A Study of the antiherpetic activity of the chaga mushroom (Inonotus obliquus) extracts in the Vero cells infected with the herpes simplex virus

Full Text

Введение Березовый гриб, известный на Руси как чага, с древних времен используется в народной медицине [1]. Впервые чага всесторонне изучена в СССР специалистами Ботанического института им. В.Н. Комарова АН СССР и Первого Ленинградского медицинского института им. И.П. Павлова в середине XX столетия (П.К. Булатов, М.П. Березина, Г.А. Якимов, Е.Я. Мартынова и др.). Эти исследования не потеряли своей актуальности до настоящего времени [2, 3]. Лечебными свойствами обладает та чага, которая растет на березе. Для медицинских целей используют только гриб, растущий на живых стволах. Чага распространена в европейской части России, Западной Сибири, на Дальнем Востоке, Северном Кавказе и Урале [4, 5]. Особенностью этого гриба-паразита является высокое содержание биологически активных веществ. Их идентификация и выделение до настоящего времени изучены мало. Известно лишь то, что основная масса их относится к так называемым полифенол-карболовым кислотам, в чаге также содержатся жирные кислоты, полисахариды, лигнин, клетчатка, стерины [6]. Установлено, что чага повышает защитные реакции организма, активизирует обмен веществ в мозговых тканях, снижает артериальное и венозное давление, оказывает противовоспалительное действие не только при внутреннем, но также и при наружном применении. Наибольшую известность получил водный экстракт чаги в качестве противоопухолевого средства [6]. Такой широкий спектр биологической активности позволил предположить наличие в чаге противовирусных свойств. На это указывают и данные японских исследователей, установивших эффект ингибирования протеазы ВИЧ [7]. Нами были получены экстракты из березового гриба с использованием различных схем экстракции, которые были испытаны на их способность оказывать противовирусное действие. Материалы и методы. Получение экстрактов чаги. Наружный слой березового гриба, собранного в Подмосковье, подвергался измельчению и экстракции. Были разработаны различные схемы экстракции. Вирус. В качестве модельного вируса использовали вирус простого герпеса (ВПГ), 1-го типа (ВПГ-1) штамм Л2, полученный из Государственной коллекции вирусов ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского». Вирус культивировали в перевиваемых клетках Vero. Титр вируса 4,5 lg ТЦИД50. Клетки. Исследования проводили в перевиваемой культуре фибробластов почки зеленой мартышки (Vero). Клетки культивировали в 96-луночных культуральных планшетах в среде Игла МЕМ с 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (Панэко). Критерии определения противовирусного действия. Противовирусную активность экстрактов чаги определяли цитомикроскопическим методом по степени защиты инфицированных клеточных культур от цитодеструк-тивного действия 100 ТЦИД50 /0,2мл вируса герпеса ( от 0 до 100% - полная защита). В качестве подтверждающего теста отсутствия репликации ВПГ использовали полимеразную цепную реакцию. Схема получения экстрактов из березового гриба Inonotus obliquus Inonotus obliquus (сухой, 3 г) Экстракция NH4OH 10%, 20°С Экстракт Центрифугирование, фильтрация Раствор 1 Вакуум-выпаривание Фракция 1 (0,96 г) 100 Рис. 2. Противогерпетический эффект разной концентрации фракции IV. По оси ординат - степень (в %) защиты клеток от цитодеструктивного действия ВПГ-1; по оси абсцисс - концентрация (в мкг/мл) экстракта чаги. Результаты и обсуждения Получение экстрактов чаги. Для получения экстрактов чаги использовали следующую общую схему: из измельченного и высушенного верхнего слоя гриба проводили экстракцию различными растворителями. Полученный экстракт центрифугировали, фильтровали и выпаривали под вакуумом (рис.1). По такой схеме были получены водные, спиртовые, щелочные и кислотные экстракты. Определение цитотоксичности экстрактов чаги. Полученные фракции чаги испытывали на токсичность для клеток Vero. Для этого на монослой клеток вносили водные растворы экстрактов в концентрации 5, 10 или 50 мкг/мл и инкубировали в течение 48 ч при 370С и 5% СО2. Все испытанные экстракты, за исключение одного (табл.1), в концентрации до 50 мкг/мл не оказывали токсического действия на культуру клеток Vero. Фракция, полученная спиртовой экстракцией, в концентрации 50 мкг/мл вызывала деструкцию клеток. Таблица 1 Цитотоксическое действие различных фракций экстрактов чаги Таблица 2 Противогерпетический эффект фракций экстрактов чаги Способ получения фракции Иссле дуемая фракция Цитодеструктивное действие фракций на клетки, % 5 мкг/мл 10 мкг/мл 50 мкг/мл Водная экстракция I 0 0 0 II 0 0 0 Спиртовая экстракция (этиловым спиртом) III 0 0 100 Щелочная экстракция (гидроксидом аммиака) IV 51 53 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Экстракция гидрокарбонатом аммония V 52 0 0 0 0 0 0 54 0 0 0 Экстракция уксусной кислотой VI VII 0 0 0 0 0 0 Исследование противогерпетической активности экстрактов чаги. Исследование противовирусной активности проводили при внесении фракций чаги на монослой клеток за 2 ч до инфицирования вирусом -оптимальная схема для выявления противовирусных свойств большинства противовирусных агентов при проведении скрининга. Определяли способность экстрактов в концентрации 5, 10 и 50 мкг/мл (спиртовой экстракт 5 и 10 мкг/мл) защищать клетки от цитоде-структивного действия 100 ТЦИД50 ВПГ. Как видно из представленных данных (табл. 2), уже при концентрации 5 мкг/мл большинство фракций экстрактов обеспечивает защиту клеток от 87,5 до 100%. Исключение составляют фракции, полученные экстракцией кислотой. Однако при концентрации 50 мкг/мл все фракции обеспечивали полную защиту клеток от цитодеструк-тивного действия ВПГ. Таким образом, фракции чаги, полученные водной и щелочной экстракцией, обладали наиболее выраженными противогерпетическими свойствами. Ниже представлены данные, полученные при исследовании фракции 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0- -2 ' -1 ' 0 ' 1 ' 2 ' Щ 5 мкг/мл О 10 мкг/мл Щ] 50 мкг/мл Рис. 3. Зависимость защитного эффекта экстракта чаги (фракция IV) от времени введения относительно инфицирования клеток ВПГ-1. По оси ординат - степень (в %) защиты клеток; по оси абсцисс - время (в ч) введения фракции чаги относительно времени инфицирования. Способ получения фракции Иссле дуемая фракция Степень защиты клеток от цитодеструктивного действия ВПГ, % 5 мкг/мл 10 мкг/мл 50 мкг/мл Водная экстракция I 91,66 93,75 100 II 100 100 100 Спиртовая экстракция (этиловым спиртом) III 87,5 100 Н.и. Щелочная экстракция (гидроксидом аммиака) IV 51 53 100 89,58 87,5 100 100 100 100 100 100 Экстракция гидрокарбонатом аммония V 52 100 25 100 93,75 100 100 54 6,25 81,25 100 Экстракция уксусной кислотой VI VII 6,25 0 75 0 100 100 Примечание. Н.и. - не исследовали. IV, полученной щелочной экстракцией 10% раствором гидроксида аммиака. Определение эффективной дозы фракции IVэкстракта чаги. Исследовали эффективность защиты клеток Vеro при одновременном инфицировании клеток 100 ТЦИД50 вируса герпеса и внесении экстракта чаги в концентрациях 0,3, 1, 3,3, 10 и 33,3 мкг/мл. Полученные результаты представлены на рис.2. Таким образом, ЭД50 составила 3,3 мкг/мл, а ЭД90 - 10 мкг/мл. Исследование оптимальных схем защитного действия экстрактов чаги, фракция IV Исследовали эффективность защитного действия фракции IV экстракта чаги при внесении его в клеточную культуру клеток Vero в различное время по отношению ко времени инфицирования клеток вирусом герпеса в дозе 100 ТЦИД50. Экстракт чаги вносили за 2 или 1 ч до инфицирования клеток, одновременно с инфицированием или через 1 или 2 ч после него. Введение экстракта чаги до инфицирования клеток (за 2 или 1 ч) и одновременно с инфицированием обеспечивало полную защиту клеток от цитодеструктивного действия ВПГ (рис.3) при всех использованных концентрациях экстракта, и ДНК вируса герпеса не обнаруживалась. При внесении экстракта чаги (фракция IV) через час после инфицирования защита составляла 70,83% при дозе 5 мкг/мл, 91,67% при дозе 10 мкг/мл и 100% при дозе 50 мкг/мл. При внесении экстракта чаги через 2 ч после заражения защита клеток от цитодеструктивного действия вируса герпеса была еще меньше : при дозе 5 и 10 мкг/мл - менее 50% ( 45,83 и 47,92% соответственно). При дозе 50 мкг/мл защита клеток приближалась к 100% и составила 93,75%. Таким образом, максимальный защитный эффект экстракта чаги (фракция IV) наблюдается при профилактическом его применении при сохранении дозовой зависимости. Противовирусная активность фракции IV экстракта чаги была исследована в течение 10 нед, хранение при комнатной температуре в темноте не приводило к снижению противовирусной активности. Заключение Разработанные схемы получения экстрактов березового гриба Inonotus obliquus показали, что фракции верхнего слоя березового гриба (чага), полученные водной, 47 спиртовой или щелочной экстракцией, обладают способностью защищать чувствительные клетки от цитоде-структивного действия ВПГ. Более детально изученная фракция IV, полученная щелочной экстракцией, обладала способностью защищать клетки при концентрации 5 мкг/мл. Максимальный защитный эффект наблюдали при внесении экстрактов до инфицирования клеток или в течение часа после него. Проведенные исследования показали, что березовый гриб Inonotus obliquus, имеющий широкий спектр биологической активности, в том числе и противоопухолевой [8, 9, 10], также обладает и противовирусной активностью в отношении ДНК- содержащего вируса - ВПГ.

References

Supplementary files