In vitro activity of human recombinant alpha-2b interferon against SARS-CoV-2 virus

Cover Page


Cite item

Full Text

Abstract

Introduction. The pandemic spread of a new coronavirus infection, COVID-19, has caused a global emergency and attracted the attention of public health professionals and the population of all countries. A significant increase in the number of new cases of SARS-CoV-2 infection demonstrates the urgency of finding drugs effective against this pathogen.
The aim of this work was to evaluate the in vitro antiviral efficacy of human recombinant alpha-2b interferon (IFN-α2b) against SARS-CoV-2 virus.
Material and methods. The experiments had been carried out on Vero Cl008, the continuous line of African green monkey (Chlorocebus sabaeus) kidney cells. The effectiveness of the drugs was assessed by the suppression of viral reproduction in vitro. The biological activity was determined using titration of a virus-containing suspension in a Vero Cl008 cell culture by the formation of negative colonies.
Results. The antiviral efficacy of the IFN-α2b-based medications, which have a high safety profile and proven efficacy in the prevention and treatment of influenza and acute respiratory viral infections (ARVI), has been studied against the new pandemic SARS-CoV-2 virus in vitro experiments in Vero C1008 cell culture. IFN-α2b effectively inhibits the reproduction of the virus when applied both 24 hrs before and 2 hrs after infection. In the IFN-α2b concentration range 102–106 IU/ml a complete suppression of the reproduction of the SARS-CoV-2 virus had been demonstrated.
Discussion. IFN-α2b demonstrated in vitro high antiviral activity against SARS-CoV-2. In addition, the substance has a high chemotherapeutic index (>1000).
Conclusion. Medications for intranasal use based on IFN-α2b have high antiviral activity and are promising drugs for in vivo study in terms of prevention and treatment of COVID-19.

Full Text

Введение

Распространение новой коронавирусной инфекции COVID-19, достигшее согласно определению ВОЗ уровня пандемии, вошло в историю как чрезвычайная ситуация мирового масштаба и привлекло к себе внимание специалистов здравоохранения и населения во всех странах [1][2]. Значительный рост числа новых случаев инфицирования её возбудителем – вирусом SARS-CoV-2 демонстрирует актуальность поиска эффективных в отношении него лекарственных препаратов. Поиск новых терапевтических агентов для лечения вновь возникшего заболевания представляет собой долгий и дорогостоящий процесс с высокой частотой выбывания потенциальных кандидатов [3][4]. Неоправданная поспешность при разработке новых медикаментозных средств в условиях глобальной пандемии неприемлема. В связи с этим в нынешней ситуации, когда по объективным причинам современное медицинское сообщество не может предложить эффективный алгоритм профилактики и лечения COVID-19, который обладал бы достаточной доказательной базой, необходимо использовать комбинации противовирусных препаратов, ранее многократно доказавших свою безопасность и эффективность на штаммах возбудителей острых респираторных вирусных инфекций (ОРВИ), в том числе коронавирусов.

Особое внимание должно быть уделено интерферонам (ИФН) и их индукторам [5][6]. Показано, что атипичная пневмония, вызванная SARS-CoV-2, способна нарушать опосредованный ИФН сигнальный путь [7]. Японские учёные продемонстрировали, что протеин, экспрессируемый под контролем гена ORF3b нового коронавируса, сильнее подавляет синтез интерферонов I типа (ИФН-I), чем продукт более длинного одноимённого гена возбудителя атипичной пневмонии SARS-CoV. Кроме того, естественные вариации длины гена у этого инфекционного агента оказывают влияние на активность кодируемого белка [8]. Различие при этом незначительное, но статистически значимое. Исходя из представленных выше данных можно рассматривать использование данного класса веществ как безопасное и эффективное направление в лечении COVID-19 [9].

Таким образом, ИФН-I следует вводить как можно раньше, чтобы оптимизировать противовирусную терапию и избежать нежелательных явлений [10]. Кроме того, совокупность патологических проявлений новой коронавирусной инфекции, включающая главным образом (хотя и не только) лёгочные поражения, имеет сходные с интерферонопатиями характеристики. Можно предположить, что SARS-CoV-2 индуцирует чрезмерный ИФН-I-опосредованный противовирусный ответ, приводящий к повреждению тканей. Эта гипотеза подтверждается экспериментальными исследованиями [11] и клиническими данными, показывающими, что высокое содержание воспалительных биомаркёров ассоциировано с повышенной смертностью [12]. Отсюда также следует, что назначение ИФН-I должно быть ограничено ранними фазами инфекции. Более того, на её поздних стадиях возможно применение антиинтерфероновых препаратов для смягчения течения патологического процесса [13]. Кроме того, высказано предположение, что интерфероны эффективны только в случае отсутствия у пациентов сопутствующих заболеваний [14][15].

Целью настоящей работы явилась экспериментальное изучение противовирусной активности препаратов человеческого рекомбинантного интерферона альфа-2b (ИФН-α2b) in vitro в отношении коронавируса SARS-CoV-2.

Материал и методы

Вирус. В работе использовали вирус SARS-CoV-2 (вариант В), полученный из ФГБУ «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» (ГНЦ ВБ «Вектор») Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Роспотребнадзор) и хранившийся в Специализированной коллекции ФГБУ «48 Центральный научно-исследовательский институт» («48 ЦНИИ») Министерства обороны России.

Культура клеток и среды. Эксперименты выполняли на постоянной культуре клеток почки африканской зелёной мартышки (Chlorocebus sabaeus) – Vero Cl008, инфицированных вирусом SARS-CoV-2 (вариант В). Множественность инфицирования составила 0,0001 БОЕ/кл. В качестве ростовой и поддерживающей сред применяли среду Игла МЕМ на солевом растворе Хенкса, содержащую соответственно 7,5 и 2% фетальной телячьей сыворотки (ФТС).

Исследуемые препараты.

1. Человеческий рекомбинантный ИФН-α2b в форме капель назальных, серия 845, специфическая активность 105 МЕ/мл.

2. Человеческий рекомбинантный ИФН-α2b форте в форме спрея назального дозированного, серия ES4, специфическая активность 107 МЕ/мл.

3. Человеческий рекомбинантный ИФН-α2b, субстанция-раствор концентрированный (замороженный), серия I-05, специфическая активность 5 × 108 МЕ/мл.

Референс-препарат. Ребиф® – препарат ИФН бета-1а (ИФН-β1a), полученный методом генной инженерии с использованием культуры клеток яичника китайского хомячка (Cricetulus griseus), серия RBS403004C.

Использовали 2 схемы внесения препаратов: за 24 ч до инфицирования клеток и через 2 ч после него. По истечении срока инкубации проводили криодеструкцию клеток, пробы с одинаковой концентрацией препарата объединяли.

Биологическую активность возбудителя SARS-CoV-2 определяли по формированию негативных колоний в объединённой пробе титрованием вируссодержащей суспензии в клеточной культуре Vero Cl008 [16]. Оценку противовирусной эффективности препаратов проводили в соответствии с рекомендациями ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» (НЦЭСМП) Минздрава России [17].

Коэффициент ингибирования (КИ, %) рассчитывали по формуле:

где Аконтр – биологическая активность вируса, определённая в клетках без внесения химиопрепарата, БОЕ/мл (БОЕ – бляшкообразующая единица);
Аоп – аналогичный показатель, определённый в клетках c внесением химиопрепарата, БОЕ/мл.

Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с использованием программы Microsoft Office Excel 2007. Основными параметрами оценки эффективности препаратов in vitro считали снижение уровня накопления вируса (∆lg БОЕ/мл) и коэффициент ингибирования (КИ) его репродукции (%).

Результаты

Изучение противовирусной активности эффективности препаратов интерферона альфа-2b проводили в культуре клеток Vero Cl008, инфицированных вирусом SARS-CoV-2, вариант В, по показателю ингибирования репродукции вируса вируса. Схемы внесения препарата: за 24 ч и через 2 ч после. Культуру клеток инфицировали вирусом SARS-CoV-2, вариант В, в дозе 10 ЦПД50.

Полученные в ходе настоящего эксперимента результаты представлены в табл. 1 и 2.

Таблица 1. Оценка противовирусной активности препаратов интерферона альфа-2b в отношении вируса SARS-CoV-2 (вариант В) в культуре клеток Vero Cl008 при применении за 24 ч до инфицирования (n = 3)
Table 1. Evaluation of the antiviral activity of interferon alpha-2b against the SARS-CoV-2 virus (variant B) in a Vero Cl008 cell culture when used 24 hrs before infection (n = 3)


Примечание. БОЕ – бляшкообразующая единица.
Note. PFU is plaque forming unit.

Таблица 2. Оценка противовирусной активности препаратов интерферона альфа-2b в отношении вируса SARS-CoV-2 (вариант В) в культуре клеток Vero Cl008 при применении через 2 ч после инфицирования (n = 3)
Table 2. Evaluation of the antiviral activity of interferon alpha-2b against the SARS-CoV-2 virus (variant B) in the Vero Cl008 cell culture when used 2 hrs after infection (n = 3)


Примечание. БОЕ – бляшкообразующая единица.
Note. PFU is plaque forming unit.

При применении препаратов ИФН-α2b за 24 ч до инфицирования последние в широком диапазоне концентраций формируют антивирусное состояние клетки. В концентрациях 102–106 МЕ/мл вещества полностью подавляют репродукцию вируса SARSCoV-2 в клеточной культуре Vero Cl008. Коэффициент ингибирования составляет 100%.

Через 2 ч после инфицирования ИФН-α2b в концентрациях 102–106 МЕ/мл полностью подавляет репродукцию вируса SARS-CoV-2 в культуре Vero Cl008. Коэффициент ингибирования при этом также равен 100%. Эффективность исследуемого препарата сопоставима с таковой ИФН-β1a относительно указанного варианта возбудителя.

Обсуждение

Метод оценки эффективности лекарственных препаратов в отношении подавления репродукции вируса позволяет точно оценивать противовирусную активность того или иного вещества в опытах in vitro. Принцип такого подхода основан на способности вирусов размножаться в культуре клеток, а также на феномене ингибирования репродукции возбудителей при помощи эффективных неспецифических медицинских средств защиты (НМСЗ). Известно, что при увеличении множественности инфицирования степень подавления репродукции уменьшается, поэтому точность определения антивирусной активности препаратов является заниженной. Согласно данным литературы, оптимальная множественность инфицирования монослоя клеточной культуры при оценке противовирусной эффективности должна составлять от 0,0001 до 0,001 БОЕ/кл [18]. Высокоактивные средства при данной инфицирующей дозе, как правило, полностью подавляют репродукцию возбудителя, тогда как при более высоком значении этого параметра данный эффект может быть незначительным [19].

Результаты исследования показывают, что ИФН-α2b продемонстрировал in vitro высокую противовирусную активность в отношении SARS-CoV-2; кроме того, вещество обладает высоким химиотерапевтическим индексом (>1000). В предыдущих исследованиях показано, что белки ORF6 и ORF3B этого вируса усечены [9] и, возможно, утратили свои антиинтерфероновые функции. Это может объяснить проявляемую возбудителем значительную чувствительность к препаратам ИФН-α в условиях эксперимента. Репликация патогена подавляется интерферонами не полностью, тем не менее при этом вирусные титры снижаются на несколько порядков. Тот факт, что SARS-CoV-2 существенно более чувствителен к ИФН-I, чем SARS-CoV, предполагает, по крайней мере, равную эффективность его применения в случае наличия первого из них по сравнению со вторым. В пользу этой гипотезы свидетельствуют данные китайских учёных, установивших, что использование лекарственной формы в виде спрея на основе ИФН-α2b способно снизить уровень инфицирования SARS-CoV-2 [20].

Заключение

На основании полученных экспериментальных данных могут быть сделаны следующие выводы:

  1. Человеческий рекомбинантный ИФН-α2b полностью подавляет репродукцию вируса SARS-CoV-2 (вариант В) в культуре клеток Vero Cl008 при применении в концентрациях 102–106 МЕ/мл через 2 ч после инфицирования.
  2. Человеческий рекомбинантный ИФН-α2b полностью подавляет репродукцию SARS-CoV-2 (вариант В) в культуре клеток Vero Cl008 при внесении за 24 ч до инфицирования в тех же концентрациях.
  3. Препараты для интраназального назначения на основе ИФН-α2b обладают высокой противовирусной активностью и являются перспективными лекарственными средствами для изучения in vivo в плане профилактики и лечения новой коронавирусной инфекции COVID-19.
×

About the authors

S. Ya. Loginova

FSBI «Central Scientific Research Institute No. 48» of the Ministry of Defense of Russia

Email: 48cnii@mil.ru
ORCID iD: 0000-0001-6732-8404

141306, Sergiev Posad

Russian Federation

V. N. Shсhukina

FSBI «Central Scientific Research Institute No. 48» of the Ministry of Defense of Russia

Email: 48cnii@mil.ru
ORCID iD: 0000-0002-5461-3641

141306, Sergiev Posad

Russian Federation

S. V. Savenko

FSBI «Central Scientific Research Institute No. 48» of the Ministry of Defense of Russia

Email: 48cnii@mil.ru
ORCID iD: 0000-0002-5175-916X

141306, Sergiev Posad

Russian Federation

S. V. Borisevich

FSBI «Central Scientific Research Institute No. 48» of the Ministry of Defense of Russia

Author for correspondence.
Email: 48cnii@mil.ru
ORCID iD: 0000-0002-6742-3919

141306, Sergiev Posad

Russian Federation

References

  1. Никифоров В.В., Суранова Т.Г., Чернобровкина Т.Я., Янковская Я.Д., Бурова С.В. Новая коронавирусная инфекция (COVID-19): клинико-эпидемиологические аспекты. Архивъ внутренней медицины. 2020; 10(2): 87–93. https://doi.org/10.20514/2226-6704-2020-10-2-87-93.
  2. Li G., De Clercq E. Therapeutic options for the 2019 novel coronavirus (2019-nCoV). Nat. Rev. Drug Discov. 2020; 19(3): 149–50. https://doi.org/10.1038/d41573-020-00016-0.
  3. Lythgoe M.P., Rhodes C.J., Ghataorhe P., Attard M., Wharton J., et al. Why drugs fail in clinical trials in pulmonary arterial hypertension, and strategies to succeed in the future. Pharmacol. Ther. 2016; 164: 195–203. https://doi.org/10.1016/j.pharmthera.2016.04.012.
  4. Lythgoe M.P., Middleton P. Ongoing clinical trials for the management of the COVID-19 pandemic. Trends Pharmacol. Sci. 2020; 41(6): 363–82. https://doi.org/10.1016/j.tips.2020.03.006.
  5. Сологуб Т.В., Цветков В.В. Кагоцел в терапии гриппа и острых респираторных вирусных инфекций: анализ и систематизация данных по результатам доклинических и клинических исследований. Терапевтический архив. 2017; 89(8): 113–9. https://doi.org/10.17116/terarkh2017898113-119.
  6. Ершов Ф.И., Наровлянский А.Н. Теоретические и прикладные аспекты системы интерферонов: к 60-летию открытия интерферонов. Вопросы вирусологии. 2018; 63(1): 10–8. https://doi.org/10.18821/0507-4088-2018-63-1-10-18.
  7. Sallard E., Lescure F.X., Yazdanpanah Y., Mentre F., Peiffer-Smadja N. Type 1 interferons as a potential treatment against COVID-19. Antiviral Res. 2020; 178: 104791. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2020.104791.
  8. Kopecky-Bromberg S.A., Martinez-Sobrido L., Frieman M., Baric R.A., Palese P. Severe acute respiratory syndrome coronavirus open reading frame (ORF) 3b, ORF 6, and nucleocapsid proteins function as interferon antagonists. J. Virol. 2007; 81(2): 548–57. https://doi.org/10.1128/jvi.01782-06.
  9. Lokugamage K.G., Schindewolf C., Menachery V.D. SARSCoV-2 sensitive to type I interferon pretreatment. bioRxiv. 2020; 03.07.982264. Preprint. https://doi.org/10.1101/2020.03.07.982264 (accessed March 20, 2021).
  10. Channappanavar R., Fehr A.R., Zheng J., Wohlford-Lenane C., Abrahante J.E., Mack M., et al. IFN-I response timing relative to virus replication determines MERS coronavirus infection outcomes. J. Clin. Invest. 2019; 129(9): 3625–39. https://doi.org/10.1172/jci126363.
  11. Siddiqi H.K., Mehra M.R. COVID-19 illness in native and immunosuppressed states: a clinical-therapeutic staging proposal. J. Heart Lung Transplant. 2020; 39(5): 405–7. https://doi.org/10.1016/j.healun.2020.03.012.
  12. Zhou F., Yu T., Du R., Fan G., Liu Y., Liu Z., et al. Clinical course and risk factors for mortality of adult inpatients with COVID-19 in Wuhan, China: a retrospective cohort study. Lancet. 2020; 395(10229): 1054–62. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(20)30566-3.
  13. Zhang W., Zhao Y., Zhang F., Wang Q., Li T., Liu Z., et al. The use of anti-inflammatory drugs in the treatment of people with severe coronavirus disease 2019 (COVID-19): the perspectives of clinical immunologists from China. Clin. Immunol. 2020; 214: 108393. https://doi.org/10.1016/j.clim.2020.108393.
  14. Al-Tawfiq J.A., Momattin H., Dib J., Memish Z.A. Ribavirin and interferon therapy in patients infected with the Middle East respiratory syndrome coronavirus: an observational study. Int. J. Infect. Dis. 2014; 20: 42–6. https://doi.org/10.1016/j.ijid.2013.12.003.
  15. Shalhoub S., Farahat F., Al-Jiffri A., Simhairi R., Shamma O., Siddiqi N., et al. IFN-α2a or IFN-β1a in combination with ribavirin to treat Middle East respiratory syndrome coronavirus pneumonia: a retrospective study. J. Antimicrob. Chemother. 2015; 70(7): 2129–32. https://doi.org/10.1093/jac/dkv085.
  16. Сыромятникова С.И., Писцов М.Н., Борисевич С.В., Хамитов Р.А., Марков В.И., Максимов В.А. Состав агарового покрытия для титрования методом негативных колоний коронавируса – возбудителя тяжёлого острого респираторного синдрома. Патент РФ № 2325436; 2008. Приоритет изобретения от 27 ноября 2005 г.
  17. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Москва: Минздрав РФ; 2013.
  18. Лагуткин Н.А., Митин Н.И., Старовойтова В.А. Методические подходы к поиску антивирусных препаратов, их испытание и оценка. В кн.: Ложа В.П., Индулен М.К., Калныня В.А., Канель Н.А., ред. Вирусные ингибиторы и механизм их действия. Рига: Зинатне; 1977.
  19. Чижов Н.П., Ершов Ф.И., Индулен М.К. Основы экспериментальной химиотерапии вирусных инфекций. Рига: Зинатне; 1988.
  20. Shen K.L., Yang Y.H. Diagnosis and treatment of 2019 novel coronavirus infection in children: a pressing issue. World J. Pediatr. 2020; 16(3): 219–21. https://doi.org/10.1007/s12519-020-00344-6.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download

Copyright (c) 2021 Loginova S.Y., Shсhukina V.N., Savenko S.V., Borisevich S.V.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС77-77676 от 29.01.2020.


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies