The supression of a Herpes simplex virus reproduction with drug resistance by combination 15lys-bis-nt and Phosphate of acycloguanosine with some antiherpetic drugs

Full Text

Этиотропная лекарственная терапия инфекционных заболеваний, вызываемых вирусом простого герпеса 1- го и 2-го типа (ВПГ-1 и ВПГ-2), базируется на препаратах, относящихся к классу модифицированных нуклео- зидов. Прежде всего это препараты ацикловира (ацикло- гуанозин, АЦГ) и его предлекарства - валинового эфира АЦГ (валацикловир, валтрекс), а также предлекарство пенцикловира (ПЦВ) - фамцикловир (фамвир) [1]. Механизм действия соединений этой группы заключается в следующем. Превращаясь в клетке в нуклеозидтрифос- фаты, они, конкурируя с природными нуклеотидами, селективно включаются в синтезирующуюся цепочку вирусной ДНК, что приводит к прекращению ее синтеза по терминационному механизму [2]. Формирование лекарственной резистентности ВПГ к этому классу соединений является фактором, лимитирующим их применение. У иммунокомпетентных пациентов частота изоляции резистентных к АЦГ и ПЦВ штаммов ВПГ-1 и ВПГ-2 невысока - не более 0,5%. Однако следует учитывать чрезвычайно широкое распространение ВПГ: около 90% населения Земного шара имеют антитела к ВПГ [3, 4]. Поэтому число иммуно- компетентных пациентов, от которых удается изолировать АЦГ-резистентные штаммы ВПГ, достаточно велико - более 30 млн. У иммунокомпромиссных пациентов частота выделения АЦГ-резистентных штаммов ВПГ существенно выше - от 2 до 30%. Изоляция таких штаммов часто коррелирует с неэффективностью лечения [5-8]. Сходство механизмов действия АЦГ и ПЦВ обусловливает перекрестный характер лекарственной резистентности ВПГ-1 и ВПГ-2 к этим антивирусным агентам: при значительном снижении чувствительности вируса к АЦГ параллельно снижается чувствительность к ПЦВ [8, 9]. Поэтому поиск соединений, способных эффективно ингибировать репродукцию АЦГ/ПЦВ-резистентных штаммов ВПГ, несомненно, представляет собой актуальную задачу. Использование комбинаций препаратов с различным механизмом действия является эффективной стратегией воздействия на вирусную инфекцию. Рациональность такого подхода убедительно доказана результатами многочисленных клинических исследований эффективности комбинированной лекарственной терапии ВИЧ- инфекции и СПИДа [10-12] и инфекций, вызываемых вирусами гепатита В и С [13, 14]. Такая стратегия позволяет не только свести к минимуму токсический эффект лекарственных препаратов благодаря возможности снижения их доз при комбинированном использовании, но и предотвратить или существенно снизить скорость формирования штаммов вирусов, резистентных к соединениям, включенным в комбинацию [15]. Наши многолетние исследования связаны с поиском антивирусных агентов, одинаково эффективно ингибирующих репродукцию штаммов ВПГ-1, как чувствительных, так и резистентных к АЦГ и другим модифицированным нуклеозидам. В настоящей работе представлены два таких соединения, относящихся к различным химическим классам - фосфит АЦГ (Ф-АЦГ, Н-фосфонат АЦГ) [16-18] и производное бис-нетропсина 15Lys-bis- Nt [19-22]. Целью настоящего исследования стало изучение возможности воздействия на репродукцию штаммов ВПГ-1, резистентных к АЦГ, с помощью Ф-АЦГ и 15Lys-bis-Nt при их использовании в комбинации с известными анти- герпетическими агентами, механизм действия которых не зависит от вирусной тимидинкиназы (ТК). Это первый опыт изучения эффективности тройных комбинаций противогерпетических соединений с различным механизмом действия. Материалы и методы Препараты. В работе использовали следующие препараты: 15Lys-bis-Nt, синтезированный в Институте молекулярной биологии; а-интерферон (а-ИФН, реаферон- ЕС для инъекций сухой, ЗАО «Вектор-Медика», лиофильный препарат а-ИФН со специфической активностью 3 млн МЕ/амп. (пос. Кольцово Новосибирской области); фосфономуравьиная кислота (Sigma Aldrich, США); АраА (9-р^-аденинарабинозид, видаробин) (Calbiochem, США); цидофовир ^)-1-(3-гидрокси- 2- фосфонилметоксипропил) цитозин (Sigma Aldrich, США); глицирризинат аммония однозамещенный (гли- цирам, Glycyram, производства «Химфарм ОАО», Казахстан); рибавирин (1-Р^-рибофуранозил-1,2,4-триазол- 3- карбоксамид) (ICN Switzerland AG, Швейцария). Вирусы. ВПГ-1 штамм L2 (ВПГ-1/L), получен из Государственной коллекции вирусов НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского. ВПГ-1/Ъ2/АЦГк, резистентный к ациклогуанозину (ИД50 > 100 мкг/мл), получен нами путем проведения серийного пассирования ВПГ-1^2 в градиенте концентраций АЦГ и подробно охарактеризован ранее [16, 23]. Цитотоксичность оценивали методом окрашивания клеток трипановым голубым. За величину ЦД50 принимали концентрацию, в присутствии которой погибает 50% клеток при продолжительности инкубации 72 ч [16, 17, 19, 20]. Противовирусную активность соединений и их комбинаций оценивали микрометодом по их способности защищать инфицированные клетки от гибели путем предотвращения развития вирусиндуцированного цито- патического эффекта (ЦПЭ) в соответствии с методом E. De Clercq и соавт. [24], как описано нами ранее [16, 17, 19, 20]. Монослойную культуру клеток Vero Е6, выращенную в пластиковых 96-луночных планшетах (Lin- bro, Flow laboratories, Великобритания), инфицировали с множественностью 0,1 БОЕ/кл; продолжительность инкубации составила 48 ч при 3 70C, при этом в контроле вируса развивался 95-100% ЦПЭ, т. е. ЦПЭ охватывал весь монослой клеток. Эффективность препарата количественно выражали как ИД50 и ИД95 - концентрации соединения, ингибирующие развитие вирусиндуциро- ванного ЦПЭ на 50% и практически полностью. При изучении комбинированного действия препаратов определяли их концентрации, в сочетании обеспечивающие эффекты, соответствующие ИД50 и ИД95. Антигер- петическое действие комбинаций препаратов оценивали путем вычисления индекса FIC (fractional inhibitory concentration) [25]: ИД.„соединения А в комбинации ИД.„соединения В в комбинации FIC = ------------------------------- + ИДсоединения В ИДсоединения А Результаты и обсуждение При изучении противовирусной активности 15Lys-bis- Nt, Ф-АЦГ и их комбинаций мы использовали два вирусных штамма - эталонный штамм ВПГ-1/Ци штамм ВПГ-1^2/АЦГк, глубоко резистентный к АЦГ (ИД50 > 100 мкг/мл), охарактеризованный нами ранее как ТК- штамм [16, 23]. Соответствующие результаты приведены в табл. 1, из которой следует, что 15Lys-bis-Nt ингибирует развитие вирусиндуцированного ЦПЭ обоих штаммов ВПГ-1, причем противовирусная активность этого соединения в отношении эталонного штамма ВПГ-1^2 не отличается от таковой на модели ВПГ-1/ L2/АЦГR. Противовирусная активность Ф-АЦГ в отношении обоих штаммов также хорошо сопоставима: концентрации Ф-АЦГ, в присутствии которых удается ингибировать развитие вирусного ЦПЭ на 50% по сравнению с контрольной вирусной культурой, отличались не более чем в 2 раза. Основной наиболее распространенный механизм формирования резистентности ВПГ к АЦГ связан с мутациями в гене ТК, приводящими к потере ее активности [8, 26]. ТК - фермент, осуществляющий первый этап фос- форилирования АЦГ до монофосфата, что необходимо для проявления противовирусной активности этого соединения [2]. Ф-АЦГ, являющийся производным АЦГ, эффективно ингибирует репродукцию АЦГ-резистентных штаммов ВПГ-1, мутантных по гену ТК, что связано, вероятно, с альтернативным путем превращения Ф-АЦГ в АЦГ-монофосфат [18], что делает Ф-АЦГ независимым от функциональной активности ТК. Нетропсин (Nt) и его производные имеют механизм действия, принципиально отличающийся от такового АЦГ. Связываясь в узкой бороздке ДНК с кластерами АТ-пар, эти соединения ингибируют функцию вирусспецифического белка UL9, что приводит в свою очередь к ингибированию процессов репликации/транскрипции вирусного генома [21, 22]. Поэтому активность соединений этого класса не зависит от ТК ВПГ. Ранее мы было продемонстрировали, что при использовании Nt и его бис-производных (в том числе 15Lys- bis-Nt) в комбинации с модифицированными нуклео- зидами (АЦГ, ганцикловир, бромвинилдезоксиуридин, иоддезоксиуридин) наблюдается эффект взаимодействия синергидного характера [20]. Однако эффект 15Lys-bis- Nt в комбинации с Ф-АЦГ (№9), также относящегося к классу модифицированных нуклеозидов, можно оценить лишь как аддитивный. Такое различие в степени потенцирования противовирусной активности АЦГ и Ф-АЦГ в присутствии 15Lys-bis-Nt косвенно подтверждает вывод о том, что механизмы действия этих соединений имеют определенные отличия. П р и м е ч а н и е . Здесь и в наций: 1 - на модели ВПГ-1/L' Таблица 1 Противогерпетическая активность ряда соединений, а также их комбинаций на модели ВПГ-1 c различной лекарственной чувствительностью в культуре клеток Vero E6 № п/п Соединение ЦД50, мкг/мл ИД50, мкг/мл ИД95, мкг/мл FIC Эффект 1 15Lys-bis-Nt 176 3,912 15,612 - - 2 Ф-АЦГ >1000 15,8х /31,22 31,252 /62,52 - - 3 ФМК >62,5 31,212 “А, - - 4 АраА >62,5 15,6х / 31,22 62,51,2 - - 5 ЦДВ >62,5 3,9й 15,612 - - 6 Rib >500 2501,2 5001,2 - - 7 ГЛН >1000 5001,2 >10001,2 - - 8 а-ИФН >1000 2501,2 >10001,2 - - 9 15Lys-bis-Nt+Ф-АЦГ >15,6+62,5 1,95+7,81/1,95+15,62 1,0 Аддитивный 10 15Lys-bis-Nt+ФМК 100+160 1,56+5,012 3,12+10и 0,63 Синергидный 11 15Lys-bis-Nt+АраА 100+50 1,12+3,121/1,12+6,22 2,24+6,21/2,24+12,5 0,481,2 Выраженный синергидный 12 15Lys-bis-Nt+ЦДВ >15,8+31,2 0,97+1,9512 1,95+3,91,2 0,751,2 Синергидный 13 15Lys-bis-Nt+ Rib >62,5+100 0,97+62,51,2 7,8+12512 0,751,2 Синергидный 14 ^Lys-bis-^:^ >7,8+1000 1,95+2501,2 3,9+500 1,01,2 Аддитивный 15 15Lys-bis-Nt+ а-ИФН >15,6+1000 0,97+62,51,2 1,95+1251,2 0,501,2 Синергидный 16 Ф-АЦГ + ФМК >15,6+31,25 7,8 +7,8' /15,6+7,82 15,6 + 15,6731,25+15,62 0,751/0,752 Синергидный 17 Ф-АЦГ +АраА >15,6+15,6 7,8+7,81/15,6+15,62 15,6 + 15,6731,25+31,252 1,01/1,02 Аддитивный 18 Ф-АЦГ + ЦДВ >62,5+7,8 7,8+0,97715,6+0,782 15,6+1,951/31,25+1,952 0,751/0,702 Синергидный 19 Ф-АЦГ + Rib >31,25 + 125 7,8+31,251/15,6+31,252 15,6+62,5731,25+62,52 0,751/0,752 Синергидный 20 Ф-АЦГ + ГЛН >31,2+1000 3,9 + 250715,6+2502 15,6 + 5001/31,25+5002 0,751/1,02 Синергидный/ Аддитивный 21 Ф-АЦГ + а-ИФН >40+500 10+12,51/15,6+502 40+501/31,25+1002 0,701/0,702 Синергидный табл. 2: концентрация а-ИФН в МЕ/мл; показатели противовирусной эффективности соединений и их комби- 2 - на модели ВПГП^/АЦГ12. Таблица 2 Противогерпетическая активность тройных комбинаций ряда соединений на модели ВПГ-1 c различной лекарственной чувствительностью в культуре клеток Vero E6 № п/п Соединение ЦД50, мкг/мл ИД50, мкг/мл ИД95, мкг/мл FIC Эффект 22 15Lys-bis-Nt + Ф-АЦГ + ФМК >3,9+15,6+62,5 0,97+3,9+15,61/0,97+7,8+15,62 3,9+7,8+31,21/3,9+15,6+62,52 1,012 Аддитивный 23 15Lys-bis-Nt + Ф-АЦГ + АраА >31,2+250+31,2 0,97+3,9+0,971/0,97+7,8+1,952 1,95+7,8+1,951/1,95+15,6+3,92 0,561,2 Синергидный 24 15Lys-bis-Nt + Ф-АЦГ + ЦДВ >3,9+15,6+3,9 0,97+3,9+0,971/0,97+7,8+0,482 1,95+7,8+1,951/1,95+15,6+1,951 0,75‘/0,622 Синергидный 25 15Lys-bis-Nt + Ф-АЦГ + Rib >7,8 + 15,6 +125 1,95+3,9+31,21/1,95+7,8+502 3,9+7,8+62,51/ 0,872|0,952 Синергидный 26 15Lys-bis-Nt + Ф-АЦГ + ГЛН >15,6+62,5+500 0,97+3,9+31,21/0,97+7,8+31,22 1,95+7,8+62,51/1,95+15,6+125 0,561,2 Синергидный 27 15Lys-bis-Nt+ Ф-АЦГ + а-ИФН >3,9+15,6+15,6 0,48+1,95+15,61/0,48+3,,9+15,62 1,95+7,8+15,61/1,95+15/6+15,6 0,301,2 Выраженный синергидный При проведении сравнительного анализа результатов, представленных в табл. 1 и 2, мы установили, что введение в двойную комбинацию 15Lys-bis-Nt + Ф-АЦГ третьего компонента приводит к повышению выраженности противовирусной активности. Следует отметить, что цитотоксический эффект тестируемых комбинаций соединений в исследуемом диапазоне концентраций был ниже эффекта, соответствующего ЦД50, поэтому потенцирующий противовирусный эффект этих сочетаний нельзя объяснить потенцированием цитотоксичности соединений при комбинированном использовании. Полученный противовирусный эффект не во всех случаях можно оценить однозначно положительно. Так, при введении в эту комбинацию ФМК (№ 22) так же, как и для исходной комбинации № 9 15Lys-bis-Nt + Ф-АЦГ, наблюдали аддитивный характер взаимодействия трех соответствующих компонентов. Но эффект двойных комбинаций 15Lys-bis-Nt + ФМК (№10) и Ф-АЦГ + ФМК (№ 16) оценивали как синергидный с показателями FIC 0,63 и 0,75 соответственно. Аналогичные результаты получили и для тройной комбинации № 25 15Lys-bis-Nt + Ф-АЦГ + Rib: величина FIC для тройной комбинации (0,87) была больше, чем для комбинаций № 13 15Lys- bis-Nt + Rib и № 19 Ф-АЦГ + Rib (0,75 в обоих случаях). Тем не менее, даже несмотря на то, что FIC двойной комбинации №9 15Lys-bis-Nt + Ф-АЦГ (1) равен или незначительно выше, чем FIC тройных комбинаций №22 15Lys-bis-Nt + Ф-АЦГ + ФМК (1,0) и №25 15Lys-bis-Nt + Ф-АЦГ + Rib (0,87), использование тройных комбинаций может быть предпочтительнее, так как в этом случае снижается вероятность формирования штаммов вируса, резистентных к соединениям, входящим в состав комбинации. Кроме того, концентрации каждого из компонентов, требуемые для достижения сопоставимого противовирусного эффекта, в составе тройной комбинации ниже, чем в составе двойной комбинации, что позволяет снизить суммарную токсичность комбинации соединений. Величины FIC четырех оставшихся тройных комбинаций (№ 23, 24, 26 и 27) ниже или равны величинам FIC соответствующих двойных комбинаций, что указывает на возможность существенного снижения концентраций сочетаемых соединений в составе тройных комбинаций по сравнению с двойными при сохранении уровня противовирусной активности. Иными словами, эффекты, соответствующие ИД50 и ИД95, достигаются при использовании существенно меньших концентраций соединений в составе тройных комбинаций по сравнению с двойными комбинациями. Наиболее выраженный взаимоусиливающий противовирусный эффект получили при использовании тройной комбинации №27 15Lys-bis-Nt + Ф-АЦГ + а-ИФН (FIC = 0,3). FIC двойных комбинаций №9 15Lys-bis-Nt + Ф-АЦГ, № 15 15Lys-bis-Nt + а-ИФН и № 21 Ф-АЦГ + а-ИФН были существенно выше и составили 1, 0,5 и 0,7 соответственно. При этом для достижения эффекта 50% ингибирования развития вирусиндуцированного ЦПЭ 15Lys-bis-Nt следовало использовать в концентрации в 4 раза (комбинация № 9) и 2 раза (комбинация № 15) больше, Ф-АЦГ - в 4 раза (комбинация № 9) и 5 раз (комбинация № 21) больше, а-ИФН - в 4 раза больше (комбинация № 15) и практически в равной концентрации (комбинация № 21), чем в тройной комбинации № 27. Противовирусные взаимоусиливающие эффекты комбинаций № 23, 24 и 26 были выражены в меньшей степени, но также носили синергидный (№ 24) или даже близкий к выраженному синергидному (№ 23 и 26) характер. При этом, как следует из результатов сравнительного анализа табл. 1 и 2, величины FIC соответствующих двойных комбинаций были равны или превышали FIC тройных комбинаций. Существенно, что результаты изучения противовирусной активности рассматриваемых комбинаций, полученные на обеих вирусных моделях, не отличаются существенно, т. е. их эффективность не зависит от активности вирусной ТК и, соответственно, от чувствительности ВПГ к АЦГ. Важно подчеркнуть, что при использовании тройных комбинаций соединений увеличивается возможность коррелировать соотношения сочетаемых компонентов, снижая концентрации более токсичных соединений благодаря повышению концентрации менее токсичных. Поэтому комбинированное использование лекарственных противовирусных препаратов может стать перспективной стратегией для разработки оптимальных схем лечения инфекций, вызываемых ВПГ, включая штаммы вируса, устойчивые к АЦГ.

References

Supplementary files