Experience of application of IgY-technology for laboratory diagnostics of viral infections

Full Text

Введение

В 1893 г. F. Klemperer впервые экспериментально доказал, что иммунизация кур определённым антигеном (в данном случае – столбнячным токсином) приводит к переносу специфических антител в яичный желток [1]. В течение длительного времени это открытие не находило применения в биомедицинских исследованиях, однако этические проблемы экспериментов с лабораторными животными требовали поисков более гуманных подходов. В 1959 г. W. Russell и R. Burch опубликовали принципы гуманной экспериментальной техники [1], и в течение последующих лет многие исследователи пришли к пониманию важности открытия F. Klemperer. В 1996 г. Европейский центр по оценке альтернативных методов (ECVAM) рекомендовал использование антител класса Y (IgY) вместо антител класса G (IgG) млекопитающих как альтернативный подход к исследовательской практике [2], а в 1999 г. IgY-технология была одобрена, например, министерством ветеринарии правительства Швейцарии [1].

Молекулярная структура IgY птиц хорошо изучена и в целом аналогична структуре IgG млекопитающих (IgY птиц – филогенетический предшественник IgG млекопитающих): как и IgG, IgY состоит из двух лёгких и двух тяжёлых цепей. Тяжёлая цепь IgY представлена одним вариабельным и четырьмя константными доменами, в отличие от IgG, имеющего три константных домена. Молекулярная масса IgY определена в 167 200 Да (IgG – 160 000 Да) [1]. Несмотря на принципиальное сходство двух аналогов (IgG млекопитающих и IgY), IgY обладает рядом преимуществ, особенно ценных для его использования в диагностических целях (в качестве иммунного реагента): 1) высокая иммунореактивность птиц по отношению к чужеродным белкам инфекционного происхождения (вирусным, бактериальным, паразитарным), а также к белкам токсинов и ядов; 2) низкая перекрёстная реактивность с белками млекопитающих за счёт большой филогенетической дистанции между птицами и млекопитающими: неспособность IgY активировать систему комплемента млекопитающих и связываться с ревматоидным фактором, Fcрецепторами обеспечивает низкий уровень неспецифических реакций; 3) феноменально высокое содержание IgY в желтке, т. е. возможность получения IgY в препаративных количествах – из одного яйца можно получить 50–100 мг тотального IgY и до 10% от этой суммы – специфического IgY, что соответствует величине IgG, полученного из сыворотки 50–100 мышей (учитывая тот факт, что курица кладёт одно яйцо в 1–2 дня, общее количество IgY за полный цикл иммунизации может достигать десятков граммов); 4) дешевизна и лёгкость процедуры иммунизации кур, а также принципиальная простота получения препаратов IgY из желтка [1][2][3].

Целью данного исследования было экспериментальное доказательство эффективности использования IgY-технологии при разработке систем иммуноферментного анализа (ИФА) для лабораторной диагностики актуальных вирусных инфекций человека, вызываемых флавивирусами и энтеровирусами: определение антигенов вирусов клещевого энцефалита (ВКЭ), жёлтой лихорадки (ВЖЛ), трёх типов полиовируса. Такого рода исследования ранее не проводили [1].

Материал и методы

Получение препаратов IgY. Несущихся кур породы Леггорн (4–6-месячного возраста) иммунизировали 3 раза с интервалом в 2 нед, вводя по 1 мл соответствующего антигена в 4 точки пекторальных мышц без адъюванта [4].

Антигены. Антиген ВКЭ, штамм Софьин, депозит № 116, представлял собой инактивированный формалином концентрат вируссодержащей культуральной жидкости инфицированных куриных фибробластов с исходным титром вируса 8 lg БОЕ/мл; антиген ВЖЛ – инактивированный β-пропиолактоном концентрат культуральной жидкости клеток Vero, инфицированных ВЖЛ, штамм 17 D, с исходным титром 6,5 lg БОЕ/мл; антигены полиовируса: вируссодержащие осветлённые культуральные жидкости клеток RD, инфицированные «дикими» полиовирусами типа 1 (Mahoney), либо типа 2 (MEF-1), либо типа 3 (Saukett) с титром 8,0 lg ТЦД/1 мл. Отложенные яйца маркировали и хранили при температуре +4 °С, либо выделяли желтки и хранили при -20 °С. Препараты IgY (из желтков, выделенных через 2 нед после 3-й иммунизации) получали высаливанием сульфатом натрия (Na₂ SO₄ ) по методу E.M. Akita и S. Nakai [5] с последующей очисткой на аффинной колонке HiTrap (GE Healthcare, Швеция), согласно инструкции производителя. Концентрацию тотального IgY определяли при 280 нм. Специфическую активность полученных препаратов IgY определяли: для ВКЭ – собственным вариантом ИФА с использованием в качестве иммуносорбента очищенного белка E ВКЭ [4]; для полиовирусов – в реакции микронейтрализации против стандартных препаратов «диких» полиовирусов типов 1, 2, 3 (препараты получены из Национального института биологических стандартов и контроля – NIBSC, Великобритания) на культуре клеток HEp-2, согласно протоколу ВОЗ [6]; для ВЖЛ – методом редукции числа бляшек [7]. Препараты IgY стерилизовали фильтрацией через фильтры с диаметром пор 0,45 мкм, хранили при -20 °С в присутствии 50% глицерина и использовали в ИФА в качестве иммуносорбента для определения антигенов соответствующих вирусов, а также метили биотином (IgY против полиовируса типов 1, 2, 3 и против ВЖЛ) и использовали в системах ИФА для определения соответствующих антигенов (IgY → исследуемый антиген → IgY + биотин → стрептавидин-пероксидазный конъюгат).

Биотинилирование IgY проводили, согласно методике, изложенной в руководстве E. Harlow и D. Lane [8]. Препараты IgY + биотин хранили при -20 °С в присутствии 50% глицерина.

Система ИФА для титрования препаратов IgY против ВКЭ. Титрование проводили по собственной методике, изложенной нами ранее [4]. Иммунопанели сенсибилизировали очищенным антигеном ВКЭ в концентрации белка Е 10 мкг мл (предоставлен М.Ф. Воровичем, ФГБНУ «ФНЦИРИП им. М.П. Чумакова РАН», Москва), после блокирования свободных сайтов вносили анализируемый IgY в разведениях, начиная с 1 : 4, и параллельно – IgY, выделенный из преиммунного желтка (контроль), инкубировали, вносили коммерческий пероксидазный конъюгат против IgY курицы, инкубировали и затем вносили субстрат (ТМВ).

Система ИФА для определения антигенов ВКЭ, полиовируса типов 1, 2, 3 и ВЖЛ с использованием сенсибилизации твёрдой фазы соответствующим IgY и детекторной антисыворотки. Применяли собственную схему [9]: сенсибилизация твёрдой фазы IgY против соответствующего антигена → исследуемый антиген → соответствующая детекторная антисыворотка (или иммунный асцит мышей) → коммерческий пероксидазный конъюгат против IgG детекторной сыворотки (иммунного асцита мышей).

Система ИФА для определения антигенов полиовируса типов 1, 2, 3 и ВЖЛ, полностью основанная на использовании соответствующего IgY (в качестве иммуносорбента и детекторных антител, меченных биотином). Иммунопанели Costar (кат. № 9018) сенсибилизировали 18 ч при +4 °С препаратом IgY против соответствующего антигена в концентрации 10–20 мкг/мл в карбонат-бикарбонатном буфере, pH 9,6 (Sigma, кат. № C3041-100 CAP). После 3-кратной отмывки 0,05% Tween-20 в фосфатно-солевом буфере (Т-ФСБ) и блокирования свободных сайтов 1% сывороткой телёнка (Gibco) в ФСБ в течение 1 ч при +37 °С и 3-кратной отмывки вносили анализируемые антигены в разведениях в ИФА-буфере (1% сыворотка телёнка в ФСБ с 0,05% Tween-20). Негативный контроль антигена – ИФА-буфер. После инкубации в течение 2 ч при +37 °С (или 18 ч при +4 °С) и 5-кратной отмывки вносили соответствующие IgY, меченные биотином в ИФА-буфере в рабочем разведении, подобранном шахматным титрованием. После инкубации в течение 1 ч при +37 °С и 5-кратной отмывки вносили коммерческий стрептавидин-пероксидазный конъюгат (Sigma, кат. № S5512-1MG) в ИФА-буфере в рабочем разведении. Инкубировали 45 мин при +37 °С, отмывали 5 раз и вносили готовый субстрат TMB (Sigma, кат. № Т0440-100 ml). Инкубировали в течение 30 мин в темноте, реакцию останавливали 2М серной кислотой. Объём вносимых ингредиентов – 0,1 мл (за исключением блокирующего раствора – 0,2 мл и серной кислоты – 0,05 мл). Оптическую плотность (ОП) измеряли при 450 нм (Thermo Scientific Multiskan FC ELISA reader, Thermo Labsystems, Финляндия). Результат считали положительным при значении P/N (ОП опыта/ ОП контроля) ≥ 2,1 [10]. Количество D-антигена рассчитывали по его титру или по отношению к ОП референс-образца (приблизительно). Для точного подсчёта используют метод параллельных линий, для которого необходим референс-образец с максимально достоверным количеством D-антигена.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программного обеспечения Microsoft Excel.

Результаты

На рисунке представлены результаты титрования в ИФА препарата IgY против ВКЭ (2 нед после трёх иммунизаций антигеном ВКЭ, концентрация тотального IgY 10 мг/мл). При низких значениях (< 0,1 о. е.) ОП контрольного образца (IgY из неиммунного желтка) анти-ВКЭ IgY демонстрирует выраженную специфичность с титром не менее 1 : 1,048576, что соответствует примерно 1 нг/мл специфического IgY (примерно 10% от тотального IgY).

Использование полученных препаратов анти-ВКЭ IgY в качестве иммуносорбента для ИФА в опытах по определению антигена ВКЭ (очищенный белок Е) продемонстрировало чёткие положительные результаты: очищенный белок Е определяется в концентрации примерно 25 нг/мл (данные не представлены).

В табл. 1 представлены результаты титрования препарата поливалентной инактивированной полиовирусной вакцины на основе штаммов Сэбина, типы 1–3 (С-ИПВ, лабораторная серия) – определение D-антигена каждого типа в варианте ИФА с сенсибилизацией твёрдой фазы специфическими IgY против типов 1, 2, 3 и соответствующими детекторными антисыворотками кроликов. Согласно данным табл. 1, титр D-антигена типа 1 – 1 : 512; типа 2 – 1 : 128; типа 3 – 1 : 1024.

В табл. 2 представлены результаты титрования «диких» штаммов полиовируса (тип 1 – Mahoney, тип 2 – MEF-1, тип 3 – Saukett) – определение D-антигена каждого типа в культуральной жидкости инфицированных клеток Vero в варианте ИФА с сенсибилизацией твёрдой фазы специфическими IgY против типов 1, 2, 3 и соответствующими детекторными IgY, меченными биотином. Из данных табл. 2 следует, что титр D-антигена типа 1 – 1 : 128; типа 2 ≥ 1 : 4096; типа 3 – 1 : 64.

В табл. 3 представлены результаты титрования компонентов куриного эмбриона (яйца), инфицированного ВЖЛ, штамм 17 D, – определение антигена ВЖЛ в варианте ИФА с сенсибилизацией твёрдой фазы специфическим IgY и соответствующим детекторным IgY, биотином. Из данных таблицы следует, что в аллантоисной жидкости антиген ВЖЛ не определяется; в гомогенате тела эмбриона титр антигена ВЖЛ более 1 : 32 (~ 1 : 64 – 1 : 128); в коммерческой живой вакцине против жёлтой лихорадки титр антигена ВЖЛ – 1 : 8.

Чувствительность представленных вариантов ИФА составляет 2–3 lg БОЕ/мл (для ВКЭ и ВЖЛ) и 3 lg ТЦД/мл (для полиовируса).

 

Таблица 1. Титрование D-антигена типов 1, 2, 3 в препарате инактивированной полиовирусной вакцины (С-ИПВ) на основе штаммов Сэбина в системе ИФА: сенсибилизация IgY → антиген → детекторная антисыворотка → антивидовой пероксидазный конъюгат
Table 1. Titration of D-antigen of types 1, 2, 3 in the preparation of inactivated poliovirus vaccine (C-IPV) based on Sabin strains in the ELISA system: sensitization by IgY → antigen → detector anti-serum → antispecies peroxidase conjugate

Примечание. * разведение исследуемого образца; ** оптическая плотность при 450 нм; *** «нормальный» антиген (ИФА-буфер).
Note. * dilution of the test sample; ** optical density at 450 nm; *** «normal» antigen (ELISA buffer).

Таблица 2. Титрование штаммов полиовируса (тип 1 – Mahoney, тип 2 – MEF-1, тип 3 – Saukett) – определение D-антигена каждого типа в культуральной жидкости инфицированных клеток Vero в варианте ИФА с сенсибилизацией твёрдой фазы специфическими IgY против типов 1, 2, 3 и соответствующими детекторными IgY, меченными биотином
Table 2. Titration of poliovirus strains (type 1 – Mahoney, type 2 – MEF-1, type 3 – Saukett) – determination of the D-antigen of each type in the culture fluid of infected Vero cells in the ELISA with sensitization of the solid phase by specific IgY against types 1, 2, 3 and corresponding biotinlabeled IgY as detector

Примечание. * разведение исследуемого образца; ** оптическая плотность при 450 нм; *** «нормальный» антиген (ИФА-буфер).
Note. * dilution of the test sample; ** optical density at 450 nm; *** «normal» antigen (ELISA buffer).

Таблица 3. Титрование компонентов куриного эмбриона (яйца), инфицированного вирусом жёлтой лихорадки (ВЖЛ), штамм 17 D, – определение антигена ВЖЛ в варианте ИФА с сенсибилизацией твёрдой фазы специфическим IgY и соответствующим детекторным IgY, меченным биотином
Table 3. Titration of components of chicken embryo (egg) infected with YF virus, strain 17 D – determination of YF virus antigen in the ELISA variant with sensitization of the solid phase by specific IgY and the corresponding detection IgY labeled with biotin

Примечание. * разведение исследуемого образца; ** оптическая плотность при 450 нм; *** коммерческая живая вакцина вируса жёлтой лихорадки (ФГБНУ «ФНЦИРИП им. М.П. Чумакова РАН», Москва); **** «нормальный» антиген (ИФА-буфер).
Note. * dilution of the test sample; ** optical density at 450 nm; *** commercial live yellow fever virus vaccine (Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia); **** «normal» antigen

Обсуждение

IgY-технология находит всё большее применение в исследовательской практике (в основном за рубежом [1][2][3]), и представленные нами результаты показывают, что это оправданно: выраженная иммунореактивность кур, простота, дешевизна и атравматичность иммунизации (важнейший этический момент), большой выход и лёгкость получения препаратов IgY с высокой активностью и специфичностью. Поликлональные антисыворотки (или препараты IgG) млекопитающих, как правило, создают проблемы с перекрёстной реактивностью при использовании их в иммунологических тестах, особенно для детекции антигенов в виде клеточных или тканевых суспензий, включая кровь. Использование моноклональных антител, например, в системах ИФА для детекции сложных антигенов, менее эффективно вследствие узкой специфичности моноклональных антител (нередко приходится использовать «коктейли» из них для более широкой эпитопной специфичности). Поликлональные IgY представляются эффективной моделью для решения такого рода проблем. В данном сообщении мы представили варианты систем ИФА на основе препаратов IgY для определения антигенов указанных вирусов. Системы ИФА для определения D-антигена полиовирусов и ВЖЛ уже используются при разработке экспериментальных серий инактивированной полиовирусной вакцины на основе штаммов Сэбина (С-ИПВ) [11] и инактивированной вакцины ВЖЛ [12].

About the authors

A. P. Ivanov

Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: ivanovalexander1@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-4576-7136

Alexander P. Ivanov, Dr. Sci. Med., 1^st category technologist, Department for the development and implementation of innovative technologies.

Moscow, 108819

Россия

T. D. Klebleeva

Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-4288-6818
Moscow, 108819 Россия

O. E. Ivanova

Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences; I.M. Sechenov First Moscow State Medical University

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-1784-4827
108819, Russia
119991, Russia Россия

References

Supplementary files