор миРНК, действие которых направлено на вирусный геном [47]. Данный подход был успешно испытан в одной из ранних работ C.D. Novina и соавт. с использованием модельных штаммов ВИЧ-1 HIV_IIIb и R7-GFP [48] на клеточных культурах HeLa-CD4 и H9. Авторы подобрали специфичную миРНК p24-siRNA к гену gag, кодирующему экспрессию белка p24, проводили трансфекцию клеток HeLa-CD4 и через 24 ч заражали трансфицированные клетки HIV_IIIb. Через 48 ч после заражения авторами отмечалось четырёхкратное снижение белка по результатам проточной цитометрии. Кроме того, снижение количества мРНК белка p24 отмечалось при нозерн-блоттинге. По прошествии пяти суток вирусная репродукция оценивалась методом ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay – иммуноферментный анализ (ИФА)). В клетках, обработанных миРНК p24-siRNA, количество белка p24 снижалось в 25 раз, по сравнению с контрольными клетками. Полученные результаты были подтверждены повторно. C.D. Novina и соавт. также продемонстрировали снижение вирусной репродукции в клетках H9, в которые трансфицировали миРНК к GFP (green fluorescence protein). Далее авторы заражали эти клетки штаммом R7-GFP, в котором ген nef был заменён на ген GFP. Снижение экспрессии белка p24 и GFP прослеживалось в клетках H9 через два дня после трансфекции GFP-миРНК, а на пятые сутки экспрессия этих белков снизилась в 4 раза. C.D. Novina и соавт. утверждают, что векторные стратегии являются особо перспективными в вопросе терапии и профилактики ВИЧ-инфекции [48].

В исследовании G.A. Coburn и B.R. Cullen приводятся данные о блокировке экспрессии вирусных генов tat и rev в клеточной линии 293Т, а также о снижении репродукции ВИЧ-1 в культуре первичных Т-клеток человека. Для оценки влияния миРНК, специфичных к генам tat и rev, авторы трансфицировали клетки 293Т плазмидами pcTat и pcRev, кодирующими экспрессию указанных генов. Клетки также котрансфицировали одной из специфичных миРНК и в качестве неспецифического контроля – одноцепочечной антисмысловой нитью миРНК. По результатам вестерн-блота было показано выраженное снижение экспрессии белков tat и rev, по сравнению с неспецифическим контролем. В ряде повторов трансфекций было установлено небольшое (~20%) влияние специфичной для rev миРНК на экспрессию белка tat и специфичной для tat миРНК – на экспрессию rev. Далее авторы показывают результаты блокировки репродукции ВИЧ-1 с помощью миРНК в культуре клеток 293Т. Известно, что клеточная линия 293T не восприимчива в отношении к ВИЧ-1, однако при трансфекции плазмид, несущих гены, кодирующие экспрессию рецептора CD4 и корецептора CCR5, это возможно. Авторы выполнили трансфекцию провирусных плазмид pNL-ADA и pNL-luc-ADA в клетки 293Т. Вирус NL-ADA представляет собой способный к репродукции ВИЧ-1 из изолята NL4-3, у которого ген env был изменён на ген env, полученный из CCR5-тропного изолята ВИЧ-1 NL-ADA. ВИЧ-1 NL-luc-ADA имеет сходство с NL-ADA, за исключением того, что ген nef ВИЧ-1 заменён на ген-индикатор luc, что позволяет оценивать вирусную репродукцию по изменению уровня люциферазы. Далее авторами было показано, что миРНК, направленные к генам tat и rev, особенно в комбинации друг с другом, способны эффективно снижать экспрессию индикаторного гена luc в клетках 293Т, трансфицированных pNL-ADA и pNL-luc-ADA, по сравнению с контрольными антисмысловыми олигонуклеотидами РНК. Затем G.A. Coburn и B.R. Cullen проводили оценку способности миРНК к блокировке выхода вирионов ВИЧ-1 из инфицированных 293Т. Было показано, что две миРНК, действующие либо по отдельности, либо в комбинации, действительно были способны эффективно ингибировать продукцию потомства вирионов ВИЧ-1, по сравнению с неспецифическими контролями. В своём исследовании авторы показывают, что специфические миРНК способны эффективно ингибировать репродукцию ВИЧ-1 in vitro. Авторы считают, что потенциальная роль РНК-интерференции в противовирусной защите является вопросом, который заслуживает пристального внимания в будущем, а миРНК можно использовать для избирательной блокировки экспрессии вирусных генов человека [49].

В работе M. Hayafune и соавт. показано противовирусное действие четырёх миРНК (Е7145, Е74900, E7457, E7361), направленных к разным областям гена env ВИЧ-1. Для оценки эффективности нокдауна выбранного гена авторы трансфицировали в клетки COS провирусные экспрессионные плазмиды ВИЧ-1 (pNL4-3). Вирусную репродукцию в культуральной жидкости оценивали через 3 дня с помощью теста HIV-1 p24 CLEIA20 и сравнивали с заражённым нетрансфицированным контролем. Было показано, что каждая из четырёх миРНК ингибировала активность гена env. В клетках, трансфицированных миРНК Е7145, нацеленной на центральную область петли V3, и Е7490, нацеленной на сайт связывания CD4 консервативных областей gp120, экспрессия р24 снижалась на 2.2 и 2.5 lg₁₀ соответственно, по сравнению с вирусным контролем. При использовании миРНК E7457 отмечалось более выраженное снижение экспрессии р24, по сравнению с миРНК E7361, специфичной к межсубъединичной дисульфидной связи gp120. Далее M. Hayafune и соавт. оценили дозозависимый эффект при использовании миРНК. Для его оценки авторы выполнили трансфекцию этих же миРНК в культуру клеток COS с концентрациями от 0,02 до 0,5 мкг. Было показано, что наилучший результат продемонстрировали миРНК Е7145 и Е7490 при используемой концентрации 0,5 мкг. Для оценки противовирусного действия в инфицированных клетках авторы трансфицировали миРНК Е7145, Е7490, E7457 и E7361 в клетки HeLa-CD4⁺. После четырёхчасовой инкубации трансфицированные клетки заражались штаммом ВИЧ-1 NL4-3. Вирусную репродукцию оценивали на седьмые сутки с помощью теста HIV-1 p24 CLEIA. Каждая из миРНК, нацеленных на ген env, эффективно снижала репродукцию ВИЧ-1 NL4-3 более чем в 10 раз, по сравнению с вирусным контролем. M. Hayafune и соавт. утверждают, что применение явления РНК-интерференции с несколькими миРНК одновременно, нацеленными на различные области генов, специфичных для ВИЧ-1, способны преодолеть проблему появления лекарственно-устойчивых штаммов [50].

Для оценки закономерностей мутационной изменчивости ВИЧ-1 подтипа А и разработки подходов генной терапии с использованием РНК-интерференции в работе O.V. Kretova и соавт. проводилось сверхглубокое секвенирование участков генома ВИЧ-1, полученного из двух независимых групп пациентов из России. В своей работе авторы обнаружили шесть мишеней для миРНК, которые консервативны для 82–97% исследованных последовательностей и расположены внутри доменов, кодирующих ОТ (А1, А2), интегразу (А3), vpu (А4), gp120 (А5) и p17 (А6). Исходя из этого, O.V. Kretova и соавт. далее провели анализ на наличие идентичных мишеней в разных изолятах ВИЧ-1 подтипа А со всего мира с использованием программного обеспечения BLAST. Было установлено, что мишени, идентичные последовательности A1 – A3, A4 и A6, были обнаружены практически повсеместно. Идентичные последовательности обнаруживались в большинстве результатов: в 4956 последовательностях ВИЧ-1 (99%) для A6, 4837 последовательностях (96,7%) для A2 и 4651 последовательностях (93%) для A1. Мишень А3 не была так широко распространена и обнаруживалась в 1395 последовательностях (27,9%). Отмечалось широкое распространение мишени A2 в изолятах из США, Великобритании, Швейцарии и Германии. Мишень А6 характерна для изолятов из Кении, США, Великобритании, Швейцарии и Таиланда. Авторы делают вывод, что мишени, обнаруженные с помощью глубокого секвенирования примерно в 90% образцов ВИЧ-1 из России, также присутствуют во многих образцах ВИЧ-1 по всему миру. Полученные результаты, по мнению авторов, свидетельствуют, что обнаруженные консервативные области могут быть использованы в качестве мишеней для миРНК [51].

С целью оценки противовирусного эффекта миРНК, направленных к консервативным областям генов gp41, nef, tat и rev, R.S. Dave и соавт. синтезировали 9 молекул миРНК: 1tat, 2gp41, 3gp41/rev, 4gp41/rev, 5gp41, 6gp41, 7nef, 8nef и 9nef. миРНК 3gp41/rev и 4gp41/rev были комплексно направлены к двум генам одновременно. Чтобы оценить активность данных миРНК по отношению к ВИЧ-1 (штамм NL4-3), авторы трансфицировали клетки HeLaCD4 этими миРНК. Далее трансфицированные клетки заражали ВИЧ-1 NL4-3 при множественности заражения 0.1 и измеряли количество белка р24 в надосадочной жидкости заражённых клеток методом ELISA на первые, вторые и третьи сутки. Было показано, что в клетках, обработанных миРНК 1tat, 3gp41/rev, 6gp41, количество антигена р24 уменьшалось до 50%, по сравнению с вирусным и неспецифическим контролем. На вторые сутки каждая из девяти миРНК оказывала противовирусный эффект. Наиболее эффективное снижение р24 отмечалось в клетках, трансфицированных миРНК 5gp41, 6gp41 и 8nef в 31, 24 и 37% соответственно. Схожие результаты отмечались при использовании данных миРНК на третьи сутки. миРНК 5gp41, 6gp41 и 8nef продолжали оказывать противовирусное действие, снижая количество р24 на 20, 20 и 33% соответственно. Авторы отмечают, что уникальная динамика репродукции ВИЧ-1 в макрофагах и отсутствие цитопатического эффекта обеспечивают высокую выживаемость макрофагов после заражения, что превращает их в резервуар для вирусов [52]. Известно, что макрофаги представляют собой ключевую мишень ВИЧ-1 in vivo. Параллельно с этим утверждается, что они также являются основными мишенями ВИЧ-1 в нервной системе [53]. Исходя из этого, R.S. Dave и соавт. проводят оценку влияния миРНК 5gp41, 6gp41 и 8nef в макрофагах по отношению к нейротропному штамму ВИЧ-1 YU-2. Авторы трансфицировали первичные макрофаги человека указанными миРНК, а затем заражали ВИЧ-1 YU-2 при множественности заражения 0,1. После этого проводилась оценка количества вирусного белка р24 методом ELISA. Было показано, что ко вторым суткам отсутствовал выраженный противовирусный эффект, однако к девятым суткам снижение белка р24 достигало 46%, по сравнению с вирусным и неспецифическим контролем. В своём исследовании R.S. Dave и соавт. утверждают, что нерешённым остаётся вопрос эффективной доставки миРНК, специфичных по отношению к генам ВИЧ-1. Решение этой проблемы позволит разработать эффективные терапевтические средства на основе технологии РНК-интерференции [54].

В табл. 1 представлены вирусные гены-мишени, подавление которых приводило к эффективному снижению репродукции вируса ВИЧ, по данным независимых исследований.

 

Таблица 1. Вирусные гены, нокдаун которых приводил к значительному снижению репродукции ВИЧ

Table 1. Viral genes, knockdown of which led to a significant decrease in the reproduction of HIV

Название гена Gene name	Функция гена Gene function	Источник References
gag	Синтез белка – предшественника капсида p55, расщепляющегося на р24, р7, р13, р15, р17 Synthesis of p55 capsid precursor protein, which is cleaved into p24, p7, p13, p15, p17	C.D. Novina и соавт. [48], O.V. Kretova и соавт. [51], L.A. Wheeler и соавт. [60]
tat	Синтез белка р14, который усиливает опосредованную РНК-полимеразой II элонгацию интегрированной вирусной ДНК, стимулирует транскрипцию провирусной ДНК и транспорт РНК из ядра в цитоплазму клетки The synthesis of the p14 protein, which enhances the RNA polymerase II-mediated elongation of the integrated viral DNA, stimulates the transcription of proviral DNA and the transport of RNA from the nucleus to the cytoplasm of the cell	G.A. Coburn и B.R. Cullen [49], R.S. Dave и соавт. [54]
rev	Синтез регулятора экспрессии вирусных генов (р19), который ускоряет выход вирусных РНК из ядра в цитоплазму клетки и переключение синтеза регуляторных белков на синтез структурных протеинов Synthesis of a viral gene expression regulator (p19), which accelerates the release of viral RNA from the nucleus into the cell cytoplasm and switching the synthesis of regulatory proteins to the synthesis of structural proteins
env	Кодирует белок gp160, который расщепляется клеточной эндопротеазой фурином в эндоплазматическом ретикулуме на поверхностный гликопротеин gр120 и трансмембранный гликопротеин gр41 Encodes the gp160 protein, which is cleaved by the cellular endoprotease furin in the endoplasmic reticulum into the surface glycoprotein gp120 and the transmembrane glycoprotein gp41	M. Hayafune и соавт. [50], O.V. Kretova и соавт. [51], R.S. Dave и соавт. [54]
Pol	Кодирует ферменты: обратную транскриптазу и РНКазу (р66/51), интегразу (р32) и протеазу (р10) Encodes enzymes: reverse transcriptase and RNase (p66/51), integrase (p32) and protease (p10)	O.V. Kretova и соавт. [51]
vpu	Кодирует синтез вирусного белка U (р16), способствующего деградации CD4 и повышающего высвобождение вирионов из клетки Encodes the viral protein U (p16), which promotes the degradation of CD4 and increases the release of virions from the cell	–
nef	Синтез белкового эффектора (р27/25), усиливающего инфекционные свойства вирионов. Подавление экспрессии молекул CD4 и HLA на поверхности инфицированных клеток Synthesis of a protein effector (p27/25) that enhances the infectious properties of virions. Suppression of expression of CD4 and HLA molecules on the surface of infected cells	R.S. Dave и соавт. [54]
vif	Синтез вирусного инфекционного фактора (р23), способствующего репликации вируса Synthesis of a viral infectious factor (p23) that promotes virus replication	L.A. Wheeler и соавт. [60]

 

Учитывая высокую склонность ВИЧ к мутационной изменчивости, особый смысл имеет подавлять активность тех клеточных генов, чьи продукты экспрессии играют важную роль в вирусной репродукции [16]. Аналогичное мнение в отношении вируса гриппа, также обладающего высокой изменчивостью, высказывается в работе M. Lesch и соавт. [55].

Эффективность применения миРНК, направленных на снижение экспрессии генов, ответственных за экспрессию белков, необходимых для репродукции ВИЧ-1, исследовалась в работах по полногеномному миРНК-скринингу. В одной из ранних работ A.L. Brass и соавт. с использованием двухэтапного подхода в миРНК-скрининге обнаружили 273 клеточных факторов, которые необходимы для жизненного цикла ВИЧ-1. Из них было определено 36 клеточных факторов (13%), ранее участвовавших в патогенезе ВИЧ-1 на ранних стадиях, включая CD4, CXCR4, NMT1, Rab9p40, и компоненты путей трансактивации NF-κB и CREB. Авторы сообщают, что среди оставшихся 237 генов более 100 генов-мишеней, чей нокдаун также приводил к снижению вирусной репродукции. Далее отмечается, что анализ выявил ранее неизвестную роль ретроградных транспортных белков аппарата Гольджи (Rab6 и Vps53) в проникновении вируса, кариоферина (TNPO3) в вирусной интеграции и медиаторного комплекса (Med28) в вирусной транскрипции. Для скрининга мы использовали клетки TZM-bl (вариант HeLa), которые экспрессируют эндогенный CXCR4, трансгенный CD4 и CCR5, а также интегрированный Tat-зависимый репортерный ген β-галактозидазы (β-Gal). A.L. Brass и соавт. считают, что данные факторы могут быть использованы в качестве мишеней для РНК-интерференции [56].

Перспективность подхода, основанного на снижении экспрессии клеточных генов, важных для размножения ВИЧ-1 также подтверждается в исследовании M. Rodriguez и соавт. В своей работе авторы одними из первых проводили изучение фармакокинетики и эффективности интраназальной доставки комплекса полиэтиленимина и миРНК siBeclin1 (PEI-FITCsiRNA), специфичной по отношению к гену Beclin1, в мозг и лёгкие, а также её способность к снижению вирусной репродукции in vitro. В начале исследования авторы проводили оценку интраназальной доставки комплекса PEI-FITCsiRNA в мозг и лёгкие мышей с помощью тройной флуоресцентной визуализации с использованием меченной флуоресцеином изотиоцианатом (FITC) контрольной миРНК. Авторами были получены данные, свидетельствующие о том, что комплекс PEI-FITCsiRNA был успешно доставлен в астроциты, микроглию и нейроны головного мозга, а также обнаруживался в реснитчатых эпителиальных клетках лёгких. Далее M. Rodriguez и соавт. оценивали противовирусную активность миРНК siBeclin1 в клетках первичной микроглии ВИЧ-инфицированного человека с помощью ИФА. Для построения кривой титрования авторы трансфицировали миРНК siBeclin1 в концентрациях 4, 8 и 16 мкг. По результатам ИФА были получены данные, свидетельствующие о снижении вирусного титра на 50% при концентрации siBeclin1 4 мкг и на 75% при концентрации 16 мкг. Авторы считают, что данное исследование показывает эффективность интраназальной доставки siBeclin1 в качестве терапевтического средства ВИЧ-инфекции и её последствий [57].

В исследовании L.B.K. Sunnam и соавт. проводилась оценка репродукции ВИЧ-1 (штамм 93IN101) на клеточной модели SupT1 при подавлении активности гена TOP2B, ответственного за экспрессию белка топоизомеразы II бета (Topo IIβ), который играет важную роль в клеточной дифференцировке, регулируя экспрессию генов посредством ремоделирования хроматина [58]. L.B.K. Sunnam и соавт. проводили трансфекцию миРНК в равных концентрациях, специфичной к гену TOP2B, в одном случае с помощью наночастиц трансферрина (Tf-Tfr), а в другом – с помощью Lipofectamin 2000. Оценка вирусной репродукции проводилась на третьи сутки после трансфекции по результатам измерения оптической плотности. Авторами было установлено, что при использовании данной миРНК в концентрации 200 нг в комплексе с Tf-Tfr снижение репродукции ВИЧ-1, по сравнению с вирусным контролем, составило 94,2%. При использовании Lipofectamin 2000 и миРНК с той же концентрацией вирусная репродукция снизилась на 73%, по сравнению с тем же контролем. Авторы считают, что за счёт подавления образования белка Topo IIβ возможно найти решение проблемы в поиске подходящих мишеней для терапии ВИЧ-инфекции, а также предлагают оптимальный метод доставки миРНК к целевым генам [59].

Применение миРНК в качестве средства, обеспечивающего защиту, посредством одновременного нокдауна клеточных и вирусных генов, показано в работе L. Wheeler и соавт. Исследователи проводили оценку снижения вирусной активности in vitro и in vivo при использовании комплексов миРНК CCR5/CD45-CD4-AsiC, gag/vif-CD4-AsiC, направленных к клеточным генам CCR5, CD45 и вирусным gag и vif. Было установлено, что CCR5/CD45-CD4-AsiC стабильно подавляют экспрессию генов в течение 3 недель in vitro. Авторы трансфицировали указанный комплекс миРНК в клетки CD4⁺ PBMC (peripheral blood mononuclear cell – мононуклеарные клетки периферической крови), затем проводили оценку изменения экспрессии гена CCR5 с помощью проточной цитометрии в течение 5 недель. Снижение экспрессии до 75% наблюдалось в течение 3 недель, а далее постепенно нарастало, однако к концу пятой недели экспрессия была снижена до 25%, по сравнению с отрицательным контролем. После этого проводилась оценка подавления экспрессии генов-мишеней у гуманизированных мышей BLT путём двукратного интравагинального введения смеси CD4-AsiCs, несущей миРНК к генам CD45 и CCR5. Мышей забивали на 4-й, 8-й и 14-й день после трансфекции. Контрольных мышей забивали на 4-е сутки после введения фосфатно-солевого буфера (PBS) в качестве неспецифического контроля. Экспрессию CD45 и CCR5 в клетках CD4⁺ слизистой оболочки влагалища оценивали с помощью проточной цитометрии. Было установлено, что экспрессия указанных генов стабильно снижалась в течение 2 недель в клетках CD4⁺ у трансфицированных мышей, по сравнению с контрольной группой. Применение миРНК без средства доставки ввиду их низкой стабильности не имеет смысла для использования человеком. На фоне этого авторы проводят оценку нокдауна активности CD45 и CCR5 при формировании комплекса гидроксиэтилцеллюлозы (ГЭЦ) – CCR5/CD45-CD4-AsiC. L. Wheeler и соавт. установили, что в присутствии вагинальной жидкости комплекс ГЭЦ – CD4-AsiC сохранял свою стабильность, в то время как CCR5/CD45-CD4-AsiC в PBS подвергалась деградации. Чтобы оценить влияние комплекса ГЭЦ – CCR5/CD45-CD4-AsiC на экспрессию генов CD45 и CCR5, авторы проводили его трансфекцию в клетки эксплантатов шейки матки и спустя четверо суток оценивали активности генов CD45 и CCR5 методом проточной цитометрии. Было получено, что нокдаун CD45 и CCR5 был сходным у мышей, получавших CCR5/CD45-CD4-AsiC в PBS и в комплексе ГЭЦ – CCR5/CD45-CD4-AsiC. Далее авторами было показано, что интравагинальное введение комплексов миРНК CCR5/CD4-AsiC за 48 и 24 ч до заражения или gag/vif-CD4-AsiC за 24 ч до и через 4 ч после заражения приводило к блокировке вагинальной передаче ВИЧ. Было отмечено, что у мышей, получивших в качестве отрицательного контроля раствор фосфатно-солевого буфера, в течение 4 недель после заражения обнаруживался антиген p24 ВИЧ, тогда как у всех мышей, CCR5/CD45-CD4-AsiC или gag/vif-CD4-AsiC, не было признаков инфекции. Их количество CD4 оставалось нормальным, и ни у кого не было определяемого антигена p24 в плазме выше фона в течение 10 недель наблюдения. L. Wheeler и соавт. считают, что нокдаун вирусных генов gag/vif либо клеточных CCR5/CD45 обеспечивает надежную защиту от передачи ВИЧ-инфекции [60].

В табл. 2 представлен ряд клеточных генов, играющих важную роль в жизненном цикле коронавирусов, нокдаун которых приводил к снижению репродукции ВИЧ.

 

Таблица 2. Клеточные гены, нокдаун которых приводил к значительному снижению репродукции ВИЧ

Table 2. Cellular genes, knockdown of which led to a significant decrease in the reproduction of HIV

Название гена Gene name	Функция гена Gene function	Источник Reference
CD4	Выполняет роль корецептора αβTCR: связываясь с инвариантным β2-доменом MHC II класса, участвует в распознавании молекул процессированного антигена, представляемого АПК. Является рецептором для ВИЧ, связываясь через домен D1 с gp120 вируса Acts as an αβTCR co-receptor: by binding to the invariant β2-domain of MHC class II, it is involved in the recognition of molecules of processed antigen represented by APC. It is a receptor for HIV, binding through the D1 domain to viral protein gp120	A.L. Brass и соавт. [56]
CXCR4	Корецептор для ВИЧ Co-receptor for HIV
NMT1	Участвует в процессе N-миристоилирования, необходимого для полного проявления биологической активности нескольких N-миристоилированных белков, включая альфа- субъединицу белка, связывающего гуаниновые нуклеотиды, передающего сигнал. Participates in the process of N-myristoylation, which is necessary for the full manifestation of the biological activity of several N-myristoylated proteins, including the alpha subunit of the protein that binds guanine nucleotides and transmits a signal
Rab9p40	Облегчает транспорт маннозо-6-фосфатного рецептора (MPR) из эндосом в сеть транс-Гольджи Facilitates transport of the mannose-6-phosphate receptor (MPR) from endosomes to the trans-Golgi network
NF-κB	Ядерный фактор, усилитель каппа-легкой цепи активированных В-клеток, контролирующий транскрипцию ДНК, продукцию цитокинов и выживаемость клеток Nuclear factor, an enhancer of the kappa light chain of activated B cells that controls DNA transcription, cytokine production, and cell survival.
CREB	Клеточный фактор транскрипции Cellular transcription factor
Rab6	Регулировка мембранного транспорта Regulation of membrane transport
Vps53	Участие в ретроградном переносе пузырьков у аппарата Гольджи Participation in the retrograde transport of vesicles at the Golgi apparatus
TNPO3	Рецептор ядерного импорта для белков, богатых серином/аргинином (SR), включая фактор сплайсинга 1 Nuclear import receptor for serine/arginine (SR) rich proteins, including splicing factor 1
Med28	Репрессор дифференцировки гладкомышечных клеток Repressor of smooth muscle cell differentiation
Beclin1	Основной компонент комплекса PI3K, который обеспечивает образование фосфатидилинозитол-3-фосфата, являющегося инициатором апоптоза The main component of the PI3K complex, which provides the formation of phosphatidylinositol-3-phosphate, which is the initiator of apoptosis	M. Rodriguez и соавт. [57]
TOP2B	Ремоделирование хроматина Chromatin remodeling	L.B.K. Sunnam и соавт. [59]
CD45	Ген, кодирующий общий лейкоцитарный поверхностный белок CD45 Gene encoding common leukocyte surface protein CD45	L. Wheeler и соавт. [60]
CCR5	Корецептор для ВИЧ Co-receptor for HIV

Примечание. MHC (major histocompatibility complex) – главный комплекс гистосовместимости; АПК – антигенпредставляющие клетки; PI3K – фосфоинозитид-3-киназа.

Note. MHC, major histocompatibility complex; APC, antigen-presenting cells; PI3K, phosphoinositide-3-kinase.

About the authors

Evgenij A. Pashkov

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University); Federal State Budgetary Scientific Institution “I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera”

Author for correspondence.
Email: pashckov.j@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5682-4581

Junior Researcher of Federal State Budgetary Scientific Institution “I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera”

Россия, Moscow; Moscow

Anastasia V. Pak

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: pashckov.j@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-4295-7858
Россия, Moscow

Evgenij P. Pashkov

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: pashckov.j@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-4963-5053
Россия, Moscow

Anatoliy S. Bykov

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: pashckov.j@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-8099-6201
Россия, Moscow

Elena V. Budanova

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: pashckov.j@yandex.ru
Россия, Moscow

Alexander V. Poddubikov

Federal State Budgetary Scientific Institution “I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera”

Email: pashckov.j@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-8962-4765
Россия, Moscow

Oxana A. Svitich

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University); Federal State Budgetary Scientific Institution “I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera”

Email: pashckov.j@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1757-8389
Россия, Moscow; Moscow

Vitaly V. Zverev

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University); Federal State Budgetary Scientific Institution “I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera”

Email: pashckov.j@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-0017-1892
Россия, Moscow; Moscow

References

Supplementary files