Investigation of oncolytic potential of vaccine strains of yellow fever and tick-borne encephalitis viruses against glioblastoma and pancreatic carcinoma cell lines

Full Text

Введение

Проблема терапии злокачественных заболеваний по-прежнему остается нерешенной. Существующие терапевтические подходы способны вызывать ремиссии разной протяженности, но не обеспечивают полного выздоровления, поскольку в ответ на терапию происходит отбор устойчивых опухолевых клеток. Онколитическая виротерапия – активно развивающееся направление исследований в последние годы. На основе онколитических вирусов уже разработан ряд препаратов, зарегистрированных для терапии злокачественных заболеваний, и еще десятки находятся на разных стадиях клинических исследований [1–3]. Развитие онколитической виротерапии в нашей стране имеет давнюю историю [4]. Лидирующее положение на территории бывшего СССР занимала исследовательская группа под руководством М.К. Ворошиловой (лаборатория иммунологии энтеровирусов, Институт полиомиелита, Москва), которая активно изучала онколитический потенциал энтеровирусов [5]. Исследователи показали, что живые энтеровирусные вакцины стимулируют клеточный иммунитет у онкологических больных и потенциально могут быть эффективными для лечения пациентов с опухолями желудочно-кишечного тракта [6, 7]. Работа по созданию панелей препаратов на основе онколитических энтеровирусов и персонализированного подхода к пациентам с учетом молекулярно-биологических механизмов тропизма к конкретным опухолям продолжается в настоящее время группой под руководством проф. М.П. Чумакова [8–10]. Еще одним перспективным подходом для онковиротерапии является использование рекомбинантных аденовирусов, в частности, в качестве вероятно наиболее перспективных кандидатов для виротерапии злокачественных глиобластом [11–13]. В ГНЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор» (Новосибирск) был создан противоопухолевый препарат «Канцеролизин» на основе мутантного варианта Ade12 аденовируса человека серотипа 5, который с эффективностью, близкой к вирусу дикого типа, инфицирует опухолевые клетки, дефектные по р53, а также создана клеточная линия на основе клеток 293, которая может быть использована для масштабируемого получения данного вируса [14]. В экспериментах на лабораторных животных (мыши, кролики, морские свинки) в доклинических исследованиях канцеролизина была показана его безвредность и безопасность [15, 16]. В ГНЦ «Вектор» на основе вируса осповакцины штамма L-IVP был также сконструирован онколитический вирус, обеспечивающий доставку противораковых терапевтических генов в клетки макроорганизма. В рекомбинантный вирус L-IVP_oncoM был встроен ген, кодирующий гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, и синтетический ген, кодирующий полиэпитопный иммуноген, состоящий из эпитопов антигенов, гиперэкспрессирующихся в клетках меланомы. Онколитическую эффективность полученного рекомбинантного вируса оценивали с помощью мышиной модели ксенографтов с использованием злокачественных клеток SK-Mel-28 [17].

В последние годы, помимо изучения патогенного потенциала представителей рода флавивирусов, активно изучается их онколитический потенциал [18]. Вирусам свойственно заражать и лизировать клетки, причем опухолевые клетки, как правило, приобретают повышенную чувствительность к вирусам, благодаря поломкам в механизмах контроля клеточного деления и внутриклеточной противовирусной защиты. Показано, что онколитические вирусы способны также стимулировать противоопухолевый иммунитет [19]. С точки зрения иммуногенности флавивирусы могут играть положительную роль в терапии опухоли и приводить к ее лизису иммуноопосредованным способом. Однако флавивирусы в качестве онколитических вирусов малоизучены, хотя они имеют природную нейротропность и могут использоваться для лечения, например, глиобластом, при использовании безопасных для человека штаммов или в качестве системы доставки противоопухолевых агентов в инактивированном виде.

Род Orthoflavivirus [20] включает более 70 арбовирусов, которые являются трансмиссивными и переносятся комарами и клещами. Геном флавивирусов представлен кэпированной одноцепочечной РНК положительной полярности длиной около 11 тыс. нуклеотидов с единственной открытой рамкой считывания. Больше всего исследований на предмет онколитической активности среди флавивирусов посвящено вирусу Зика. Вирус Зика является слабопатогенным для человека, у взрослых пациентов инфекция, вызванная вирусом Зика, обычно протекает бессимптомно, лишь небольшой процент пациентов (< 20%) сообщают о легкой лихорадке, сыпи и боли в суставах в течение примерно 7 сут. В ряде работ было продемонстрировано, что вирус Зика избирательно инфицирует нервные стволовые клетки плода [2], которые имеют некоторое сходство с клетками глиобластомы. Эффективность вируса Зика в отношении глиобластом была также показана на модели in vitro и in vivo [21]. Авторы отметили, что вирус Зика избирательно заражал клетки глиобластомы, полученные от пациентов после резекции, в сравнении с нейронами и глиальными клетками. Авторы также использовали вирус Зика для терапии глиобластом мыши GL261 и CT-2A. В результате наблюдалось увеличение продолжительности жизни мышей C57BL/6, получавших терапию, в сравнении с контрольной группой, уменьшение объема опухоли проходило без неврологических симптомов. Кроме того, избирательность репликативной активности вируса Зика в отношении клеток глиобластомы U87 MG человека была продемонстрирована в исследовании В.А. Святченко и соавт. на модели с использованием иммунодефицитных SCID мышей с привитыми подкожными ксенографтами глиобластомы U87 MG [22].

Еще один флавивирус, обладающий онколитическим потенциалом, – вирус желтой лихорадки (ВЖЛ). ВЖЛ вызывает серьезное инфекционное заболевание, возбудитель которого передается при укусе комаров Aedes aegypti [23]. Аттенуированный штамм 17D ВЖЛ полностью секвенирован, имеет хороший профиль безопасности у иммунокомпетентных детей и взрослых, вакцина на его основе используется в профилактических целях для предотвращения заболевания в эндемичных регионах [24]. Недавнее исследование на мышах при внутриопухолевой терапии подкожных опухолей меланомы и карциномы толстой кишки продемонстрировало эффективность штамма 17D ВЖЛ как иммуномодулирующего агента, приводящего к задержке роста опухолей [25]. Таким образом, штамм 17D ВЖЛ можно рассматривать в качестве потенциального онколитического агента.

Вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) изучали на предмет онколитической активности только в 50-х годах прошлого столетия. Е.Н. Левкович и Л.Г. Карпович (лаборатория клещевого энцефалита, Институт полиомиелита, Москва, СССР) исследовали 25 штаммов ВКЭ и родственных ему вирусов, включая вирус шотландского энцефаломиелита овец, вирус омской геморрагической лихорадки, вирус Кьясанурской лесной болезни, вирус Лангат. Было показано, что вирусы, которые хорошо репродуцируются в организме человека, также активно размножаются в клетках HeLa, однако их цитопатогенное действие сильно варьирует [26]. В исследовании Е.Н. Левкович и Г.И. Сергеевой было выявлено ингибирующее действие всех изученных штаммов ВКЭ на рост асцитной карциномы Эрлиха и саркомы Крокера in vitro. ВКЭ, а также вирус Лангат оказались способными инфицировать опухолевые клетки с последующим снижением их пролиферативной способности и задержкой роста опухоли при трансплантации клеток экспериментальным животным [27, 28]. Однако из-за высокой патогенности ВКЭ и отсутствия на тот момент возможности генетически модифицировать вирус, исследования его онколитических свойств были прекращены. На сегодняшний день ВКЭ можно рассматривать в качестве онколитического вируса при условии должных генетических модификаций, приводящих к его полной аттенуации.

Цель работы – исследование чувствительности клеточных линий глиобластомы и карциномы поджелудочной железы к вакцинным штаммам 17D ВЖЛ и Софьин ВКЭ.

Материалы и методы

Клеточные линии и условия культивирования

Перевиваемая культура клеток почечного эпителия зеленой мартышки Vero (получены из Американской коллекции клеточных культур – АТСС) и культура эмбриональной почки свиньи (СПЭВ) (из коллекции ФГАНУ «ФНЦИРИП им. М.П. Чумакова РАН») были использованы для титрования вируса методом бляшек; клеточную линию глиобластомы GL-6 (ФГБУН ИМБ РАН), клеточные линии глиобластомы T98G, LN-229 (АТСС), клеточные линии карциномы поджелудочной железы MIA PaСa-2 и протоковой карциномы поджелудочной железы человека PANC-1 (ИБХ РАН) использовали для определения чувствительности к вирусам.

Клетки культивировали в питательной (ростовой) среде DMEM (ФГАНУ «ФНЦИРИП им. М.П. Чумакова РАН»), с добавлением 2 мМ L-глутамина («ПанЭко», кат. № Ф032), антибиотиков пенициллина (250 МЕ/мл) и стрептомицина (200 мкг/мл) («ПанЭко», кат. № А065п) и 5% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (FBS Gibco #2412072) в атмосфере 5% СО₂ при 37 °С. В качестве поддерживающей среды после заражения клеток вирусами использовали среду «Игла МЕМ» (ФГАНУ «ФНЦИРИП им. М.П. Чумакова РАН») с идентичными добавками, как и в случае с ДМЕМ, но с добавлением 2% ЭТС.

Вирусные штаммы

В работе использовали аттенуированный вакцинный штамм 17D ВЖЛ, вакцинный штамм Софьин ВКЭ из коллекции ФГАНУ «ФНЦИРИП им. М.П. Чумакова РАН». Титры вирусов оценивали методом бляшек, концентрацию вирусной РНК в культуральной среде – методом количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Титрование вирусов методом бляшек

Титры вируса определяли методом бляшек под покрытием 1,26% метилцеллюлозы в культуре клеток Vero (для ВЖЛ) и СПЭВ (для ВКЭ) на пластиковых 12-луночных планшетах. Клетки высевали на 12-луночные планшеты и инкубировали в течение 24 ч при 37 °C в CO₂-инкубаторе. На среде 199 с солями Эрла готовили 10-кратные разведения вирусных образцов и добавляли их к клеткам в объеме 100 мкл на лунку. Планшеты инкубировали в CO₂-инкубаторе в течение 1 ч при осторожном покачивании. Затем в каждую лунку вносили 1 мл 1,26% метилцеллюлозы.

Учет бляшек проводили на 8-е сутки после заражения. Титр вируса выражали в количестве бляшкообразующих единиц (БОЕ) в 1 мл вируссодержащего материала. Титр рассчитывали по формуле:

ΣN/(d × n × V) = БОЕ/мл,

где: N – количество бляшек в одной лунке для соответствующего разведения; n – количество лунок для одного разведения, шт.; V – объем пробы (дозы для заражения), мл; d – разведение (в виде 10-x).

Определение концентрации вирусной РНК в культуральной среде методом ПЦР в реальном времени

Пробу культуральной среды отбирали в объеме 1 мл, клеточный дебрис удаляли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 5 мин. Выделение РНК вируса из полученного супернатанта проводили с помощью набора реагентов «Рибо-преп», обратную транскрипцию (получение кДНК) осуществляли с помощью набора «Реверта-L». При проведении ПЦР для ВКЭ использовали набор реагентов «АмплиСенс TBEV, B. burgdorferi sl, A. phagocytophillum, E. chaffeensis / E. muris-FL» с применением калибраторов с известной концентрацией кДНК: 1 × 10⁹, 1 × 10⁷, 1 × 10⁵ ГЭ/мл. При проведении ПЦР для ВЖЛ применяли набор реагентов «АмплиСенс Yellow fever virus-FL», в качестве стандартов использовали штамм 17D ВЖЛ в титре 1 × 10⁷, 1 × 10⁵, 1 × 10³ БОЕ/мл. Производителем всех использованных наборов реагентов является ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (Москва). Количественную ПЦР в реальном времени выполняли на термическом циклере Rotor-Gene Q 6plex (Qiagen) c помощью каналов детекции (FAM, HEX) и определением цикла детекции (C_t).

Определение чувствительности клеток к вирусам

1. Цитопатическое действие (ЦПД). Клетки сажали на 25 см² матрасы и культивировали до образования монослоя. Заражение проводили в минимальном объеме 250 мкл вируссодержащей жидкостью в титрах 10⁷ БОЕ/мл в течение 1 ч при 37 °C с покачиванием. Затем монослой клеток отмывали и добавляли поддерживающую среду. ЦПД наблюдали в течение 14 сут. Начиная с 3-х суток с помощью световой микроскопии оценивали ЦПД. Учет ЦПД проводили визуально по системе крестов: если изменению (по сравнению с контролем) подвергся весь монослой в матрасе, ЦПД оценивали на 4 креста (++++), если ¾ – на 3 (+++), если ½ – на 2 (++), если на ¼ – на 1 крест (+).
2. МТТ-тест. 96-луночные планшеты с клетками перевиваемых опухолевых линий инфицировали 10-кратными серийными разведениями вирусов в шести повторах. Адсорбцию вируса проводили в течение 1 ч при 37 °C в CO₂ инкубаторе в объеме 30 мкл на лунку, далее удаляли вируссодержащую жидкость, промывали клетки средой без сыворотки и культивировали в поддерживающей среде с 2% ЭТС. Через 3, 4, 5 сут определяли жизнеспособность клеток с помощью MTT-теста, используя реагент МТТ в рабочей концентрации 5 мг/мл в фосфатном буфере рН 7,2 («ПанЭко», кат. № О104). С помощью планшетного ридера Bio-Rad iMark определяли оптическую плотность при длине волны 595/650 нм. Результат оценивали в сравнении со средней оптической плотностью в контроле (неинфицированные клетки), принимая ее за 100%.

Формирование тканевых сфероидов

Формирование тканевых сфероидов производили с помощью агарозных форм, изготовленных с применением силиконовых матриц (любезно предоставленных И.В. Зубаревым) согласно инструкции производителя (ЧУ Лаборатория биотехнологических исследований «3Д Биопринтинг Солюшенс», Россия) [29].

Микроскопия

Визуальный контроль, фотографии клеток и сфероидов производили с применением инвертированного биологического микроскопа OLYMPUS CKX53, оснащенного цифровой камерой и ПО ADFImageCapture.

Статистически анализ.

Статистическую оценку данных проводили в программе GraphPad Prism 8 с использованием дисперсионного анализа ANOVA для MTT-теста, критерия Краскела–Уоллиса для ПЦР.

Результаты

Исследовали чувствительность опухолевых клеточных линий глиобластом GL6, LN-229, T98G, карциномы поджелудочной железы MIA Paca-2 и протоковой карциномы поджелудочной железы PANC-1 к штаммам 17D ВЖЛ и Софьин ВКЭ. С целью определения минимального титра вируса, необходимого для достижения ЦПД, клеточные культуры инкубировали с серийными 10-кратными разведениями ВЖЛ и ВКЭ. Через 5 сут после заражения оценивали жизнеспособность клеток с помощью МТТ-теста. На рис. 1 (а, б) представлены результаты чувствительности исследуемых клеточных линий к штаммам 17D ВЖЛ и Софьин ВКЭ на 5-е сутки после заражения клеток. Полученные профили чувствительности указывают, что наибольший цитопатический эффект штаммы 17D ВЖЛ и Софьин ВКЭ проявляют в отношении клеточной линии MIA Paca-2, частичный – в отношении PANC-1, полное отсутствие ЦПД наблюдается в отношении трех исследуемых культур глиобластом.

 

Рис. 1. Чувствительность клеточных линий глиобластом GL6, LN-229, T98G, карциномы поджелудочной железы MIA Paca-2 и протоковой карциномы поджелудочной железы PANC-1 к штамму 17D ВЖЛ (панель а) и штамму Софьин ВКЭ (панель б) в зависимости от титра вируса при заражении по результатам оценки доли выживших клеток с помощью МТТ-теста на 5-е сутки после инфицирования.

Фотографии клеток MIA Paca-2. Ув. ×100. а(1) – контрольной лунки, монослой сохранен; а(2) – инфицированной, полный клеточный лизис.

Fig. 1. Sensitivity of glioblastoma cells GL6, LN-229, T98G, pancreatic carcinoma MIA Paca-2 and pancreatic ductal carcinoma PANC-1 cell to strain 17D YFV (panel а) and strain Sofjin TBEV (panel b) depending on the virus titer at the infection as assessed by the proportion of surviving cells using the MTT test at 5 days post-infection.

Photographs of MIA Paca-2 cells. Magnification ×100. а(1) – control well, monolayer preserved; а(2) – infected well, complete cell lysis.

 

Минимальный титр ВЖЛ при заражении для достижения полной клеточной гибели в отношении MIA Paca-2 составил 10⁶ БОЕ/мл, а ЦПД₅₀ достигалось при титре вируса 10³ БОЕ/мл. При воздействии штамма Софьин ВКЭ полного клеточного лизиса в культуре MIA Paca-2 не происходило, ЦПД₅₀ достигалось при минимальном титре вируса 10⁴ БОЕ/мл. Оба исследуемых вирусных штамма даже при титре заражения 10⁷ БОЕ/мл не вызывали полного клеточного лизиса клеток PANC-1, при этом ЦПД₅₀ достигалось к 5-м суткам при воздействии штамма 17D ВЖЛ в титре 10⁶ БОЕ/мл, а в случае штамма Софьин ВКЭ ЦПД₅₀ на клетках PANC-1 наблюдали на 3-и сутки при титре заражения 10⁷ БОЕ/мл, к 5-м суткам цитопатический эффект значительно снижался (табл. 1).

 

Таблица 1. Результаты определения минимального титра заражения вирусов (штаммы 17D ВЖЛ и Софьин ВКЭ) в отношении клеточных линий карцином (MIA Paca-2, PANC-1) и глиобластом (GL6, LN-229, T98G)

Table 1. Results of determining the minimum titer of virus infection (strain 17D YFV and strain Sofjin TBEV) in carcinoma (MIA Paca-2, PANC-1) and glioblastoma (GL6, LN-229, T98G) cell lines

Минимальный титр вируса при заражении, БОЕ/мл Minimum virus titer at infection, MOI/ml	Штамм 17D ВЖЛ Strain 17D YFV		Штамм Софьин ВКЭ Strain Sofjin TBEV
5-е сутки эксперимента 5th day of the experiment	ЦПД50 CPE50	Полный клеточный лизис Total cell lysis	ЦПД50 CPE50	Полный клеточный лизис Total cell lysis
MIA Paca-2	103	106	104	–
PANC-1	106	–	107*	–
GL6, LN-229, T98G	–	–	–	–

Примечание. «–» – нет эффекта; * – ЦПД₅₀ – эффект наблюдается только на 3-и сутки.

Note. «–» – no effect; * – CPE₅₀ – effect observed only on day 3 at titer of 10⁷ MOI/ml.

 

Исследуемые культуры того же пассажа вели на 25 см² матрасах с последующим заражением ВЖЛ и ВКЭ с целью оценки ЦПД и отбора проб культуральной среды для определения концентрации вируса методом количественной ПЦР в режиме реального времени. Результаты оценки ЦПД для штамма 17D ВЖЛ при культивировании клеточных линий на матрасах коррелировали с данными МТТ-теста: при титре заражения 10⁷ БОЕ/мл к 5-м суткам ЦПД достигало результата «4 креста» в отношении клеточной линии MIA Paca-2 и «2 креста» в отношении клеточной линии PANC-1. По данным ПЦР, при заражении штаммом 17D ВЖЛ в титре 1 × 10⁷ БОЕ/мл (ПЦР 1 × 10⁶ ГЭ/мл) концентрация вирусной РНК в культуральной среде возрастала, что свидетельствует о репликации вируса в данных клеточных линиях и объясняет выраженный онколитический эффект ВЖЛ в их отношении (табл. 2). ЦПД штамма Софьин ВКЭ при заражении клеток в титре 4 × 10⁷ БОЕ/мл к 5-м суткам в отношении клеточной линии MIA Paca-2 оценивали как «3 креста», в отношении клеточной линии PANC-1 – как «1 крест». По результатам ПЦР, концентрация вирусной РНК в культуральной среде MIA Paca-2 и PANC-1 к 5-м суткам была выше исходной (в момент заражения) – 2 × 10⁹ ГЭ/мл, при этом в клетках MIA Paca-2 концентрация вирусной РНК ВКЭ была на порядок выше (табл. 2).

 

Таблица 2. Изменение концентрации вирусной РНК в культуральной среде при инфицировании (0-е сутки) карцином поджелудочной железы MIA Paca-2 и PANC-1 штаммами 17D ВЖЛ и Софьин ВКЭ на 3, 4, 5-е сутки эксперимента

Table 2. Changes in viral RNA concentration in the culture medium following infection (day 0) of pancreatic carcinomas MIA Paca-2 and PANC-1 strains 17D YFV and Sofjin TBEV on days 3, 4, 5 of the experiment

Вирус Virus		Штамм 17D ВЖЛ Strain 17D YFV				Штамм Софьин ВКЭ Strain Sofjin TBEV
		Сутки Days
Клеточные линии Cell Lines		0	3	4	5	0	3	4	5
MIA Paca-2	ЦПД, БОЕ/мл CPE, MOI/ml	1 × 107	++	+++	++++	4 × 107	+	++	+++
	ПЦР, ГЭ/мл PCR, gE/ml	1 × 106	2,3 × 108	–	1,6 × 108	2 × 109	1,3 × 1011	–	1,2 × 1011
PANC-1	ЦПД, БОЕ/мл CPE, MOI/ml	1 × 107	отсутствует	++	++	4 × 107	отсутствует	+	+
	ПЦР, ГЭ/мл PCR, gE/ml	1 × 106	9,6 × 107	–	6,2 × 107	2 × 109	6,1 × 1010	–	8,8 × 1010

Примечание. «–» – не исследовалось.

Note. «–» – not investigated.

 

Отсутствие ЦПД наблюдали в отношении клеточных линий глиобластом LN229 и T98G при заражении штаммом 17D ВЖЛ в титре 10⁷ БОЕ/мл, и лишь в отношении клеточной линии GL6 было отмечено небольшое разрушение монослоя, оцениваемое в «1 крест» (на 3-и сутки эксперимента), однако в последующем усиления ЦПД в клеточной линии GL6 не было зафиксировано вплоть до 13-х суток. Результаты МТТ-теста коррелировали с данными ЦПД, была зарегистрирована полная выживаемость исследуемых клеточных линий глиобластом на 5-е сутки эксперимента (рис. 1). На 5, 7, 10, 13-е сутки и в случае GL6 также и на 3-и сутки отбирали пробы для оценки концентрации 17D ВЖЛ методом количественной ПЦР в режиме реального времени, при этом на 5-е и 10-е сутки производили замену среды (3-и, 10-е сутки в случае GL6). По результатам ПЦР было выявлено снижение концентрации РНК 17D ВЖЛ в культуральной жидкости для всех исследуемых линий глиобластом (рис. 2). Полученные результаты указывают на отсутствие онколитического эффекта в отношении глиобластом для штамма 17D ВЖЛ.

 

Рис. 2. Изменение концентрации вирусной РНК в культуральной среде при инфицировании (0-е сутки) глиобластом GL6, LN-229, T98G штаммом 17D ВЖЛ на 3, 5, 7, 10, 13-е сутки эксперимента.

Fig. 2. Changes in viral RNA concentration in the culture medium following infection (day 0) of GL6, LN-229, T98G glioblastomas with strain 17D YFV on days 3, 5, 7, 10, 13 of the experiment.

 

При инфицировании клеточных линий штаммом Софьин ВКЭ ЦПД отсутствовало, однако результаты ПЦР-исследования культуральной жидкости показали, что ВКЭ размножается в клеточных линиях LN229 и GL6. Было проведено 2 независимых эксперимента. Первый эксперимент был более коротким – продолжительностью 5 сут, во втором, более длительном эксперименте на 5-е и 10-е сутки (3-и, 10-е сутки в случае GL6) была произведена замена культуральной среды. В культуральной жидкости клеточной линии LN229 при заражении ВКЭ в титре 1 × 10⁷ БОЕ/мл (ПЦР 1 × 10⁹ ГЭ/мл) концентрация РНК вируса достигла максимальной отметки к 5-м и 10-м суткам и составила 1,3 × 10¹¹ и 7 × 10¹⁰ ГЭ/мл соответственно. Для клеточной линии GL6 максимальная концентрация РНК ВКЭ в культуральной жидкости наблюдалась к 3-м суткам эксперимента и достигла 9,6 × 10¹⁰ и 4 × 10¹⁰ ГЭ/мл в первом и втором экспериментах соответственно, после чего наблюдалось снижение концентрации РНК. В культуральной жидкости клеточной линии T98G концентрация РНК ВКЭ составила 10⁹ ГЭ/мл и практически не менялась в течении первых 5 сут после заражения в первом эксперименте, во втором опыте РНК ВКЭ в концентрации 10⁷ ГЭ/мл определялась в культуральной жидкости вплоть до 13-х суток, однако концентрация РНК вируса была ниже в сравнении с концентрацией РНК ВКЭ в других линиях глиобластом (рис. 3).

 

Рис. 3. Изменение концентрации вирусной РНК в культуральной среде при инфицировании (0-е сутки) глиобластом GL6, LN-229, T98G штаммом Софьин ВКЭ на 3, 5, 7,10, 13-е сутки эксперимента.

Fig. 3. Changes in viral RNA concentration in the culture medium following infection (day 0) of GL6, LN-229, T98G glioblastomas strain Sofjin TBEV on days 3, 5, 7, 10, 13 of the experiment.

 

Высокий тропизм штамма 17D ВЖЛ к карциноме поджелудочной железы MIA Paca-2 был продемонстрирован в трехмерной культуре (сфероидах). Формирование тканевых сфероидов производили с помощью агарозных форм, приготовленных при помощи силиконовых матриц («3Д Биопринтинг Солюшенс»). На 3-и сутки культивирования клетки MIA Paca-2 формировались в сфероиды размером 650 мкм. После инфицирования ВЖЛ в титре 1 × 10⁶ БОЕ/мл на после заражения 3-и сутки отмечали ЦПД и появление дефектных сфероидов в сравнении с контрольной группой (рис. 4).

 

Риc. 4. Оценка ЦПД штамма 17D ВЖЛ с помощью тканевых сфероидов на культуре клеток MIA Paca-2. На фотографии вид сфероидов на 3-и сутки. Контроль – не инфицированный сфероид панель (а) и после инфицирования титром 10⁶ БОЕ/мл штаммом 17D ВЖЛ – панель (б). Ув. ×40.

Fig. 4. Assessment of the CPE of 17D YFV using tissue spheroids on MIA Paca-2 cell culture. The photo shows the view of spheroids at 3 days control – uninfected spheroid (panel а) and after infection with 10⁶ MOI/ml strain 17D YFV – (panel b). Magnification × 40.

 

Таким образом, результаты настоящего исследования показали, что ВЖЛ, обладая природной тропностью к клеткам гепатобилиарной системы, эффективен только в отношении опухолевых клеток карциномы поджелудочной железы. При высоких титрах заражения ВЖЛ оказывал сильное цитотоксическое действие на клетки карциномы поджелудочной железы (MIA Paca-2) и имел ограниченный эффект в отношении карциномы протоков поджелудочной железы (PANC-1). В отношении исследованных клеточных линий глиобластом (LN229, GL6, T98G) вирус не оказывал онколитического действия, концентрация вирусной РНК в культуральной среде постепенно снижалась.

Штамм Софьин ВКЭ продемонстрировал ЦПД в отношении карциномы поджелудочной железы (MIA Paca-2) и крайне ограниченный цитотоксический эффект в отношении протоковой карциномы поджелудочной железы (PANC-1). При этом, несмотря на природную нейротропность, вирус не оказывал онколитического эффекта в отношении клеточных линий глиобластом (LN229, T98G и GL6), хотя наблюдалась репродукция вируса в этих культурах. Так, для глиобластомы линии GL6 концентрация вирусной РНК определялась в течение 13 сут и была на уровне исходной концентрации РНК при заражении, даже при периодическом удалении культуральной среды, а в случае клеточной линии LN229 концентрация вируса увеличилась с 1 × 10⁹ до 1 × 10¹⁰ ГЭ/мл.

Обсуждение

Исследование вакцинных штаммов 17D ВЖЛ и Софьин ВКЭ в отношении клеточных линий глиобластом и карцином поджелудочной железы дает основание сделать вывод о наличии онколитического потенциала у исследуемых вирусов и возможности их применения в терапии злокачественных новообразований.

Безусловно, преимуществом штамма 17D ВЖЛ является его доказанная многолетними исследованиями безопасность и иммуногенность [30].

Сравнить полученные результаты in vitro с другими исследованиями достаточно сложно, так как в литературе представлены данные для опухолевых линий другого генеза. Например, в работе M. Aznat и соавт. [25] исследования выполнены на клеточных линиях рака толстой кишки, почечно-клеточного рака, рака молочной железы и меланомы. Штамм 17D ВЖЛ проявлял цитопатическое действие, в то время как на нетрансформированных фибробластах человека цитотоксические эффекты отсутствовали. При прививании карциномы толстой кишки MC38 и меланомы B16OVA мышам C57BL/6 с последующим внутриопухолевым введением вируса наблюдалась задержка роста опухоли. Таким образом, штамм 17D ВЖЛ можно рассматривать в качестве потенциального онколитического агента.

Тот факт, что вакцина на основе штамма 17D ВЖЛ является широко используемым профилактическим средством для подкожной или внутримышечной вакцинации, значительно упрощает возможную клиническую разработку стратегий иммунотерапии, включающих внутриопухолевые инъекции. Дополнительно повысить эффективность терапии можно путем введения в клетку опухоли последовательностей, кодирующих гены-супрессоры опухоли, гены «смерти» или гены цитокинов, усиливающих индукцию иммунного ответа на опухолевые антигены, например, путем создания рекомбинантных векторов на основе 17D, несущих монотела с убиквитин-лигазами VHL и MDM2 для таргетного разрушения онкогенов типа K-RAS.

Вакцинный штамм Софьин ВКЭ является нейротропным, свободно преодолевает гематоэнцефалический барьер и способен вызывать энцефалопатию [31], поэтому применение его in vivo как противоопухолевого агента возможно только после предварительной иммунизации реципиентов инактивированной вакциной или при генетической модификации ВКЭ для улучшения его профиля безопасности. Ранее уже были проведены исследования ВКЭ-штаммов дальневосточного подтипа, к которым относится и штамм Софьин в качестве возможных онколитических агентов. Результаты показали ингибирование роста подкожных опухолей мышей различной этиологии (фибросаркома MCI, нейробластома мыши C1300, аденокарцинома молочной железы EO 771, остеогенная саркома Ridgeway, саркомы T241 и 180), однако такие исследования проводились очень давно, в 1950-х гг. [27, 28, 32, 33]. Таким образом, штамм Софьин ВКЭ потенциально можно рассмотреть в качестве онколитического вируса при условии обеспечения безопасности его применения.

Полученные в настоящем исследовании результаты in vitro также подтверждают, что штаммы 17D ВЖЛ и Софьин ВКЭ имеют перспективы в онковиротерапии. Разумеется, клеточные культуры не в полной мере отражают патофизиологию опухолевых клеток в системе in vivo. Поведение опухоли в организме определяется как опухолевыми клетками, так и клетками стромального микроокружения, внеклеточным матриксом, влиянием гипоксии, а микроокружение опухоли характеризуется наличием большого количества воспалительных цитокинов, факторов роста и других факторов, поддерживающих рост и метастазирование опухоли [34, 35]. В связи с вышесказанным в дальнейшем планируется продолжить изучение противоопухолевых онколитических и иммуномодулирующих эффектов штаммов 17D ВЖЛ и Софьин ВКЭ на моделях in vivo. Поскольку акцент нами делается именно на иммунологические эффекты, планируются эксперименты на иммунокомпетентных животных с использованием сингенных моделей подкожного опухолевого роста клеток рака поджелудочной железы (PAN02) и глиомы (GL261). Исследование на иммунокомпетентных животных позволит также получить данные по усилению эффекта при предварительной иммунизации животных, а в случае ВКЭ Софьин исследование возможно только при условии предварительной иммунизации инактивированной вакциной ВКЭ.

Также в дальнейшем для понимания механизмов вирусного онкотропизма целесообразно проводить исследования с культурами клеточных опухолевых линий, полученных из опухолей (послеоперационный материал) от пациентов. Так в исследовании А.В. Липатовой и соавт. [36] был применен мультиомный анализ с целью изучения вклада интерферонзависимых противовирусных механизмов в опухолевых клетках мультиморфной глиобластомы, полученных от отдельных пациентов, на устойчивость к онколитическим вирусам, принадлежащим к разным вирусным семействам.

Заключение

Штаммы 17D ВЖЛ и Софьин ВКЭ оказывали цитопатическое действие на клеточные линии рака поджелудочной железы человека при увеличении репродукции вируса в культуральной среде. Резистентность к исследуемым вирусам клеточной линии протоковой карциномы поджелудочной железы PANC-1 была выше, чем карциномы поджелудочной железы MIA Paca-2, что, возможно, связано с повышенной экспрессией IRF2 и IRF7, которые регулируют гены интерферона-a и -γ, в данной клеточной линии [37, 38].

Также следует отметить способность штамма 17D ВЖЛ лизировать 3D-сфероиды клеточной линии MIA Paca-2, что, вероятно, определяет возможность вируса проникать между плотными контактами опухолевых клеток.

В настоящем исследовании штамм Софьин ВКЭ по литическому действию на опухолевые клеточные линии явно уступал штамму 17D ВЖЛ, однако способность его к репликации в клеточных линиях глиобластомы требует дальнейшего изучения in vivo на модели иммунокомпетентных животных с учетом проработки вопроса безопасности его применения путем дополнительной генно-инженерной модификации вируса или предварительной иммунизации животных инактивированной вакциной. Ввиду того, что флавивирусы являются высокоэффективными иммуногенами, мы предполагаем, что лизис или задержка роста опухоли могут быть достигнуты иммуно-опосредованным путем благодаря репликации вируса в опухолевых тканях.

В заключение следует отметить, что применение флавивирусов для онковиротерапии опухолей может оказаться перспективным. Флавивирусы могут быть использованы как непосредственно для лизиса опухолевых клеток, так и для иммуно-опосредованной индукции лизиса опухоли через активацию Т-клеточного звена иммунитета, способствуя преобразованию «холодных» опухолей в «горячие» для увеличения числа иммуночувствительных клеток опухоли и повышения эффективности терапии.

About the authors

Alina S. Nazarenko

Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences (Institute of Poliomyelitis)

Email: nazarenko_as@chumakovs.su
ORCID iD: 0000-0002-7322-8730

Junior researcher of the Laboratory of Tick-Borne Encephalitis and Other Viral Encephalitides, Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences (Institute of Poliomyelitis), Moscow. Russia

Россия, 108819, Moscow

Yulia K. Biryukova

Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences (Institute of Poliomyelitis)

Author for correspondence.
Email: biryukova_jk@chumakovs.su
ORCID iD: 0000-0002-5804-4001

Ph. D., Researcher of the Laboratory of Tick-Borne Encephalitis and Other Viral Encephalitides, Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences (Institute of Poliomyelitis), 108819, Russian Federation, Moscow. Russia

Россия, 108819, Moscow

Ekaterina O. Orlova

Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences (Institute of Poliomyelitis)

Email: orlova_ea@chumakovs.su
ORCID iD: 0009-0009-4175-0493

Junior researcher of the Laboratory of Tick-Borne Encephalitis and Other Viral Encephalitides, Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences (Institute of Poliomyelitis), Moscow. Russia

Россия, 108819, Moscow

Kirill N. Trachuk

Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences (Institute of Poliomyelitis)

Email: trachuk_kn@chumakovs.su
ORCID iD: 0000-0002-2061-0274

Junior researcher of the Laboratory of Tick-Borne Encephalitis and Other Viral Encephalitides, Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences (Institute of Poliomyelitis), Moscow, Russia

Россия, 108819, Moscow

Alla L. Ivanova

Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences (Institute of Poliomyelitis)

Email: ivanova_al@chumakovs.su
ORCID iD: 0009-0002-3086-0581

Ph. D., Microbiologist, Encephalitis Vaccine department, Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences (Institute of Poliomyelitis), Moscow. Russia

Россия, 108819, Moscow

Alla V. Belyakova

Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences (Institute of Poliomyelitis)

Email: belyakova_av@chumakovs.su
ORCID iD: 0000-0003-4363-6394

Ph. D., Scientific secretary, Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences (Institute of Poliomyelitis), Moscow. Russia

Россия, 108819, Moscow

Nikolai B. Pestov

Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences (Institute of Poliomyelitis)

Email: nayeoff@yahoo.com
ORCID iD: 0000-0002-9973-0120

Ph. D., Senior Researcher of the Laboratory of Tick-Borne Encephalitis and Other Viral Encephalitides, Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences (Institute of Poliomyelitis), Moscow, Russia

Россия, 108819, Moscow

Mikhail F. Vorovitch

Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences (Institute of Poliomyelitis); I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, Ministry of Health of Russia (Sechenov University), Institute of Translational Medicine and Biotechnology

Email: vorovich_mf@chumakovs.su
ORCID iD: 0000-0002-7367-6357

Ph. D., Head of Encephalitis Vaccine Department and Senior Researcher of the Laboratory of Tick-Borne Encephalitis and Other Viral Encephalitides, Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences (Institute of Poliomyelitis), Moscow. Russia

108819, Moscow; 119048, Moscow

Aydar A. Ishmukhametov

Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences (Institute of Poliomyelitis); I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, Ministry of Health of Russia (Sechenov University), Institute of Translational Medicine and Biotechnology

Email: ishmukhametov@chumakovs.su
ORCID iD: 0000-0001-6130-4145

Academician of the Russian Academy of Sciences, CEO, Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences (Institute of Poliomyelitis), Moscow. Russia

Россия, 108819, Moscow; 119048, Moscow

Nadezhda M. Kolyasnikova

Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences (Institute of Poliomyelitis)

Email: kolyasnikova_nm@chumakovs.su
ORCID iD: 0000-0002-9934-2582

D.M.S, Head of the Laboratory of Tick-Borne Encephalitis and Other Viral Encephalitides, Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences (Institute of Poliomyelitis), Moscow, Russia

Россия, 108819, Moscow

References

Supplementary files