Molecular and biological properties of the African swine fever virus (Asfarviridae: Asfivirus) isolate ASF/Tatarstan 20/WB-12276

Full Text

Введение

Африканская чума свиней (АЧС) – болезнь вирусной этиологии, поражающая домашних и диких свиней всех возрастов, характеризующаяся геморрагической лихорадкой и высокой летальностью (до 100%) [1–3].

За период эпизоотии АЧС с 2007–2020 гг. отечественными учеными были изучены биологические свойства большого числа изолятов вируса, полученных из разных регионов Российской Федерации (РФ) от домашних и диких свиней. Посредством проведения серий лабораторных экспериментов были определены различия в некоторых молекулярно-биологических свойствах изученных изолятов этого возбудителя, часть из которых охарактеризовали как высоковирулентные, а другие – как обладающие сниженной вирулентностью и вызывающие в том числе бессимптомную форму течения болезни [3–11].

В ходе современной эпизоотии болезнь распространилась на территории 34 стран Европы и Азии, принимая панзоотический характер и нанося серьезный экономический ущерб свиноводческому и смежным секторам [1, 2, 12, 13]. В России на момент 2020 г. прогноз развития эпизоотической ситуации по АЧС характеризовался как неблагоприятный, с тенденцией вовлечения как благополучных (за последние 3 года и более) территорий, так и повторной регистрации новых вспышек болезни на ранее оздоровленных территориях [14, 15].

Так, спустя 4 года после последнего зарегистрированного случая АЧС на территории Республики Татарстан (28.09.2016, у домашних свиней, находящихся в ЛПХ с. Сосновка Нурлатского района) и проведения всех ликвидационных и профилактических мероприятий, новый очаг инфекции был зарегистрирован 12.12.2020 (павшие дикие кабаны, ФГБУ «Национальный парк «Нижняя Кама» Елабужского района). Затем в короткий срок (12.12.2020–09.02.2021) АЧС была нотифицирована на территории двух новых районов: Новошешминском и Заинском [12]. При этом только на территории последнего вирус АЧС был выделен из биологического материала от отстрелянных диких кабанов (4 головы), что может являться следствием циркуляции изолятов с пониженной вирулентностью в пределах одной географической области и требует их всестороннего изучения.

Результаты изучения молекулярно-биологических свойств современных изолятов вируса АЧС могут быть использованы при построении эффективных программ надзора и контроля за болезнью, а также для поиска перспективных генетических маркеров изменчивости для создания профилактических препаратов (вакцин), применимых в рамках стратегии по дифференциации инфицированных животных от вакцинированных (DIVA) и молекулярно-эпизоотологической кластеризации изолятов. Отсутствие единого геномного маркера, позволяющего эффективно разделять существующие изоляты вируса, требует использования при анализе нескольких участков. Так, возможно применение как основных (C-концевой участок гена B646L, CVR гена B602L, межгенная область IGR I I73R/I329L), так и дополнительных (O174L, K145R, EP402R, I267L, MGF 505-5R) генетических маркеров [16].

На основании анализа С-концевой области гена B646L, кодирующего капсидный мажорный белок вируса АЧС vp72, проводится типирование вируса на 24 генотипа [16, 17].

CVR гена B602L является одним из ведущих маркеров для субгенотипирования и дифференциации изолятов вируса АЧС [17–23]. Так, в работе A. Vilem и соавт., на основании последовательностей CVR были обнаружены две генетические группы (GII-CVR2 и GII-CVR1/SNP1) изолятов вируса АЧС II генотипа, в которые вошли вирусы, циркулирующие в Эстонии в 2015–2016 гг. [17]. В работе A. Mazloum и соавт. (2022) на основании нуклеотидных последовательностей CVR изоляты вируса АЧС, выделенные в 2007–2017 гг. на территории Российской Федерации, Европы и Азии, были разделены уже на 6 генетических групп [24].

IGR I73R/I329L является вторым по значимости маркером в дифференциации изолятов одного генотипа. В зависимости от числа (от 2 до 5) тандемных повторов (TRS) из 10 нуклеотидов (GGAATATATA), изоляты вируса АЧС II генотипа разделяют на 4 группы [16, 25, 26].

Изоляты, циркулирующие на территориях Польши и Германии, имеют TRS из 14 п.н. (TCACTACTGAAAAA) в положении 50–63 гена O174L, кодирующего фактор вирулентности ДНК-полимеразу Х, способную к точечной репарации генома [27].

Ген-маркер K145R является основополагающим в кластеризации изолятов вируса АЧС в странах восточной Европы. Ко второй группе относятся изоляты, выделенные на территории Калининградской области, Польши и Германии, для которых уникальна замена «С» на «А» в положении 173 данного гена [25]. В исследовании A. Mazloum и соавт. (2023) обнаружена замена «С» на «Т» в положении 30 гена K145R, характерная исключительно для изолятов, циркулирующих на территории Калининградской области РФ, что свидетельствует о формировании 3-го генетического кластера [28].

Несмотря на высокую консервативность гена I267L, он также может использоваться для молекулярной кластеризации изолятов вируса АЧС [29, 30]. В зависимости от наличия замены «Т» на «А» в положении 76 данного гена, изоляты возможно разделить на две независимые группы. Впервые такая замена обнаружена у изолята вируса АЧС, выделенного в Польше в 2016 г. С тех пор превалирующее число изолятов, циркулирующих на территории Европы, России и Китая, относятся ко второму кластеру по маркеру I267L. Закономерности в персистенции изолятов вируса АЧС по данному маркеру в пределах ограниченного географического региона не наблюдается, поскольку на территории одного государства могут циркулировать обе группы изолятов [29].

Следующим геномным маркером, используемым в молекулярной и географической дифференциации изолятов вируса АЧС, является MGF 505-5R, позволяющий выделить 2 кластера [25]. «А» в положении 84 гена MGF 505-5R имеют изоляты, циркулирующие на территории восточной Европы (Польши, Германии, Украины) и Калининградской области [28]. Другие изоляты, выделенные на территории европейских (Бельгия, Венгрия, Чехия, Литва и др.), азиатских (Китай, Вьетнам, Индия) стран и Российской Федерации имеют «G» в вышеназванном положении гена и относятся к первой, более многочисленной группе.

Таким образом можно заключить, что успех искоренения АЧС зависит от всестороннего изучения возбудителя, в частности его изолятов, особенностей репродукции и характера течения болезни.

Целью работы являлось изучение биологических свойств на восприимчивых животных (домашних свиньях), проведение молекулярно-генетического и филогенетического анализов изолята ASF/Tatarstan 20/WB-12276 вируса АЧС, выделенного из селезенки от отстрелянного на территории Республики Татарстан дикого кабана.

Материалы и методы

Вирус. Изолят вируса АЧС ASF/Tatarstan 20/WB-12276 был выделен специалистами ФГБУ «ВНИИЗЖ» в рамках проведения референтных исследований на АЧС из селезенки от отстрелянного 17.12.2020 дикого кабана на территории Республики Татарстан (Заинский район, Квартал № 110, Заинское лесничество, Кармалинское охотхозяйство).

Вирусовыделение. Выделение изолята вируса АЧС ASF/Tatarstan 20/WB-12276 методом трех последовательных пассажей на первичной культуре клеток селезенки свиньи (СС) с учетом репродукции возбудителя в реакции гемадсорбции (РГАд) и определение титра виремии (lgГАдЕ₅₀/мл) проводили в соответствии с методическими рекомендациями по выделению и титрованию вируса АЧС в культуре клеток СС, разработанными в ФГБУ «ВНИИЗЖ»¹.

Биопроба. Биологические свойства изолята ASF/Tatarstan 20/WB-12276 определяли путем постановки биологической пробы на домашних свиньях. Животные были завезены из благополучного по основным инфекционным болезням свиней хозяйства Московской области; содержались в условиях виварного комплекса ФГБУ «ВНИИЗЖ» в боксе соответствующего уровня биологической защиты (BSL-3). Постановку биопробы, оценку клинических признаков и патологоанатомических изменений проводили согласно методическим указаниям (ФГБУ «ВНИИЗЖ»)²,³ в соответствии с межгосударственными стандартами по содержанию и уходу за лабораторными животными, принятыми Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации, а также согласно требованиям Директивы 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза от 22.09.2010 по охране животных, используемых в научных целях. В экспериментах были соблюдены институциональные и национальные стандарты по использованию лабораторных животных в соответствии с Consensus Author Guidelines for Animal Use (IAVES, July 23, 2010). Протокол исследования одобрен Комиссией по биоэтике ФГБУ «ВНИИЗЖ» (протокол №Б-3/2021 от 24.05.2021).

В опыте использовали 8 голов свиней крупной белой породы массой 15–20 кг/гол., из них: 6 голов (№№ 1–6) заражали культуральной суспензией, содержащей изолят ASF/Tatarstan 20/WB- 12276, внутримышечно в дозе 10 ГАдЕ₅₀/гол. (1-я группа), а 2 головы (№№ 7, 8) содержали совместно с инфицированными животными в качестве контактных (индикаторных) для изучения контагиозности изучаемого изолята (2-я группа).

Всех животных перед началом эксперимента карантинировали в течение 7 суток и исследовали на наличие специфических антител к вирусу АЧС и его генома с целью подтверждения их негативного инфекционного статуса. За животными ежедневно проводили визуальный контроль проявления клинических признаков и термометрию каждой особи. Отбор проб крови осуществляли в вакуумные пробирки с активатором свертывания на 5, 8, 12, 16 и 19-е дни после заражения (д.п.з.). Полученные образцы разделяли на пробы сгустка и сыворотки для параллельного исследования лабораторными методами вирусовыделения, полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени (ПЦР-РВ), твердофазного иммуноферментного анализа (ТФ-ИФА) и иммунопероксидазным методом (ИПМ). Каждый образец исследовали однократно в трех повторностях (n = 3), при анализе результатов использовали полученные средние значения (M) и стандартное отклонение (± SD).

Серологические исследования. Обнаружение специфических антител к вирусу АЧС проводили с использованием тест-систем для постановки ТФ-ИФА: INgezim PPA Compac (Ingenasa, Испания)⁴ и ID Screen, African Swine Fever Indirect, Screening Test (IDvet, Франция)⁵ в соответствии с инструкциями производителей, а также с помощью ИПМ, реализованного в соответствии с методическими рекомендациями, разработанными в ФГБУ «ВНИИЗЖ»⁶.

ПЦР. Обнаружение генома вируса АЧС проводили методом ПЦР-РВ с использованием тест-системы «АЧС» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) согласно инструкции производителя⁷.

Секвенирование. Амплификацию участков генома вируса (маркеров EP402R, I267L, O174L, K145R, межгенной области IGR I I73R/I329L, центральной вариабельной области (CVR) гена B602L и MGF 505-5R) проводили с помощью ПЦР с использованием специфических праймеров для каждого фрагмента, как это описано в работе A. Mazloum и соавт. (2023) [16]. ПЦР-фрагменты оценивали с электрофоретической детекцией в 1%-ном агаровом геле. Экстракцию фрагментов из геля проводили с использованием набора Wizard SV Gel and RCR Clean-up System (Promega, США). После чего выполняли секвенирование по методу Сэнгера с парами праймеров, которые использовали при проведении ПЦР.

Анализ нуклеотидных последовательностей и филогенетический анализ. Нуклеотидные последовательности выравнивали и сравнивали с соответствующими последовательностями референс-штамма Georgia 2007/1 (номер доступа в Genbank FR682468.2) и других изолятов, импортированных из базы данных Genbank (приложение), с помощью программы Bioedit v7.2.5. Филогенетическое родство изолятов устанавливали методом Bootstrap (максимального подобия) с 1000 итерациями начальной загрузки по модели общего обратимого времени (GTR, G + I = 4) в компьютерной программе Mega X [31].

Статистика. Обработку данных и построение графиков проводили с использованием программных пакетов Statistica (http://statsoft.ru), GraphPad Prism 8.0. (https://www.graphpad.com) и Microsoft Excel (https://www.microsoft.com/ru-ru). Для показателей рассчитывали среднее (М) и стандартное отклонение (± SD).

Результаты

Изучение культуральных свойств

Инфицирование культуры клеток СС изучаемым изолятом ASF/Tatarstan 20/WB-12276 вируса АЧС привело к появлению «плотной» гемадсорбции (адсорбция 40–80 эритроцитов на поверхности клетки), а титр накопления вируса к 3-му пассажу в этой культуре клеток не превышал значений 7,34 ± 0,16 lgГАдЕ₅₀/мл ± SD на 4–5-е сутки после заражения.

Проведение биологической пробы

Схема эксперимента представлена в разделе «Материалы и методы».

Результаты термометрии и параллельных исследований проб крови от животных методами ПЦР-РВ, ТФ-ИФА, ИПМ представлены на рисунках 1–3.

 

Рис. 1. Показатели термометрии и результаты исследования проб крови зараженных свиней (№№ 1–3) методами ПЦР-РВ и ТФ-ИФА (n = 3). † – даты падежа; горизонтальной линией по оси ординат отмечена граница физиологической нормы температуры (40,0 °С); столбцы показывают значение Ct при постановке ПЦР-РВ.

 

Рис. 2. Показатели термометрии и результаты исследования проб крови зараженных свиней (№№ 4–6) методами ПЦР-РВ, ТФ-ИФА и ИПМ (n = 3). † – даты падежа; горизонтальной линией по оси ординат отмечена граница физиологической нормы температуры (40,0 °С); столбцы показывают значение Ct при постановке ПЦР-РВ; вертикальными пунктирными линиями отмечены даты первого положительного результата в ИПМ.

 

Рис. 3. Показатели термометрии и результаты исследования проб крови контактных свиней (№№ 7, 8) методами ПЦР-РВ, ТФ-ИФА и ИПМ (n = 3). † – даты падежа; горизонтальной линией по оси ординат отмечена граница физиологической нормы температуры (40,0 °С); столбцы показывают значение Ct при постановке ПЦР-РВ; вертикальными пунктирными линиями отмечены даты первого положительного результата в ИПМ.

 

Как видно из рисунков 1–3, ректальную температуру тела выше 40,0 °С у зараженных свиней детектировали начиная с 4–13 д.п.з. и с 12 – у контактных.

Начало виремии у всех животных выявляли начиная с 5-го д.п.з методом вирусовыделения. При этом у 83% (5 голов) зараженных животных положительные результаты на геном вируса АЧС методом ПЦР-РВ получали при исследовании проб крови начиная с 5-го д.п.з. У зараженной свиньи № 5 и контактных животных положительные результаты при использовании данного метода получены, начиная с 12 суток после начала эксперимента. Максимальный титр виремии в 1-й группе достигал 8,8 lgГАдЕ₅₀/мл, во 2-й группе – 6,3 lgГАдЕ₅₀/мл (табл. 1).

 

Таблица 1. Результаты исследования проб крови методами ПЦР-РВ и вирусовыделения

Table 1. qPCR and virus isolation (VI) results in blood samples

№ свиньи Pig #	5 д.п.з. 5 dpi		8 д.п.з. 8 dpi		12 д.п.з. 12 dpi		16 д.п.з. 16 dpi		19 д.п.з. 19 dpi
	Сt	T	Сt	T	Сt	T	Сt	T	Сt	T
1	7,8	7,7	7,9	7,7	–	–	–	–	–	–
2	6,9	8,3	10,4	6,4	–	–	–	–	–	–
3	13,3	5,4	10,8	6,3	–	–	–	–	–	–
4	16,7	4,4	12,8	5,5	10,2	6,6	–	–	–	–
5	24,5	2,7	24,3	2,7	18,5	3,9	11,7	5,9	6,1	8,8
6	12,4	5,7	10,5	6,4	–	–	–	–	–	–
7	26,5	2,3	26,3	2,4	15,3	4,8	12,8	5,5	–	–
8	27,1	2,2	отр. neg.	0	19,2	3,8	10,7	6,3	11,6	6

Примечание. Ct – пороговый цикл амплификации; Т – титр (lgГАдЕ₅₀/мл); отр. – отрицательный результат; «–» – не исследовались. Ct ≤ 20 – положительный результат; 20 < Ct ≤ 30 – сомнительный результат; Ct отсутствует – отрицательный результат (геном не обнаружен).

Note. Ct – cycle threshold; T, titer (lgHAD₅₀/ml); neg. – negative result; «–» – not studied. Ct ≤ 20 – positive result; 20 < Ct ≤ 30 – doubtful result; Ct absent – negative result (genome not detected).

 

Специфические антитела к вирусу АЧС, при использовании набора INgezim PPA Compac обнаруживали в пробах сыворотки крови от зараженного (свинья № 5) и контактного (№ 7) животных на 19-й д.п.з. (за 1–2 дня до гибели), а сомнительный результат был получен в пробе от свиньи № 4 на 12-й д.п.з. При использовании набора ID Screen, African Swine Fever Indirect, Screening Test антитела к вирусу АЧС не детектировали; сомнительный результат был получен при исследовании сыворотки от животного № 7, отобранной на 19-й д.п.з. (положительная в наборе INgezim PPA Compac).

В то же время при использовании ИПМ антитела к вирусу АЧС выявили у животных №№ 4, 5, 7 и 8, начиная с 12–16-го дня после начала эксперимента.

Смерть всех свиней отмечали в течение 10 суток с момента регистрации первых клинических признаков АЧС (табл. 2).

 

Таблица 2. Оценка клинических признаков

Table 2. Assessment of clinical signs

Группа Group	№ свиньи Pig#	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20	21
Зараженные Infected	№ 1	ϟ	·	·	·	4	4	6	6	8	16	†
	№ 2	ϟ	·	·	·	·	·	7	6	9	10	12	10	†
	№ 3	ϟ	·	·	·	·	·	7	6	6	8	10	17	†
	№ 4	ϟ	·	·	·	·	·	4	4	6	7	10	13	14	†
	№ 5	ϟ	·	·	·	·	·	·	·	·	·	·	·	·	5	8	9	9	12	12	14	†
	№ 6	ϟ	·	·	·	·	5	6	6	8	10	13	13	†
Контактные Contact	№ 7	·	·	·	·	·	·	·	·	·	·	·	·	6	7	14	15	15	16	†
	№ 8	·	·	·	·	·	·	·	·	·	·	·	·	5	6	15	17	18	18	19	19	19	†

Примечание. † – дата падежа; ϟ – дата заражения.

Note. † – death date; ϟ – infection date.

 

Из таблицы 2 видно, что длительность течения болезни (с момента проявления первых клинических признаков) у свиньи № 8 составила 9 суток, у остальных животных – от 6 до 7 суток, что характерно для острой и подострой форм течения болезни [4–7, 9, 32]. У 100% животных отмечали повышение температуры более 41,3 °С, гипорексию, переходящую в анорексию (от незначительного до выраженного истощения). У 7 из 8 (87,5%) свиней наблюдали признаки поражения нервной системы (от апатии до паралича задних конечностей), умеренную гиперемию конъюнктивы и диарею (без признаков развития дегидратации и до водянистой с признаками выраженной дегидратации). У 6 из 8 животных были выявлены цианотичные зоны, занимающие от 1 до 15% поверхности кожи. У контактного и зараженного животных № 8 и № 5 соответственно регистрировали незначительную одышку, а у свиней №№ 1 и 3 единичную рвоту за период наблюдения. Общая сумма набранных баллов при оценке клинических признаков у свиней составила от 10 (свинья № 2) до 19 (свинья № 8).

После регистрации падежа проводили аутопсию каждого животного с отбором проб органов и тканей для их исследования методами ПЦР-РВ и вирусовыделения. Степень патологоанатомических признаков выражали в баллах (табл. 3).

 

Таблица 3. Оценка степени патологоанатомических изменений

Table 3. Scoring of post-mortem lesions

№ свиньи Pig #	Легкие Lungs			Сердце Heart		Селезенка Spleen		Лимфоузлы Lymph nodes			Печень Liver		Почки Kidneys			Мочевой пузырь Bladder	Транссудат Transudate		Сумма: Total:
	Отеки Edema	Пневмония Pneumonia	Кровоизлияния под плеврой Hhemorrhages under the pleura	Геморрагический диатез, дистрофия Hemorrhagic diathesis, dystrophy	Транссудат в перикардиальной полости Transudate in the pericardial cavity	Кровенаполнение Blood filling	Спленомегалия Spleenomegaly	Подчелюстные Submandibular	Брыжеечные Mesenteric	Паховые Inguinal	Гепатопатия Hepatopathy	Желчевыводящие пути Biliary tract	Геморрагический диатез в корковом и мозговом веществе Hemorrhagic diathesis in the cortical and cerebral substance	Субкапсулярные геморрагии Subcapsular hemorrhages	Кровоизлияния в почечной лоханке Hemorrhages in the renal pelvis	Геморрагический диатез в слизистой оболочке Hemorrhagic diathesis in the mucous membrane	Грудная полость Chest cavity	Брюшная полость Abdominal cavity
№1	2	3	1	3	1	3	2	3	3	2	3	1	3	3	2	2	2	1	40
№2	1	1	1	1	1	3	3	3	3	2	1	0	2	1	2	1	0	0	26
№3	2	2	1	1	3	3	3	2	3	1	0	1	3	3	3	1	3	3	38
№4	1	1	1	2	2	2	1	2	2	1	1	1	3	3	3	2	2	1	31
№5	2	2	1	3	1	3	3	3	3	2	2	1	3	3	2	1	2	2	39
№6	1	1	1	2	2	2	2	3	3	2	0	1	3	3	3	1	1	1	32
№7	2	3	1	3	3	3	3	3	3	2	1	1	3	3	2	1	3	2	42
№8	1	2	1	1	1	2	2	2	2	1	1	0	2	2	2	1	0	0	23
Сумма: Total:	12	15	8	16	14	21	19	21	22	13	19	6	22	21	19	10	13	10	271

Примечание. Баллами отмечена тяжесть патологоанатомических изменений, где 0 – их отсутствие, а 3 – самая тяжелая степень. 0 баллов отмечены зеленым цветом, 1 балл – желтым, 2 балла – оранжевым, 3 балла – красным.

Note. Scoring scale from 0 to 3 is used to indicate the severity of pathological changes, where 0 indicates absence of any pathological changes and 3 indicates the highest degree. 0 is marked green, 1 – yellow, 2 – orange, 3 – red.

 

Из данных таблицы 3 видно, что сумма баллов, полученная при оценке тяжести проявления патологоанатомических изменений, составляла в диапазоне от 23 до 42 баллов. Наиболее характерные изменения регистрировали в селезенке (кровенаполнение от умеренного до выраженного, от незначительной до выраженной гиперплазия), лимфатических узлах (до значительной гиперплазии, сопровождающейся геморрагическим лимфаденитом) и почках (развитие обширного геморрагического диатеза).

Помимо вышеназванных патологоанатомических изменений, отмечали отек легких, пневмонию разной степени тяжести, кровоизлияния под плеврой и в слизистой оболочке желчного пузыря, зернистую дистрофию печени, кровоизлияния в слизистой оболочке мочевого пузыря, а также признаки плеврита и перитонита.

Значения Ct и титра вируса в пробах органов и тканей от каждого из животных, полученные с помощью методов ПЦР-РВ и вирусовыделения, представлены в таблице 4.

 

Таблица 4. Результаты исследования проб органов и тканей методами ПЦР-РВ и вирусовыделения (n = 3)

Table 4. qPCR and virus isolation (VI) results of samples after necropsy (n = 3)

Образец Sample	Показатель Parameter	№ свиньи Pig #
		1	2	3	4	5	6	7	8
Почка Kidney	Сt	18,27	12,24	8,66	13,36	12,28	14,46	12,1	16,62
	T	4	5,7	7,3	5,4	5,7	5	5,8	4,4
Печень Liver	Сt	13,43	13,07	9,59	21,93	12,39	18,19	12,46	18,18
	T	5,3	5,4	6,8	3,2	5,7	4	5,7	4
Л/у брыжеечные Mesenteric lymph nodes	Сt	18,47	11,53	6,53	18,2	9,28	14,02	14	17,36
	T	3,9	6	8,5	4	7	5,1	5,1	4,2
Легкое Lungs	Сt	12,55	13,15	7,47	17,56	10,06	10,96	11,3	13,1
	T	5,6	5,4	7,9	4,1	6,6	6,2	6,1	5,4
Селезенка Spleen	Сt	7,89	6,38	7,8	9,86	7,69	8,77	9,32	10,36
	T	7,7	8,6	7,7	6,7	7,8	7,2	6,9	6,5
Ткани колена Knee fabrics	Сt	16,46	12,79	11,32	15,46	18,41	11,44	18,04	13,34
	T	4,4	5,5	6,1	4,7	3,9	6	4	5,4
Л/у подчелюстные Submandibular lymph nodes	Сt	10,77	8,29	9,61	15,26	9,23	12,51	12	15,75
	T	6,3	7,4	6,8	4,8	7	5,6	5,8	4,6
Л/у паховые Inguinal lymph nodes	Сt	10,64	7,64	9,4	15,93	10,38	12,56	13,99	15,8
	T	6,4	7,8	6,9	4,6	6,5	5,6	5,1	4,6

Примечание. Ct – пороговый цикл амплификации; Т – титр виремии (lgГАдЕ₅₀/мл).

Note. Ct – cycle threshold; Т – titer of viremia (lgHAU₅₀/ml).

 

Как видно из данных таблицы 4, вирус АЧС и его геном обнаружены при исследовании всех проб органов. Среднее значение титра вируса в образцах органов и тканей в среднем составило 5,8 ± 1,27 lgГАдЕ₅₀/мл (n = 64) (5,95 ± 1,33 для зараженных и 5,2 ± 0,88 для контактных). Самые высокие средние значения титра получены при исследовании проб селезенки (7,4 ± 0,69 ГАдЕ₅₀/мл), а самые низкие – при исследовании проб печени (5,0 ± 1,18 ГАдЕ₅₀/мл) и тканей колена (5,01 ± 0,87 ГАдЕ₅₀/мл).

Секвенирование маркерных областей генома

Изменения нуклеотидных последовательностей в изучаемом и импортированных из системы GenBank изолятах, а также их сводная группировка представлены в приложении.

Как и ожидалось, анализ последовательности C-концевого участка гена B646L изолята ASF/Tatarstan 20/WB-12276 позволил установить его 100%-ную гомологию с референтным штаммом Georgia 2007/1 (FR682468.2), в связи с чем изучаемый изолят был отнесен ко II генотипу.

На основе нуклеотидной последовательности участка CVR гена B602L (100%-ная идентичность с референс-штаммом Georgia 2007/1) исследуемый изолят был отнесен к самой многочисленной I субгруппе, включающей изоляты выделенные на территории Московской, Калининградской и Амурской областей, Забайкальского и Приморского краев, республик Кабардино-Балкария и Адыгея Российской Федерации, а также в Польше, Литве, Молдове, Бельгии, Украине, Германии, Венгрии, Чехии, Китае, Вьетнаме и Индии.

Проведенный анализ IGR I73R/I329L позволил обнаружить дополнительный TRS из 10 нуклеотидов (GGAATATATA) к существующим 2 копиям TRS, которые встречаются в геноме вируса АЧС Georgia 2007/1, таким образом изучаемый изолят относится к группе IGR-2.

При анализе нуклеотидных последовательностей 5 альтернативных генетических маркеров (O174L, K145R, EP402R, I267L и MGF 505-5R), которые также используются в качестве мишеней для дифференциации изолятов вируса АЧС внутри одного генотипа, установили:

1. На основании гена O174L изолят ASF/Tatarstan 20/WB-12276, как и референтный штамм Georgia 2007/1, отнесены к 1-й группе.
2. Секвенирование гена K145R у исследуемого изолята позволило классифицировать его к первому кластеру совместно со штаммом Georgia 2007/1.
3. Последовательность гена EP402R оказалась идентичной для всех изолятов, в том числе исследуемого.
4. Изолят ASF/Tatarstan 20/WB-12276 имеет замену «Т» на «А» в положении 76 гена I267L, по отношению к референтной последовательности штамма Georgia 2007/1, что соответствует второму кластеру;
5. Исследуемый изолят не имеет изменений в гене MGF 505-5R в сравнении с Georgia 2007/1 и относится к I субгруппе по данному признаку.

Обсуждение

Наблюдаемая при экспериментальном заражении домашних свиней клиническая и патологоанатомическая картины болезни позволяют охарактеризовать изолят вируса АЧС ASF/Tatarstan 20/WB-12276 как высоковирулентный, способный вызывать АЧС у свиней с острым и подострым течением и гибелью до 100% зараженных внутримышечно и контактным путем животных, что сходно с клинической картиной, характерной для изученных изолятов вируса АЧС, выделенных на территории России в 2007–2018 гг., обладавших 100% летальностью для свиней [4–11].

В работе В.М. Балышева и соавт. представлены данные об изоляте вируса АЧС «Татарстан-Сосновка/2016», выделенного из биологического материала от домашней свиньи в Республике Татарстан в 2016 г., который был охарактеризован как вирулентный и способный вызывать гибель животных с признаками острого и сверхострого течения АЧС [4]. Данный изолят вызывал гибель внутримышечно и контактно инфицированных свиней на 4–6-й и 10–13-й д.п.з. соответственно.

Исходя из вышеизложенного, можно сделать предположение о некотором снижении вирулентных свойств изолята ASF/Tatarstan 20/WB-12276 при его сравнении с предыдущим (в частности, увеличение инкубационного периода и длительности течения болезни). Однако различие в полученных результатах также может быть обосновано разными способами заражения экспериментальных животных. Так, В.М. Балышев и соавт. для заражения использовали 10%-ную суспензию, приготовленную из органо-тканевого материала, в то время как в нашей работе была использована суспензия культурального материала с дозой заражения 10 ГАдЕ₅₀/гол. [4].

С помощью ПЦР-РВ было выявлено 100% инфицированных изолятом ASF/Tatarstan 20/WB-12276 животных, а первые положительные результаты при исследовании проб данным методом были получены начиная с 5-го и 12-го д.п.з. в группах зараженных и контактных свиней соответственно.

Использование ИПМ позволило выявить специфические антитела к вирусу АЧС начиная с 12-го и 16-го д.п.з. Аналогичные данные получены A. Pershin и соавт. при изучении биологических свойств изолятов вируса АЧС, происходящих из разных регионов РФ в 2013–2018 гг., где доля обнаружения специфических антител была выше при исследовании проб сыворотки крови от контактных животных, чем от инфицированных внутримышечно, и составила 100% (2 из 2 голов) и 33% (2 из 6 голов) соответственно [8].

При использовании ТФ-ИФА положительные результаты были получены при исследовании только двух образцов сыворотки (по одной от зараженного и контактного животных), что может быть связано с преимущественно быстрой гибелью зараженных свиней (до 13 д.п.з.) и меньшей чувствительностью данного метода диагностики, по сравнению с ИПМ [33–36].

Исследование методом ПЦР-РВ рекомендованных Всемирной организацией здоровья животных (селезенка, легкие, почки, лимфатические узлы) и альтернативных образцов (ткани колена) позволило выявить 100% инфицированных животных [37]. Однако при исследовании пробы печени от одного животного был получен сомнительный результат, что было связано с низкой вирусной нагрузкой в ткани данного органа (титр вируса составил 3,2 ГАдЕ₅₀/мл).

Секвенирование генома исследуемого изолята по наиболее значимым (C-концевой участок гена B646L, CVR гена B602L, межгенная область IGR I I73R/I329L) и альтернативным (O174L, K145R, EP402R, I267L, MGF 505-5R) геномным маркерам показало, что ASF/Tatarstan 20/WB-12276 имеет сходную характеристику с референс-штаммом Georgia 2007/1 и другими изолятами, выделенными на территории РФ, за исключением вариантов, циркулирующих в Калининградской области.

Использование последовательностей гена EP402R, C-концевого участка гена B646L и CVR гена B602L обладало низкой разрешающей способностью. Так, все изоляты (за исключением вируса из Ульяновской области РФ) обладали 100%-ной гомологией с референтным штаммом Georgia 2007/1.

В зависимости от числа TRS из 10 нуклеотидов (GGAATATATA) в IGR I73R/I329L, используемые изоляты вируса АЧС II генотипа разделяются на 4 группы:

1-я группа – изоляты, содержащие 2 TRS (напр. Georgia 2007/1);

2-я группа – 3 TRS, характерные для подавляющего числа Европейских и Азиатских изолятов, в том числе и ASF/Tatarstan 20/WB-12276;

3-я группа – представлена изолятом из КНР (China/Guangxi/2019), содержащим 4 TRS;

4-я группа – изоляты из Польши, содержащие 5 TRS [25, 26].

Наличие «А» в положении 76 гена I267L у изолята ASF/Tatarstan 20/WB-12276 позволило отнести его ко 2-й, преобладающей группе.

Изменения в генах O174L, K145R и MGF 505-5R были зафиксированы у некоторых вирусов из Германии, Польши, Украины и Калининградской области РФ, в то время как у большинства остальных изолятов, в том числе изучаемого, изменения отсутствовали.

TRS из 14 п.н. (TCACTACTGAAAAA) в положении 50–63 гена O174L обнаружена у изолятов, циркулирующих на территории Польши (2017–2019 гг.) и Германии (2020 г.).

Замены «С» на «А» в положении 173 гена K145R и «G» на «А» в положении 84 гена MGF 505-5R обнаружены для изолятов из Польши (2016–2019 гг.), Украины (2016 г.), Германии (2020 г.) и Калининградской области РФ (2017–2019 гг.). Замена «С» на «Т» в положении 30 гена K145R – только для изолятов из Калининградской области РФ (2017–2019 гг.).

Таким образом, анализ по выбранным маркерам показал генетическое родство изучаемого изолята ASF/Tatarstan 20/WB-12276 с большинством изолятов из Европы и Азии, выделенными за период с 2017 по 2020 г.

Выводы

Впервые изучены молекулярно-биологические свойства изолята вируса АЧС ASF/Tatarstan 20/WB-12276, выделенного из селезенки от отстрелянного дикого кабана на территории Республики Татарстан. Изолят охарактеризован как высоковирулентный, способный вызывать острую и подострую форму течения инфекции. Летальность у зараженных животных составила 100%.

Подтверждена первостепенная важность проведения пассивного эпизоотологического надзора с регулярным отбором и исследованием строго рекомендованных проб от всех животных с признаками болезни с исследованием образцов прямыми методами диагностики (обнаружение вируса, его генома, антигена) [38].

Однако, в случаях, когда вирус АЧС циркулирует в восприимчивой популяции длительное время (например, более полугода), прямые методы исследований рационально дополнять косвенными (на обнаружение антител), в первую очередь при исследовании проб от отловленных и отстрелянных диких кабанов.

На основе анализа нуклеотидных последовательностей IGR I73R/I329L изолятов вируса АЧС, вариант ASF/Tatarstan 20/WB-12276 отнесли к группе IGR-2. Дифференциальный анализ по генетическому маркеру в гене I267L (замена тимина на аденин в положении 76 настоящего гена, относительно последовательности референтного штамма Georgia 2007/1), позволил отнести изучаемый изолят к группе I267L-2. При анализе 7 остальных генетических маркеров (в генах EP402R, O174L, K145R, MGF 505-5R, С – конце гена B646L и CVR) изменения обнаружены не были [28].

Таким образом, с целью дифференциации и изучения дальнейшей динамики молекулярной эволюции циркулирующих на территории РФ, в том числе Республики Татарстан, изолятов вируса АЧС, необходимо направлять образцы, оказавшиеся положительными или сомнительными при их исследовании в региональных лабораториях, в референтную лабораторию по АЧС ФГБУ «ВНИИЗЖ» для подтверждения диагноза и проведения научно-исследовательских работ методом секвенирования наиболее значимых и альтернативных в молекулярно-эпизоотологическом отношении генов с проведением последующего филогенетического анализа.

 

¹ Методические рекомендации по выделению и титрованию вируса африканской чумы свиней в культуре клеток селезенки свиней / Али Мазлум, Д.В. Шарыпова, В.Л. Гаврилова, О.С. Пузанкова, И.Ю. Жуков [и др.]; ФГБУ «ВНИИЗЖ». – Владимир, 2019. – 24 с.

² Методические рекомендации по постановке биопробы с заражением свиней вирусом африканской чумы свиней / И.В. Шевченко, И.Ю. Жуков А.С., Першин [и др.]; ФГБУ «ВНИИЗЖ». – Владимир, 2017. – 11 с.

³ Методические указания по оценке клинических признаков и патологоанатомических изменений при экспериментальном заражении вирусом африканской чумы свиней / ФГБУ «ВНИИЗЖ». – Владимир, 2017. – 21 с.

⁴ Blocking Immunoenzymatic assay for detection of antibodies to African Swine Fever virus (ASFV) in porcine serum. Ingezim PPA COMPAC. Prod Ref: 11.PPA.K3. Last revision: 18-12-18. Ingenasa, Madrid, Spain

⁵ Тест-система для выявления антител к вирусу африканской чумы свиней (АЧС) в сыворотке и плазме крови, мясном соке и образцах крови, нанесенных на бумажные фильтры, непрямым иммуноферментным методом ELISA. ID Screen, African Swine Fever Indirect, Screening Test. ASFS версия0115 RU. IDvet, Франция. 4 стр.

⁶ Методические рекомендации по выявлению антител к вирусу африканской чумы свиней иммунопероксидазным методом / А.С. Першин, Т.Н. Комова, А.Р. Шотин [и др.] ФГБУ «ВНИИЗЖ». – Владимир, 2020. – 12 с.

⁷ Инструкция по применению тест-системы «АЧС» для выявления вируса африканской чумы свиней методом полимеразной цепной реакции (обновление от 19.05.2021)

About the authors

Andrey R. Shotin

Federal Center for Animal Health (ARRIAH)

Author for correspondence.
Email: shotin@arriah.ru
ORCID iD: 0000-0001-9884-1841

Candidate of Science (Veterinary Medicine), Researcher, Reference Laboratory for African Swine Fever

Russian Federation, 600901, Vladimir

Roman S. Chernyshev

Federal Center for Animal Health (ARRIAH)

Email: chernishev_rs@arriah.ru
ORCID iD: 0000-0003-3604-7161

Postgraduate Student, Veterinarian, Reference Laboratory for African Swine Fever

Russian Federation, 600901, Vladimir

Elizaveta O. Morozova

Federal Center for Animal Health (ARRIAH)

Email: morozova_eo@arriah.ru
ORCID iD: 0000-0002-0955-9586

Postgraduate Student, Biologist, Reference Laboratory for African Swine Fever

Russian Federation, 600901, Vladimir

Alexey S. Igolkin

Federal Center for Animal Health (ARRIAH)

Email: igolkin_as@arriah.ru
ORCID iD: 0000-0002-5438-8026

Candidate of Science (Veterinary Medicine), Head of Reference Laboratory for African swine fever

Russian Federation, 600901, Vladimir

Konstantin N. Gruzdev

Federal Center for Animal Health (ARRIAH)

Email: gruzdev@arriah.ru
ORCID iD: 0000-0003-3159-1969

Doctor of Science (Biology), Professor, Chief Researcher, Information and Analysis Centre

Russian Federation, 600901, Vladimir

Ivan S. Kolbin

Federal Center for Animal Health (ARRIAH)

Email: kolbin@arriah.ru
ORCID iD: 0000-0003-4692-1297

Postgraduate Student, Veterinarian, Reference Laboratory for African Swine Fever

Russian Federation, 600901, Vladimir

Ivan A. Lavrentiev

Federal Center for Animal Health (ARRIAH)

Email: lavrentev@arriah.ru
ORCID iD: 0009-0003-0552-3812

Postgraduate Student, Leading Veterinarian, Reference Laboratory for African Swine Fever

Russian Federation, 600901, Vladimir

Ali Mazloum

Federal Center for Animal Health (ARRIAH)

Email: mazlum@arriah.ru
ORCID iD: 0000-0002-5982-8393

Candidate of Science (Biology), Senior Researcher, Reference Laboratory for African Swine Fever

Russian Federation, 600901, Vladimir

References

Supplementary files