Modulation of endothelial factors activity in human endothelial cells in influenza A(H1N1)pdm09 virus infection

Cover Page


Cite item

Full Text

Abstract

Introduction. Influenza A virus infection can lead to endothelial dysfunction (ED), including apoptosis of endothelial cells and modulation of endothelial factor activities. Affected biochemical factors may include those playing important roles in vascular homeostasis. However, the effect of this pathogen on the expression pattern of key endothelial factors is still unknown.

The aim of this work was to study the expression of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1, serpin E1) in the EA.hy926 endothelial cells. Research objectives: to assess expression of eNOS and PAI-1 in endothelial cells infected with influenza virus A(H1N1)pdm09, and to identify homologous fragments in structure of viral proteins and endothelial factors.

Material and methods. Cells were infected with influenza virus A/St. Petersburg/48/16 (H1N1)pdm09 and analyzed in dynamics in 6, 12, 18, 24, 48, and 72 hrs post infection (hpi). Detection of endothelial factors expression levels was performed by immunocytochemical method (ICC) using antibodies for eNOS and PAI-1 while quantitative assessment of expression levels was carried out by program Nis-Elements F3.2 («Nikon», Japan). The search for homologous sequences between viral proteins and eNOS and PAI-1 was performed by computer comparison. Sequences were analyzed as fragments 12 amino acid residues (aar) in length.

Results and discussion. eNOS expression in infected cells had decreased to 7.9% by 6 hpi (control was taken as 100%) to 3.3% at 72 hpi. PAI-1 expression varied significantly over the course of the experiment: by 6 hpi it had decreased to 49.6%, and to 43.2% by 12 hpi. Later PAI-1 levels were: 116.3% (18 hpi); 18.9% (24 hpi); 23.5% (48 hpi), and 35% (72 hpi).

Conclusion. These results indicate that influenza A infection of endothelial cells causes a significant decrease in eNOS expression, while modulating PAI-1 one. The described phenomenon can be used in the further development of directions of pathogenetic therapy of vascular complications of infection caused by this pathogen.

Full Text

Введение

В настоящее время установленной является способность вируса гриппа (ВГ) помимо избирательного воздействия на эпителий респираторного тракта поражать кровеносные сосуды и вызывать дисфункцию эндотелия (ДЭ). Это подтверждается соответствующей клинической картиной в виде носовых кровотечений, геморрагий в коже и слизистых оболочках, микрогематурии, развития острого респираторного дистресс-синдрома и диссеминированного внутрисосудистого свёртывания (ДВС-синдрома) [1][2]. При гриппе повышается также риск возникновения глубокого тромбоза вен и лёгочной эмболии [3], острого коронарного синдрома [4][5], ишемической болезни сердца [6], инфаркта миокарда [7–9] и других заболеваний кардиоваскулярной системы [10–14]. Кроме того, эпидемиологические наблюдения показали, что с окончанием эпидемии гриппа регистрируется существенная избыточная (дополнительная) смертность в группах риска у больных с хронической сердечно-сосудистой и лёгочной патологией – 870 на 100 тыс. переболевших (ВОЗ, 2008).

Однако механизмы развития при гриппозной инфекции ДЭ до сих пор неизвестны. Возникновение данного состояния связывают с нарушением таких процессов, как активация агрегации тромбоцитов, свёртывание крови, изменение проницаемости сосудистой стенки, сокращение и расслабление гладкой мускулатуры сосудов, пролиферация клеток сосудистого русла и воспалительная реакция. Все они регулируются целым рядом факторов, синтезируемых клетками эндотелия. Среди этих веществ одними из важнейших являются эндотелиальная синтаза оксида азота (eNOS), ингибитор активатора плазминогена 1 (PAI-1, или serpin E1), тканевой активатор плазминогена (tPA) и др.

Целью исследования явилось изучение характера экспрессии 2 эндотелиальных факторов – eNOS и PAI-1 при экспериментальной гриппозной инфекции в клетках эндотелия линии EA.hy926. Выбор этих соединений определён тем, что eNOS отвечает за продукцию оксида азота (NO), который имеет исключительно важное значение в поддержании гомеостаза на уровне эндотелия [15–18]. Уменьшение продукции NO, вызванное снижением экспрессии eNOS, рассматривается как следствие воспалительных процессов в кровеносных сосудах, атеросклероза, фиброза и нарушения тонуса стенки сосудов. PAI-1, являясь сериновой протеазой, синтезируемой преимущественно эндотелиальными клетками, в нормальных физиологических условиях контролирует активность урокиназного (uPA) и тканевого активаторов плазминогена, плазмина, матриксных металлопротеиназ (MMP), тем самым поддерживая тканевой гомеостаз [19]. Кроме того, он играет ключевую роль в патогенезе тромботических состояний, таких как глубокий венозный тромбоз и инфаркт миокарда [16]. Следует отметить, что исследования по изучению уровня экспрессии эндотелиальных факторов (eNOS и PAI-1) в эндотелиоцитах, инфицированных вирусом гриппа, ранее не проводились.

Материал и методы

Клеточная линия. В экспериментах использовали перевиваемую клеточную линию эндотелия человека EA.hy926, любезно предоставленную д-ром Корой-Джин Эджел (Dr. Cora-Jean Edgell) из отдела патологии Университета Северной Каролины (США). Данный материал представляет собой гибридную линию, полученную при слиянии клеток венозного эндотелия пупочного канатика человека (HUVEC) и клеток карциномы лёгкого человека (A549). Клетки культивировали в среде DMEM с глутамином («Биолот», Россия), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) («Биолот»). Для предотвращения бактериальной контаминации применяли антибиотики: стрептомицин и пенициллин («Биолот»). Исследования проводили с 3-дневной культурой эндотелиальных клеток EA.hy926, что соответствовало суточному монослою. Подсчёт клеточных элементов выполняли с помощью гемоцитометра открытого типа (камера Горяева). Посевная концентрация составляла 7,2–7,8 × 104 кл/мл.

Вирус. Использован ВГ А/Санкт-Петербург/48/16 (H1N1)pdm09, вызывавший вирусные геморрагические пневмонии в период эпидемии гриппа 2015–2016 гг. Вирус трижды пассировали на куриных эмбрионах, а затем определяли инфекционную активность (ИА) по ранее описанной методике [20]. Для исследуемого возбудителя значение ИА составляло 8–9 lg ЭИД50/мл (ЭИД – эмбриональная инфицирующая доза).

Инфекционная активность вируса гриппа. Определение ИА патогена в инфицированных клетках EA.hy926 осуществляли посредством детекции NP-антигена ВГ методом иммуноферментного анализа (ИФА), используя к данному антигену конъюгированные с пероксидазой хрена моноклональные антитела (АТ), полученные из отдела биотехнологии ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России.

С указанной целью суспензию клеток со стандартной посевной концентрацией разливали в 96-луночные планшеты («Nunc», Дания). Далее следовала инкубация в поддерживающей среде (DMEM) до образования клеточного монослоя. Через 1 сут клетки инфицировали 10-кратными разведениями вируса в данной среде, для чего в каждую лунку вносили по 150 мкл вируссодержащей жидкости. Контакт патогена с клетками поддерживали в течение 1 ч в СО2-инкубаторе при температуре 37 ºС. Для обеспечения многоцикловой репродукции ВГ в вируссодержащую жидкость добавляли обработанный TPCK (тозилфенилаланинхлорометилкетон) трипсин в концентрации 2 мкг/мл («Sigma», США). После инкубирования клеточные элементы отмывали от вируса и добавляли к ним по 100 мкл поддерживающей среды с трипсином. Через 5 сут поддерживающую среду удаляли и клетки фиксировали 80% холодным ацетоном в течение 20 мин при температуре −20 ºС. Затем лунки троекратно отмывали раствором фосфатно-солевого буфера (ФСБ) (рН 7,2–7,4). Далее в них добавляли 200 мкл 5% раствора обезжиренного молока («BioRad», США) и инкубировали в термостате при 37 ºС на протяжении 1 ч. На следующем этапе из всех лунок сливали раствор обезжиренного молока и добавляли по 100 мкл конъюгата (соотношение АТ 1 : 1000). Инкубацию проводили 45 мин при температуре 37 °С. После удаления конъюгата лунки трижды промывали ФСБ с твином 20. С помощью субстратной смеси проявляли пероксидазную реакцию, для чего в каждую лунку добавляли по 100 мкл субстрата. Реакцию останавливали путём внесения 2 Н серной кислоты (H2SO4), после чего измеряли оптическую плотность (ОП) при длине волны 450 нм. В качестве отрицательного контроля служили неинфицированные клетки EA.hy926.

Для определения гемагглютинирующей активности (ГА) вируса использовали реакцию гемагглютинации (РГА) с 0,5% взвесью куриных эритроцитов. С этой целью на 5 сут после инфицирования клеток отбирали по 50 мкл супернатанта и титровали в физиологическом растворе с добавлением 50 мкл указанной взвеси.

Определение экспрессии эндотелиальных факторов eNOS и PAI-1. Экспрессию эндотелиальных факторов определяли иммуноцитохимическим (ИЦХ) методом после инфицирования клеток ВГ согласно описанной методике [21]. Для этого в стерильные чашки Петри («Биолот») помещали предметные стёкла с поли-L-лизиновым адгезивным покрытием («ThermoFisher Scientific», США). На каждое стекло наносили 1 мл клеточной взвеси с заранее определённой необходимой посевной концентрацией; затем проводили инкубацию клеток в течение 1 ч в СО2-инкубаторе при температуре 37 ºС. После этого в чашки Петри добавляли поддерживающую среду DMEM с антибиотиками. Через 1 сут клетки отмывали и инфицировали вируссодержащей жидкостью. Контакт клеточных элементов с вирусом поддерживали в СО2 -инкубаторе при 37 ºС на протяжении 1 ч в питательной среде DMEM, содержащей антибиотики и трипсин (2 мкг/мл), без FBS. Множественность инфекции (МИ) (multiplicity of infection, m.o.i.) для ВГ А/Санкт-Петербург/48/16 (H1N1)pdm09 при заражении эндотелиоцитов была постоянной и составляла 0,01 ТЦД50/мл (ТЦД – тканевая цитопатическая доза).

При проведении фиксации использовали раствор 4% параформальдегида; экспозиция составляла 10 мин. Далее стёкла с клетками в течение 5 мин погружали в ФСБ, а затем промывали в дистиллированной воде. Инкубацию клеток с АТ к eNOS и PAI-1 («Abcam», Великобритания) в разведениях 1 : 1000 и 1 : 500 соответственно выполняли на протяжении 1 ч при комнатной температуре (22–24 ºС) во влажной камере. Детекцию уровня экспрессии эндотелиальных факторов осуществляли при помощи системы визуализации фирмы Novolink («Novocastra», США), включающей в себя реакцию с DAB-хромогеном (диаминобензидин). Интактные и инфицированные клетки велись и фиксировались параллельно.

С целью количественной оценки уровня экспрессии факторов эндотелия проводили морфометрические исследования, в ходе которых выполняли микрофотографирование препаратов, окрашенных иммуноцитохимически к соответствующим антигенам, на микроскопе Nikon Eclipse E20 («Nikon», Япония) с цифровой камерой Nikon DS-Fi1 и программным обеспечением Nis-Elements F3.2 («Nikon»). Были выбраны постоянные параметры: разрешение Fast (Focus) – 1280 × 960 пикселей; захват Quality (Capture) – 2560 × 1920 пикселей; экспозиция (Exposure) 15 мс (объектив ×40); усиление (Gain) 2,80×; улучшенное контрастирование (Contrast Enhanced); дополнительно (Advanced) – Hematoxylin [23]. Для каждого эндотелиального фактора эмпирически подбирали порог регистрации сигнала в RGB-модели (модель цветопередачи, где любой цвет кодируется с помощью 3 основных: красного (red), зелёного (green) и синего (blue)) с использованием синего фильтра. Предварительно выполняли калибровку объектива Nikon E Plan 40x/0,65 WD 0,65 с использованием объект-микрометра 1 мм/100 («Nikon»). Фотосъёмку клеток производили на 5 произвольно выбранных полях зрения при увеличении ×40. Поля зрения с артифициальными изменениями и дефектами окрашивания при фотосъёмке исключали. Морфометрическую обработку полученных снимков осуществляли в программе Nis-Elements BR 4.40 («Nikon») при постоянных настройках с использованием бинаризации по синему каналу в автоматическом режиме, с постоянными значениями величины порога [22].

В качестве 3 основных определяемых параметров были выбраны:

1) площадь заполнения – площадь с сигналом в поле зрения;

2) суммарная плотность – сумма отдельных величин ОП каждого пикселя в поле зрения; ОП высчитывается по формуле:

ОП= –lg ((значение интенсивности пикселя + 0,5)/максимальное значение интенсивности)  (1);

3) суммарная интенсивность – сумма интенсивности всех пикселей изучаемого объекта в поле зрения; интенсивность определяется в диапазоне регистрации сигнала между минимальными и максимальными значениями для каждого исследуемого фактора (диапазон регистрации для eNOS составлял 78–185, для PAI-1 – 92–191).

Мимикрия эндотелиальных факторов eNOS и PAI-1 в белках исследуемого вируса гриппа. Источником первичных последовательностей белков исследуемого ВГ (как структурных, так и неструктурных), молекул eNOS и PAI-1 служили общедоступные в сети Интернет базы полногеномных данных (соответственно www.ncbi.nlm.nih.gov и www.nextprot.org). Поиск гомологичных последовательностей в белковых структурах вируса и эндотелиальных факторов осуществляли путём компьютерного сравнения в них фрагментов длиной 12 а.о., принимая родственными те из них, которые проявляли идентичность по ≥ 8 позициям.

Статистическая обработка. Статистическую обработку данных проводили с применением параметрического теста Стьюдента или дисперсионного анализа (ANOVA) в программном обеспечении MS Office Excel 2016 и GraphPad Prism 8. Различия считали статистически значимыми для значений p < 0,05. В процессе представления полученных результатов использовали такие показатели описательной статистики, как среднеарифметическое значение и стандартное отклонение.

Результаты

Инфекционная активность вируса гриппа А. На рис. 1 представлены результаты детекции NP-антигена ВГ А в супернатанте клеток через 5 сут после инфицирования исследуемым возбудителем. Как видно из рисунка, минимальная концентрация этого антигена регистрируется в разведении 3,5 lg (по сравнению с клеточным контролем), что указывает на ИА вируса, равную 3–3,5 lg ТЦД50/мл. При этом ГА патогена в супернатанте спустя 5 сут после его внесения составляла 1 : 64.

Определение экспрессии эндотелиальных факторов. Экспрессию эндотелиальных факторов – eNOS и PAI-1 изучали в клетках, инфицированных ВГ, в динамике – через 6, 12, 18, 24, 48 и 72 ч. Уровни экспрессии этих веществ на протяжении всего исследования значительно изменялись по сравнению с таковыми в интактных эндотелиоцитах.

1) Определение экспрессии eNOS. На рис. 2 представлена экспрессия eNOS в неинфицированных клетках (контроль); на рис. 3–8 – результаты определения экспрессии этого же фактора в инфицированных вирусом эндотелиоцитах через временны́е промежутки 6, 12, 18, 24, 48 и 72 ч. Как можно видеть, степень экспрессии eNOS в поражённых ВГ клетках эндотелия резко снижена по сравнению с контрольным материалом.

С целью установления количественного значения выраженности экспрессии eNOS в инфицированных эндотелиоцитах определяли 3 основных параметра сигнала: площадь заполнения, суммарная плотность и суммарная интенсивность (см. раздел «Материал и методы») через 6, 12, 18, 24, 48 и 72 ч (табл. 1).

Таблица 1. Определение уровня экспрессии eNOS в инфицированных вирусом гриппа клетках эндотелия EA.hy926 (n = 15)
Table 1. Determination of eNOS expression level in EA.hy926 endothelial cells infected with influenza virus (n = 15)


Примечание. † – за 100% приняты параметры сигнала в неинфицированных клетках; * – р < 0,05.
Note. † – signal parameters from uninfected cells designated as 100%; * – p < 0.05.

Как видно из таблицы, характер изменений сигнала по 3 параметрам в интервале 6–72 ч совпадает. На основании этого для оценки выраженности экспрессии eNOS в процессе инфицирования клеток эндотелия ВГ выбран показатель суммарной интенсивности. Динамика изменения экспрессии eNOS по этому параметру представлена на рис. 9.

Так, экспрессия eNOS в инфицированных клетках снижалась до 7,9% уже через 6 ч (контроль принят за 100%). Через 12 ч уровень экспрессии этого фактора уменьшался до 12,1%, через 18 ч – до 5,4%, достигая спустя 24 ч своего минимума – 2,9%. Через 48 ч значение экспрессии eNOS составляло 3,1%, а спустя 72 ч – 3,3%. Таким образом, вирус гриппа А/Санкт-Петербург/48/16 (H1N1)pdm09 вызывал снижение экспрессии eNOS в клетках эндотелия человека (в ≥ 8 раз) на протяжении всего периода исследования.

2) Определение экспрессии PAI-1. Экспрессия PAI-1 в неинфицированных клетках (контроль) представлена на рис. 10. На рис. 11–16 показан характер экспрессии PAI-1 в инфицированных ВГ эндотелиоцитах через 6, 12, 18, 24, 48 и 72 ч.

Данные по основным параметрам сигнала в ходе оценки экспрессии PAI-1 приведены в табл. 2.

Таблица 2. Определение уровня экспрессии PAI-1 в инфицированных вирусом гриппа клетках эндотелия EA.hy926 (n = 15)
Table 2. Determination of PAI-1 expression level in EA.hy926 endothelial cells infected with influenza virus (n =15)


Примечание: † – за 100% приняты параметры сигнала в неинфицированных клетках; * – р < 0,05.
Note: † – signal parameters from uninfected cells designated as 100%; * – p < 0.05.

Как видно из таблицы, максимальные значения параметров сигналов в инфицированных ВГ эндотелиальных клетках зарегистрированы через 18 ч после внесения возбудителя, а минимальные – спустя 24 ч.

Аналогично определению экспрессии eNOS количественную оценку выраженности этого свойства для PAI-1 проводили по параметру суммарной интенсивности сигнала. Так, её значение в этом случае снижалось на протяжении первых 12 ч: через 6 ч экспрессия PAI-1 уменьшалась до 49,6% (контроль принят за 100%), а спустя 12 ч составляла уже 43,2%, после чего наблюдалось резкое повышение выраженности экспрессии уже через 18 ч после инфицирования клеток (116,7%). Наиболее значительное снижение зарегистрировано через 24 ч после внесения вируса – 18,9%. Указанные изменения сохранялись спустя 48 и 72 ч (23,5 и 35% соответственно) (рис. 17).

Таким образом, в эндотелиоцитах, инфицированных ВГ А/Санкт-Петербург/48/16 (H1N1)pdm09, экспрессия PAI-1 в значительной степени варьировала на протяжении всего исследуемого периода по сравнению с контролем клеток. Уровень её снижался в ≥2 раза в первые 12 ч после инфицирования клеток. Спустя 18 ч наблюдалось повышение степени экспрессии в 1,16 раза, после чего на всех последующих сроках исследования вновь определялось уменьшение данного показателя в 3–5 раз относительно контроля.

Мимикрия эндотелиальных факторов eNOS и PAI-1 в белках исследуемого вируса гриппа. Результаты поиска гомологичных аминокислотных последовательностей в белках исследуемых вирусов и системы гемостаза человека показали, что в структуре ряда вирусных белковых структур имеется множество последовательностей, мимикрирующих таковые эндотелиальных факторов (табл. 3).

Таблица 3. Детерминация гомологичных фрагментов в структуре белков вируса гриппа А/Санкт-Петербург/48/16 (H1N1)pdm09 и эндотелиальных факторов eNOS и PAI-1
Table 3. Fragment homology between the influenza A/St. Petersburg/48/16 (H1N1)pdm09 virus and the eNOS, PAI-1 endothelial factors


Примечание:
| – идентичные аминокислоты;
: – изофункциональные аминокислоты;
*– аминокислотная последовательность белка вируса гриппа (порядковые номера аминокислотных остатков);
** – аминокислотная последовательность эндотелиального фактора (порядковые номера аминокислотных остатков).
Note:
| – identical amino acids;
: – isofunctional amino acids;
*– amino acid sequence of an influenza virus protein fragment (ordinal numbers of amino acid residues);
** – amino acid sequence of a host immune system protein fragment (ordinal numbers of amino acid residues).

В частности, фрагменты аминокислотной последовательности, гомологичные eNOS, обнаружены в белках РВ2, НА, М1 и NEP (NS2) исследуемого ВГ. В этих же структурах, за исключением последней, обнаружены также фрагменты последовательности аминокислот, гомологичные PAI-1. Гомология данных участков, мимикрирующих эндотелиальные факторы, характеризуется высокой степенью сходства: из 12 сравниваемых аминокислотных остатков в каждом случае 7 гомологичны и по 2–4 – изофункциональны, т.е. гомологичность сравниваемых фрагментов превышает 80%.

Рис. 1. Детекция NP-антигена вируса гриппа А в супернатанте клеток EA.hy926 с помощью моноклональных антител иммуноферментным методом.
Fig. 1. Detection of influenza A virus NP antigen in supernatant of infected EA.hy926 cells using type-specific monoclonal antibodies by ELISA.

Рис. 2. Иммуноцитохимический анализ экспрессии eNOS в неинфицированных клетках эндотелия EA.hy926 (микрофотография; окрашивание DAB-хромогеном, длина линии 50 мкм, увеличение ×40).
Fig. 2. Immunocytochemical analysis of eNOS expression in uninfected EA.hy926 endothelial cells (microphotograph; DAB chromogen staining, the line size is 50 μm; magnification ×40).

Рис. 3. Иммуноцитохимический анализ экспрессии eNOS в клетках эндотелия EA.hy926 через 6 часов после инфицирования исследуемым вирусом (микрофотография; окрашивание DAB-хромогеном, длина линии 50 мкм, увеличение ×40).
Fig. 3. Immunocytochemical analysis of eNOS expression in infected EA.hy926 endothelial cells by the virus under study in 6 hours post infection (microphotograph; DAB chromogen staining, the line size is 50 μm; magnification ×40).

Рис. 4. Иммуноцитохимический анализ экспрессии eNOS в клетках эндотелия EA.hy926 через 12 часов после инфициро- вания исследуемым вирусом (микрофотография; окрашивание DAB-хромогеном, длина линии 50 мкм, увеличение ×40).
Fig. 4. Immunocytochemical analysis of eNOS expression in infected EA.hy926 endothelial cells by the virus under study in 12 hours post infection (microphotograph; DAB chromogen staining, the line size is 50 μm; magnification ×40).

Рис. 5. Иммуноцитохимический анализ экспрессии eNOS в клетках эндотелия EA.hy926 через 18 часов после инфицирования исследуемым вирусом (микрофотография; окрашивание DAB-хромогеном, длина линии 50 мкм, увеличение ×40).
Fig. 5. Immunocytochemical analysis of eNOS expression in infected EA.hy926 endothelial cells by the virus under study in 18 hours post infection (microphotograph; DAB chromogen staining, the line size is 50 μm; magnification ×40).

Рис. 6. Иммуноцитохимический анализ экспрессии eNOS в клетках эндотелия EA.hy926 через 24 часа после инфицирования исследуемым вирусом (микрофотография; окрашивание DAB-хромогеном, длина линии 50 мкм, увеличение ×40).
Fig. 6. Immunocytochemical analysis of eNOS expression in infected EA.hy926 endothelial cells by the virus under study in 24 hours post infection (microphotograph; DAB chromogen staining, the line size is 50 μm; magnification ×40).

Рис. 7. Иммуноцитохимический анализ экспрессии eNOS в клетках эндотелия EA.hy926 через 48 часов после инфициро- вания исследуемым вирусом (микрофотография; окрашивание DAB-хромогеном, длина линии 50 мкм, увеличение ×40).
Fig. 7. Immunocytochemical analysis of eNOS expression in infected EA.hy926 endothelial cells by the virus under study in 48 hours post infection (microphotograph; DAB chromogen staining, the line size is 50 μm; magnification ×40).

Рис. 8. Иммуноцитохимический анализ экспрессии eNOS в клетках эндотелия EA.hy926 через 72 часа после инфицирова- ния исследуемым вирусом (микрофотография; окрашивание DAB-хромогеном, длина линии 50 мкм, увеличение ×40).
Fig. 8. Immunocytochemical analysis of eNOS expression in infected EA.hy926 endothelial cells by the virus under study in 72 hours post infection (microphotograph; DAB chromogen staining, the line size is 50 μm; magnification ×40).

Рис. 9. Динамика изменения экспрессии eNOS в культуре клеток эндотелия EA.hy926 при их инфицировании клеток вирусом гриппа А/Санкт-Петербург/48/16 (H1N1)pdm09 (n = 15).
Примечание. * – р < 0,05.
Fig. 9. Dynamics of eNOS expression in EA.hy926 endothelial cells infected with influenza virus A/St. Petersburg/48/16 (H1N1)pdm09 over time (n = 15).
Note. * – p < 0.05.

Рис. 10. Иммуноцитохимический анализ экспрессии PAI-1 в неинфицированных клетках эндотелия EA.hy926 (микрофотография; окрашивание DAB-хромогеном, длина линии 50 мкм, увеличение ×40).
Fig. 10. Immunocytochemical analysis of PAI-1 expression in uninfected EA.hy926 endothelial cells (microphotograph; DAB chromogen staining, the line size is 50 μm; magnification ×40).

Рис. 11. Иммуноцитохимический анализ экспрессии PAI-1 в клетках эндотелия EA.hy926 через 6 часов после инфицирования исследуемым вирусом (микрофотография; окрашивание DAB-хромогеном, длина линии 50 мкм, увеличение ×40).
Fig. 11. Immunocytochemical analysis of PAI-1 expression in infected EA.hy926 endothelial cells by the virus under study in 6 hours post infection (microphotograph; DAB chromogen staining, the line size is 50 μm; magnification ×40).

Рис. 12. Иммуноцитохимический анализ экспрессии PAI-1 в клетках эндотелия EA.hy926 через 12 часов после инфицирования исследуемым вирусом (микрофотография; окрашивание DAB-хромогеном, длина линии 50 мкм, увеличение ×40).
Fig. 12. Immunocytochemical analysis of PAI-1 expression in infected EA.hy926 endothelial cells in 12 hours post infection (microphotograph; DAB chromogen staining, the line size is 50 μm; magnification ×40).

Рис. 13. Иммуноцитохимический анализ экспрессии PAI-1 в клетках эндотелия EA.hy926 через 18 часов после инфицирования исследуемым вирусом (микрофотография; окрашивание DAB-хромогеном, длина линии 50 мкм, увеличение ×40).
Fig.13. Immunocytochemical analysis of PAI-1 expression in infected EA.hy926 endothelial cells in 18 hours post infection (microphotograph; DAB chromogen staining, the line size is 50 μm; magnification ×40).

Рис. 14. Иммуноцитохимический анализ экспрессии PAI-1 в клетках эндотелия EA.hy926 через 24 часа после инфицирования исследуемым вирусом (микрофотография; окрашивание DAB-хромогеном, длина линии 50 мкм, увеличение ×40).
Fig. 14. Immunocytochemical analysis of PAI-1 expression in infected EA.hy926 endothelial cells in 24 hours post infection (microphotograph; DAB chromogen staining, the line size is 50 μm; magnification ×40).

Рис. 15. Иммуноцитохимический анализ экспрессии PAI-1 в клетках эндотелия EA.hy926 через 48 часов после инфицирования исследуемым вирусом (микрофотография; окрашивание DAB-хромогеном, длина линии 50 мкм, увеличение ×40).
Fig. 15. Immunocytochemical analysis of PAI-1 expression in infected EA.hy926 endothelial cells in 48 hours post infection (microphotograph; DAB chromogen staining, the line size is 50 μm; magnification ×40).

Рис. 16. Иммуноцитохимический анализ экспрессии PAI-1 в клетках эндотелия EA.hy926 через 72 часа после инфицирования исследуемым вирусом (микрофотография; окрашивание DAB-хромогеном, длина линии 50 мкм, увеличение ×40).
Fig. 16. Immunocytochemical analysis of PAI-1 expression in infected EA.hy926 endothelial cells in 72 hours post infection (microphotograph; DAB chromogen staining, the line size is 50 μm; magnification ×40).

Рис. 17. Уровень экспрессии PAI-1 в культуре клеток эндотелия EA.hy926 при их инфицировании вирусом А/Санкт-Петербург/48/16 (H1N1)pdm09 (n = 15).
Примечание. * – р < 0,05.
Fig. 17. Dynamics of eNOS expression in EA.hy926 endothelial cells infected with influenza A/St. Petersburg/48/16 (H1N1)pdm09 (n = 15).
Note. * – p < 0.05.

Обсуждение

ВГ поражает верхний отдел респираторного тракта, приводя обычно к самолимитирующей болезни с умеренными симптомами со стороны дыхательной системы. При тяжёлых формах гриппозной инфекции возбудитель может не только инфицировать клетки респираторных путей, но и вызывать острое поражение лёгких с развитием повышенной проницаемости лёгочных капилляров, а также сосудистый коллапс. Ухудшение клинического состояния пациентов связывают с ДЭ, ведущей к отёку лёгких, гипоксемии и дыхательной недостаточности [23][24].

Согласно современным представлениям ВГ А может способствовать возникновению ДЭ различными путями: 1) за счёт реорганизации цитоскелета, приводящей к продукции и последующему утолщению стресс-фибрилл. Эти нарушения обусловливают изменение морфологии клеток и повышают их проницаемость; 2) посредством синтеза микроРНК, индуцирующих сигнальные пути с вовлечением PKC (протеинкиназы С), Rho/ROCK, Ras/Raf/MEK/ERK, а также комплекса кальций–кальцимодулин (Ca2+/CaM), что дополнительно увеличивает проницаемость клеток, вызывая их дисфункцию; 3) запуском механизма цитокинового шторма, при котором наблюдается чрезмерная продукция и секреция фактора некроза опухоли альфа (ФНО-α). Резкое повышение содержания последнего ведёт к Rho-киназа-индуцированному образованию стресс-фибрилл и усиливает фосфорилирование лёгких цепей миозина, вследствие чего происходит блеббинг («вскипание мембран»); клетка приобретает округлую форму и подвергается апоптозу [25–27]. Наблюдаемая при цитокиновом шторме избыточная продукция ФНО-α, интерлейкинов 6 и 1β приводит также к повышению активности трипсина в эндотелиоцитах, что вызывает деградацию одного из белков плотных контактов (ZO-1, zonula occludens-1) и повышение проницаемости сосудистой стенки за счёт протеазного рецептора 2 (PAR-2) [28]. Совокупность указанных изменений, в свою очередь, обусловливает разрушение плотных межклеточных контактов и дальнейший рост сосудистой проницаемости; 4) модулированием экспрессии эндотелиальных факторов, таких как eNOS [23], tPA [29], PAI-1. Изменение степени экспрессии ряда факторов, синтезируемых клетками эндотелия, вносит существенный вклад в формирование ДЭ, приводя к возникновению сердечно-сосудистой патологии [24]; при этом непосредственная роль гриппозной инфекции в данном процессе остаётся до конца не выясненной. В настоящем исследовании изучена экспрессия 2 эндотелиальных факторов: eNOS и РАI-1. Экспрессия этих молекул определялась при инфицировании клеток эндотелия ЕА.hy926 исследуемым ВГ через 6, 12, 18, 24, 48 и 72 ч. Оказалось, что экспрессия eNOS в инфицированных вирусом эндотелиоцитах была резко снижена на протяжении всего исследуемого периода по сравнению с клеточным контролем. Выраженность её уменьшалась до 7,9% уже через 6 ч (контроль принят за 100%). Через 12 ч уровень суммарной экспрессии снижался до 12,1%, через 18 ч до 5,4% и спустя 24 ч достигал своего минимума – 2,9%. Через 48 ч степень экспрессии eNOS была равной 3,1%, а спустя 72 ч – 3,3%.

Экспрессия PAI-1 в инфицированных ВГ клетках эндотелия значительно варьировала. Так, через 6 ч показатель её интенсивности PAI-1 уменьшился до 49,6% (контроль – 100%), а спустя 12 ч составлял 43,2%, после чего наблюдалось резкое повышение экспрессии уже через 18 ч после внесения возбудителя – 116,7%. Наиболее выраженное снижение зарегистрировано через 24 ч после инфицирования (18,9%). Указанные изменения сохранялись спустя 48 и 72 ч: 23,5 и 35% соответственно.

Известно, что существенное уменьшение экспрессии eNOS в эндотелиоцитах ведёт к снижению синтеза NO и нарушению процессов регуляции релаксации и констрикции сосудистой стенки, что является одним из ведущих звеньев в патогенезе ДЭ кровеносных сосудов [15][30]. Один из механизмов снижения продукции NO – разобщение eNOS с субстратом, в качестве которого выступает L-аргинин. Это приводит к тому, что молекулы данного фактора, продолжая получать электроны от восстановленного никотин/ амиддинуклеотид-фосфата (NADPH), поставляют их другому субстрату – молекулярному кислороду (О2), в результате чего образуются высокоактивные формы кислорода (в частности, супероксиданион (O2−)) [31][32]. Свободные радикалы в дальнейшем могут вызывать окислительный стресс и усиливать проявления ДЭ. В то же время снижение биодоступности NO, вырабатываемого eNOS, может компенсироваться за счёт индуцибельной синтазы оксида азота (iNOS). Экспрессия данной изоформы NO-синтазы связана с провоспалительными цитокинами и увеличивается с активацией транскрипционного фактора NF-κB. Несмотря на данный адаптивный механизм, концентрация NO становится избыточной и возрастает с нано- до микромолярной. Избыток NO взаимодействует с O2−, в результате чего образуется пероксинитрит (ONOO−). В свою очередь, высокое содержание последнего коррелирует с гибелью эндотелиальных клеток посредством апоптоза [33–35] или некроза. NO-индуцируемое перекисное окисление липидов в данном случае может служить причиной серьёзного повреждения сосудистой стенки, ещё больше усугубляя ДЭ [36].

PAI-1 является основным ингибитором активаторов плазминогена: тканевого (tPA) и урокиназного (uPA) [37], а также участвует в регуляции фибринолитической системы. Первым двум веществам отводится важная роль в регуляции гемостаза при гриппе. Так, полученные в ходе исследования данные о модуляции экспрессии PAI-1 в целом коррелируют с имеющимися сведениями относительно изменения экспрессии tPA в инфицированных возбудителем гриппа эндотелиоцитах человека EA.hy926: экспрессия PAI-1 через 12 ч снижалась, а tPA – возрастала и наоборот, спустя 18 ч экспрессия tPA уменьшалась, а PAI-1 – повышалась [29]. Столь выраженные изменения степени экспрессии PAI 1 и tPA в клетках эндотелия подтверждают способность ВГ А(H1N1)pdm09 вызывать ДВС-синдром. Именно сочетанное взаимодействие эндотелиальных факторов PAI-1 и tPA (снижение концентрации одного с повышением содержания другого и наоборот) служит одним из ведущих патофизиологических механизмов развития этого синдрома, наблюдаемого при сепсисе и тяжёлых вирусных инфекциях [38].

Таким образом, инфицирование ВГ клеток эндотелия приводит к нарушению экспрессии эндотелиальных факторов и, следовательно, к поражению кровеносных сосудов. Одним из путей воздействия патогена на эндотелиоциты может быть молекулярная мимикрия вирусных белков и аминокислотных фрагментов молекул РАI-1 и eNOS. Сравнительный компьютерный анализ первичной последовательности РАI-1 и eNOS со структурами ВГ А/Санкт Петербург/48/16 (H1N1)pdm09 позволил выявить в ряде его белков (PB2, HA, M1, NEP (NS2)) фрагменты с высокой степенью гомологии. Можно предположить, что мимикрия вирусом факторов эндотелия может играть важную роль в дизрегуляции функций последнего, вызывая широкий спектр нарушений, связанных с проницаемостью клеточных мембран, развитием цитокинового шторма [28], изменениями процессов вазодилатации и вазоконстрикции. Гомологичные фрагменты могут высвобождаться из белковых структур вируса путём протеолиза клеточными протеазами либо вирусными же белками, обладающими подобной активностью.

Другой потенциальный механизм нарушения регуляции вирусными гомологичными фрагментами функций эндотелия может проявляться в индукции иммунного ответа к гомологичным фрагментам вирусных белков, в частности выработкой специфических АТ, способных также распознавать и, соответственно, блокировать содержащие их белковые структуры макроорганизма. Подтверждением возможности такого варианта патогенеза аутоиммунных реакций служат результаты вакцинации в период пандемии гриппа 2009–2010 гг. Проведение прививок вакциной Pandemrix («GlaxoSmithKline», Великобритания) имело следствием резкий рост частоты нарколепсии у детей и подростков в разных странах. Сопоставление характеристик разных вакцинных препаратов показало возможную связь возникновения этого заболевания с высоким содержанием в вакцине Pandemrix нуклеопротеина ВГ и образованием к нему АТ, перекрёстно реагировавших с рецептором гипокретина-2 (орексина-2). Оказалось, что рецептор гипокретина-2 имеет в своей внеклеточной петле мотив, присутствующий в составе вирусного нуклеопротеина [39].

Заключение

Таким образом, полученные данные указывают на способность ВГ А(H1N1)pdm09 влиять на экспрессию ряда факторов эндотелия – eNOS и РАI-1, тем самым способствуя формированию ДЭ, что является чрезвычайно важным условием развития кардиоваскулярной патологии. Описанный феномен может быть использован при дальнейшей разработке патогенетической терапии сосудистых осложнений инфекции, вызываемой данным возбудителем.

×

About the authors

V. A. Marchenko

FSBI «A.A. Smorodintsev Research Institute of Influenza» of the Ministry of Health of Russia

Author for correspondence.
Email: vmarcenco@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6870-3157

Vladimir A. Marchenko, Graduate Student, Research Assistant of Laboratory of Systemic Virology

197376, St. Petersburg

Россия

S. V. Barashkova

SPB SBIH «K.A. Rauhfus Children’s Municipal Multi-Specialty Clinical Center of High Medical Technologies»

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-5618-4510

191036, St. Petersburg

Россия

I. A. Zelinskaya

FSBI «Almazov National Medical Research Centre» of the Ministry of Health of Russia

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-1971-3444

197341, St. Petersburg

Россия

Ya. G. Toropova

FSBI «Almazov National Medical Research Centre» of the Ministry of Health of Russia

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-1629-7868

197341, St. Petersburg

Россия

E. S. Ramsay

FSBI «A.A. Smorodintsev Research Institute of Influenza» of the Ministry of Health of Russia

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-7086-5825

197376, St. Petersburg

Россия

I. N. Zhilinskaya

FSBI «A.A. Smorodintsev Research Institute of Influenza» of the Ministry of Health of Russia

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-0084-1323

197376, St. Petersburg

Россия

References

  1. Fukunaga S., Ishida C., Nakaoka A., Ito T. A case of acute kidney injury and disseminated intravascular coagulation associated with influenza B viral infection. CEN Case Rep. 2014; 4(1): 95–100. https://doi.org/10.1007/s13730-014-0147-9
  2. Watanabe T., Yoshikawa H., Abe Y., Yamazaki S., Uehara Y., Abe T. Renal involvement in children with influenza A virus infection. Pediatr. Nephrol. 2003; 18(6): 541–4. https://doi.org/10.1007/s00467- 003-1143-z 3. Smeeth L., Cook C., Thomas S., Hall A.J., Hubbard R., Vallance P. Risk of deep vein thrombosis and pulmonary embolism after acute infection in a community setting. Lancet. 2006; 367(9516): 1075–9. https://doi.org/10.1016/s0140-6736(06)68474-2
  3. Corrales-Medina V.F., Madjid M., Musher D.M. Role of acute infection in triggering acute coronary syndromes. Lancet Infect. Dis. 2010; 10(2): 83–92. https://doi.org/10.1016/s1473-3099(09)70331-7
  4. Drexler H. Nitric oxide and coronary endothelial dysfunction in humans. Cardiovasc. Res. 1999; 43(3): 572–9. https://doi.org/10.1016/ s0008-6363(99)00152-2
  5. Ludwig A., Lucero-Obusan C., Schirmer P., Winston C., Holodniy M. Acute cardiac injury events ≤30 days after laboratory-confirmed influenza virus infection among U.S. veterans, 2010–2012. BMC Cardiovasc. Disord. 2015; 15: 109. https://doi.org/10.1186/s12872- 015-0095-0
  6. Kwong J.C., Schwartz K.L., Campitelli M.A., Chung H., Crowcroft N.S., Karnauchow T., et al. Acute myocardial infarction after laboratory-confirmed influenza infection. N. Engl. J. Med. 2018; 378(4): 345–53. https://doi.org/10.1056/nejmoa1702090
  7. Barnes M., Heywood A.E., Mahimbo A., Rahman B., Newall A.T., Macintyre C.R. Acute myocardial infarction and influenza: a meta-analysis of case–control studies. Heart. 2015; 101(21): 1738–47. https://doi.org/10.1136/heartjnl-2015-307691
  8. Warren-Gash C., Smeeth L., Hayward A.C. Influenza as a trigger for acute myocardial infarction or death from cardiovascular disease: a systematic review. Lancet Infect. Dis. 2009; 9(10): 601–10. https://doi.org/10.1016/s1473-3099(09)70233-6
  9. Fagnoul D., Pasquier P., Bodson L., Ortiz J.A., Vincent J.L., De Backer D. Myocardial dysfunction during H1N1 influenza infection. J. Crit. Care. 2013; 28(4): 321–7. https://doi.org/10.1016/j. jcrc.2013.01.010
  10. Tseng G.S., Hsieh C.Y., Hsu C.T., Lin J.C., Chan J.S. Myopericarditis and exertional rhabdomyolysis following an influenza A (H3N2) infection. BMC Infect. Dis. 2013; 13: 283. https://doi. org/10.1186/1471-2334-13-283
  11. Lobo M.L., Taguchi ., Gaspar H.A., Ferranti J.F., de Carvalho W.B., Delgado A.F. Fulminant myocarditis associated with the H1N1 influenza virus: case report and literature review. Rev. Bras. Ter. Intensiva. 2014; 26(3): 321–6. https://doi.org/10.5935/0103-507x.20140046
  12. Lubrano V., Balzan S. Roles of LOX-1 in microvascular dysfunction. Microvasc. Res. 2016; 105: 132–140. https://doi.org/10.1016/j. mvr.2016.02.006
  13. Kwok C.S., Aslam S., Kontopantelis E., Myint P.K., Zaman M.J., Buchan I., et al. Influenza, influenza-like symptoms and their association with cardiovascular risks: a systematic review and meta-analysis of observational studies. Int. J. Clin. Pract. 2015; 69(9): 928–37. https://doi.org/10.1111/ijcp.12646
  14. Gliozzi M., Scicchitano M., Bosco F., Musolino V., Carresi C., Scarano F., et al. Modulation of nitric oxide synthases by oxidized LDLs: role in vascular inflammation and atherosclerosis development. Int. J. Mol. Sci. 2019; 20(13): 3294. https://doi.org/10.3390/ ijms20133294
  15. Sessa W.C. eNOS at a glance. J. Cell. Sci. 2004; 117(Pt. 12): 2427– 9. https://doi.org/10.1242/jcs.01165
  16. Naseem K.M. The role of nitric oxide in cardiovascular diseases. Mol. Aspects. Med. 2005; 26(1-2): 33–65. https://doi.org/10.1016/j. mam.2004.09.003
  17. Kubes P., Suzuki M., Granger D.N. Nitric oxide: an endogenous modulator of leukocyte adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991; 88(11): 4651–5. https://doi.org/10.1073/pnas.88.11.4651
  18. Ghosh A.K., Vaughan D.E. PAI-1 in tissue fibrosis. J. Cell. Physiol. 2012; 227(2): 493–507. https://doi.org/10.1002/jcp.22783
  19. Марченко В.А., Барашкова С.В., Зелинская И.А., Торопова Я.Г., Сорокин Е.В., Жилинская И.Н. Моделирование гриппозной инфекции у половозрелых крыс стока Wistar. Вопросы вирусологии. 2020; 65(3): 159–66. https://doi.org/10.36233/0507-4088- 2020-65-3-159-166
  20. Burry R.W. Immunocytochemistry: a Practical Guide for Biomedical Research. New York: Springer; 2010.
  21. Taylor C.R., Levenson R.M. Quantification of immunohistochemistry-issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment II. Histopathology. 2006; 49(4): 411–24. https://doi. org/10.1111/j.1365-2559.2006.02513.x
  22. Heiss C., Rodriguez-Mateos A., Kelm M. Central role of eNOS in the maintenance of endothelial homeostasis. Antioxid. Redox Signal. 2015; 22(14): 1230–42. https://doi.org/10.1089/ars.2014.6158
  23. Lobo S.M., Watanabe A.S.A., Salomão M.L.M., Queiroz F., Gandolfi J.V., de Oliveira N.E., et al. Excess mortality is associated with influenza A (H1N1) in patients with severe acute respiratory illness. J. Clin. Virol. 2019; 116: 62–8. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2019.05.003
  24. Petrache I., Birukov K., Zaiman A.L., Crow M.T., Deng H., Wadgaonkar R., et al. Caspase dependent cleavage of myosin light chain kinase (MLCK) is involved om TNF-alpha-mediated bovine pulmonary endothelial cell apoptosis. FASEB J. 2003; 17(3): 407–16. https://doi.org/10.1096/fj.02-0672com
  25. Petrache I., Crow M.T., Neuss M., Garcia J.G. Central involvement of Rho family GTPases in TNF-alpha mediated bovine pulmonary endothelial cell apoptosis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003; 306(1): 244–9. https://doi.org/10.1016/s0006-291x(03)00945-8
  26. Digard P., Elton D., Bishop K., Medcalf E., Weeds A., Pope B. Modulation of nuclear localization of the influenza virus nucleoprotein through interaction with actin filaments. J. Virol. 1999; 73(3): 2222–31. https://doi.org/10.1128/jvi.73.3.2222-2231.1999
  27. Wang S., Le T.Q., Kurihara N., Chida J., Cisse Y., Yano M., et al. Influenza virus-cytokine-protease cycle in the pathogenesis of vascular hyperpermeability in severe influenza. J. Infect. Dis. 2010; 202(7): 991–1001. https://doi.org/10.1086/656044
  28. Азарёнок А.А., Ляпина Л.А., Оберган Т.Ю., Харченко Е.П., Козлова Н.М., Жилинская И.Н. Изменение активности тканевого активатора плазминогена клеток эндотелия под воздействием вируса гриппа А и его поверхностных белков. Тромбоз, гемостаз, реология. 2014; (1): 3–8.
  29. Förstermann U., Sessa W.C. Nitric oxide synthases: regulation and function. Eur. Heart. J. 2012; 33(7): 829–37. https://doi. org/10.1093/eurheartj/ehr304
  30. Lubrano V., Balzan S. LOX-1 and ROS, inseparable factors in the process of endothelial damage. Free Radic. Res. 2014; 48(8): 841– 8. https://doi.org/10.3109/10715762.2014.929122
  31. Pirillo A., Norata G.D., Catapano A.L. LOX-1, OxLDL, and atherosclerosis. Mediators Inflamm. 2013; 2013: 152786. https://doi. org/10.1155/2013/152786
  32. Pritchard K.A. Jr., Ackerman A.W., Gross E.R., Stepp D.W., Shi Y., Fontana J.T., et al. Heat shock protein 90 mediates the balance of nitric oxide and superoxide anion from endothelial nitric-oxide synthase. J. Biol. Chem. 2001; 276(21): 17621–4. https://doi. org/10.1074/jbc.c100084200
  33. Moncada S., Palmer R.M., Higgs E.A. Nitric oxide: physiology, pathophysiology, pharmacology. Pharm. Rev. 1991; 43(2): 109–42.
  34. Ahmad R., Rasheed Z., Ahsan H. Biochemical and cellular toxicology of peroxynitrite: implications in cell death and autoimmune phenomenon. Immunopharmacol. Immunotoxicol. 2009; 31(3): 388–96. https://doi.org/10.1080/08923970802709197
  35. Natarajan M., Konopinski R., Krishnan M., Roman L., Bera A., Hongying Z., et al. Inhibitor-κB kinase attenuates Hsp90-dependent endothelial nitric oxide synthase function in vascular endothelial cells. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2015; 308(8): 673–83. https:// doi.org/10.1152/ajpcell.00367.2014
  36. Yasar Yildiz S., Kuru P., Toksoy Oner E., Agirbasli M. Functional stability of plasminogen activator inhibitor-1. Scientific World Journal. 2014; 2014: 858293. https://doi.org/10.1155/2014/858293
  37. Gando S., Levi M., Toh C. Disseminated intravascular coagulation. Nat. Rev. Dis. Primers. 2016; 2: 16037. https://doi.org/10.1038/ nrdp.2016.37
  38. Hallberg P., Smedje H., Eriksson N., Kohnke H., Daniilidou M., Öhman I., et al. Pandemrix-induced narcolepsy is associated with genes related to immunity and neuronal survival. EBioMedicine. 2019; 40: 595–604. https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2019.01.041

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download

Copyright (c) 2021 Marchenko V.A., Barashkova S.V., Zelinskaya I.A., Toropova Y.G., Ramsay E.S., Zhilinskaya I.N.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС77-77676 от 29.01.2020.


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies