Real-time PCR kits for the detection of the african swine fever virus

Full Text

Введение Африканская чума свиней (АЧС) является высококонтагиозным вирусным заболеванием диких и домашних свиней всех пород и возрастов. Обладает способностью к быстрому распространению за пределы национальных границ, наносит огромный экономический ущерб свиноводству с серьезными социально-экономическими последствиями, имеет большое значение для международной торговли животными и животноводческой продукцией [1-3]. Возбудитель АЧС - вирус, ранее относящийся к семейству Iridoviridae, в настоящее время является единственным представителем рода Asfivirus семейства Asfarviridaе. Это единственный ДНК-содержащий арбовирус, геном которого представлен двуспиральной ДНК размером от 170 до 190 т.п.н. [1, 4- 7]. Вирус устойчив к воздействию различных физических и химических факторов и может сохраняться в трупах свиней, биологическом материале и объектах внешней среды до 5 мес. Заражение животных происходит при совместном содержании больных и здоровых свиней, а также при контакте с дикими кабанами. Течение болезни может быть сверхострое, острое, подострое и хроническое. Вирусоносительство длится до двух лет и более. Из организма животного вирус выделяется с мочой, фекалиями, секретом конъюнктивы, носовой и ротовой слизью, загрязняя корм, воду, окружающие предметы, воздух и совместно обитающих животных [3, 8-10]. Для выявления вирусоносителей и резервуара вируса в дикой природе следует проводить ежемесячные мониторинговые исследования каловых масс диких кабанов на наличие возбудителя. Необходимо систематически исследовать пробы почвы и воды свиноводческих хозяйств, соседствующих с очагами инфекции, а также пробы с совместно обитающих животных, которые могут являться механическими переносчиками вируса [3, 11]. Первичная диагностика АЧС включает выделение вируса в культуре клеток, идентификацию методом реакции прямой иммунофлюоресценции и выявление вируса методом биопробы. Такие методы являются длительными, дорогостоящими и требуют особых условий проведения и содержания животных, а также навыков оператора [9]. На сегодняшний день актуальной является проблема совершенствования методов диагностики АЧС, направленных на оперативное выявление очагов возбудителя и путей Разработанная тест-система ПЦР-РВ Исследуемый материал Культуральный вирус АЧС: исх. 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10 + + + + + + + + + распространения инфекции [11]. Быстрая и своевременная диагностика АЧС является определяющим фактором комплекса ветеринарно-санитарных и профилактических мероприятий, направленных на локализацию, ликвидацию и предупреждение дальнейшего распространения болезни [12, 13]. Применение высокочувствительного молекулярного метода полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) позволяет быстро и эффективно выявить ДНК АЧС в различном биологическом материале. Цель исследования - разработать диагностическую тест- систему на основе ПЦР-РВ для быстрого и эффективного выявления ДНК вируса АЧС в органах и тканях от больных, павших или вынужденно убитых свиней, а также от диких животных. Материалы и методы Вирусы, исследуемые образцы. В работе использовали вирулентные штаммы вируса АЧС и образцы органов и тканей от животных, предоставленные ГБУ «Кропоткинская краевая ветеринарная лаборатория» Краснодарского края (г. Кропоткин) и Европейской референтной лабораторией OIE (Мадрид, Испания). Также использовали вакцинный штамм КС, предоставленный проф. В.А. Сергеевым; цирковирус свиней 2-го типа (ЦВС-2) штамм ISU-31, вирус репродуктивнореспираторного синдрома свиней (РРСС), штаммы Lelystad, NADC-2, предоставленные В. Менгелингом (NADC, Iowa, США). В качестве положительного контроля ПЦР-РВ применяли рекомбинантную плазмиду, содержащую фрагмент гена белка VP72 вируса АЧС. Праймеры и зонды. Последовательности синтетических олигонуклеотидов (праймеров и зонда) для амплификации и выявления фрагмента ДНК АЧС разрабатывали с использованием компьютерных программ Assembly Lign (Oxford Molecular Group PLC, США), Amplify, версия 1.0 (University of Wisconsin, США); Oligo, версия 4.0 (США). Зонд метили на 5’-конце флюорофором FAM и на 3’-конце гасителем флюоресценции BHQ1. Выделение вирусной ДНК. Выделение ДНК АЧС из биологических образцов проводили с использованием неорганического сорбента, применяемого в диагностических наборах «ООО Ветбиохим» (Россия), и набора для выделения ДНК на колонках mini spin Quick-gDNA™ MiniPrep (Zymo Research, США). Оптимизация проведения ПЦР-РВ. Реакцию для наработки фрагмента ДНК проводили в объеме 25 мкл. Реакционная смесь для ПЦР-РВ содержала 5 мкл ДНК, 10 пмоль каждого праймера, 5 пмоль зонда, 0,25 мЫ каждого dNTP, 1,25 ед. Taq-полимеразы, 10 мИ Tris-HCl (рН 9,0), 50 мИ KCl, 0,1% Triton X-100, 1,5 мН MgCl2. ПЦР-РВ проводили на приборе ДТ-96 («ДНК-Технология», Россия). Использовали следующий температурный режим: 50°С - 2 мин; 95°С - 10 мин; затем 40 циклов, включающих денатурацию при температуре Таблица 1 Сравнительная чувствительность с использованием культурального вируса АЧС Референтный набор реагентов (OIE, Мадрид, Испания) + + + + + + + + + Рис. 2. Выявление вируса АЧС в образцах органов и тканей животных с помощью ПЦР-РВ и конкурентного ИФА. Здесь и на рис. 2: 1 - селезенка, 2 - кровь. 95°С в течение 15 с, отжиг праймеров при температуре 58°С в течение 1 мин. Регистрацию флюоресцентного сигнала специфического продукта амплификации проводили при 58°С на канале FAM. Результаты отображались на экране монитора компьютера в виде графика зависимости интенсивности сигнала флюоресценции от номера цикла реакции. Результаты и обсуждение Африканская чума свиней наряду с высокой контагиоз- ностью обладает способностью быстро принимать размер эпизоотии и панзоотии и наносит огромный экономический ущерб свиноводству. В связи с этим основным критерием при ликвидации очага инфекции является оперативность постановки диагноза и реализации противоэпизоотических мероприятий. Стратегия контроля и искоренения АЧС включает в том числе раннее распознавание, лабораторное подтверждение и мониторинг АЧС в дикой природе. Высокочувствительный метод ПЦР-РВ позволяет быстро и эффективно выявлять возбудителя АЧС при вспышке инфекции, на ранних стадиях болезни, при неярко выраженной клинической картине, а также хронических носителей при мониторинге АЧС. В процессе разработки тест-системы на основе ПЦР-РВ для выявления ДНК АЧС были подобраны специфические праймеры и зонд, оптимизирован температурно-временной режим проведения ПЦР-РВ. Быстрота и эффективность выявления ДНК являются основным критерием постановки диагноза. В связи с этим для выделения ДНК АЧС из патматериала применяли твердофазный метод выделения на неорганическом сорбенте и 7 -| 654 321 0 1 2 |§ АНО “НИИ ДПБ” (г. Москва) ^ ГНУ “ВНИИ ВВиМ” Россельхозакадемии (г. Покров) Рис. 1. Выявление ДНК АЧС в образцах органов и тканей ж Разработанная тест-система ПЦР-РВ Исследуемый материал + + + Таблица 2 Специфичность разработанной тест-системы Референтный набор реагентов (OIE, Мадрид, Испания) Культура клеток: зараженная АЧС зараженная КЧС зараженная ЦВС-2 зараженная РРСС 20% суспензия: селезенка № 1 лимфоузлы селезенка № 2 почка Цельная кровь 20% суспензия селезенки №3 20% суспензия селезенки №4 его модификацию с применением спин-колонок на силика- гелевой матрице. Определили, что модификация метода выделения ДНК с применением спин-колонок более эффективна, чем выделение на неорганическом сорбенте, поскольку существенно ускоряет процесс выделения, снижает потери и увеличивает выход суммарной ДНК. Также эта методика проста в исполнении и требует меньшего количества реагентов и расходных материалов. В дальнейшем в работе использовали ДНК АЧС, выделенную данным способом. В случае хронического течения инфекции, а также при инфекциях смешанной этиологии, особенно в сочетании с классической чумой свиней (КЧС), необходима высокая чувствительность и специфичность детекции ДНК АЧС. Исследование чувствительности разработанной ПЦР тест-системы проводили с использованием 10-кратных раз- ведений культурального вируса АЧС. Пределом чувствительности считали последнее разведение вируса, при котором наблюдается увеличение роста кривой флюоресценции. При оценке чувствительности выяснили, что разработанная тест-системы выявляет ДНК АЧС в разведении до 10'8. Также провели сравнение чувствительности разработанной тест- системы с референтным набором реагентов для определения ДНК АЧС методом ПЦР-РВ {ОIE, Испания). Результаты, представленные в табл. 1, показывают, что чувствительность разработанной тест-системы не уступает международной референтной системе выявления ДНК АЧС. При исследовании специфичности разработанной тест- системы использовали культуральный вирус АЧС, а также культуральные вирусы, вызывающие сходные по клиническими признакам заболевания, такие как КЧС, ЦВС-2, РРСС; цельную кровь и 20% суспензию органов от больных, павших и вынужденно убитых свиней. Исследование специфичности проводили в сравнении с референтным набором реагентов (OIE, Испания). Установили 100% специфичность выявления вируса АЧС (табл. 2). С помощью разработанной тест-системы провели исследование 19 образцов органов и тканей животных, в том числе цельной крови от здоровых и больных свиней, и 20% суспензии селезенки от больных, павших и вынужденно убитых свиней. В качестве сравнения использовали тест-систему для выявления ДНК вируса АЧС методом ПЦР-РВ производства ГНУ «ВНИИ ВВиМ Россельхозакадемии» (г. Покров). Результаты представлены на рис. 1. Также сравнили результаты обнаружения ДНК АЧС методом ПЦР-РВ с результатами обнаружения антигена вируса АЧС методом конкурентного ИФА, полученными с помощью тест-системы ИФА «АЧС-CEPOTECT/INGEZIM РРА СО- МРАС». Исследования проводили с использованием панели образцов, описанной выше. Полученные результаты продемонстрировали высокую корреляцию с данными конкурентного ИФА (рис. 2). При проведении исследований разработанная тест-система на основе ПЦР-РВ производства АНО «НИИ ДПБ» (Россия) показала высокую степень обнаружения ДНК АЧС в различном материале от животных. В результате исследований разработана диагностическая тест-система на основе метода ПЦР-РВ, которая отличается высокой активностью и специфичностью. Тест-система успешно прошла комиссионные испытания, зарегистрирована в РФ, организовано ее серийное производство. Данная тест-система может применяться в широкой ветеринарной практике для эффективного мониторинга вируса АЧС с целью локализации, ликвидации и предупреждения дальнейшего распространения болезни.

References

Supplementary files