Molecular epidemiological analysis of the HIV infection in the Blagoveshchensk and Khabarovsk Area (Russian Far East)

Full Text

Вирус иммунодефицита человека 1-го типа (ВИЧ-1) появился в Западно-Центральной Африке в начале ХХ века в результате межвидовой передачи от шимпанзе к человеку [1]. Все многообразие циркулирующих вариантов ВИЧ-1 объединено в три группы - М, N и О. На сегодняшний день самой многочисленной и определяющей эпидемиологическую ситуацию в мире является группа М, которая подразделяется на подтипы A-D, F-H, J-K. Некоторые из них в свою очередь делятся на подгруппы, например A1-A4 и F1-F2. В результате генетической рекомбинации между штаммами разных подтипов возникли циркулирующие рекомбинантные формы (CRF), определяющие до 20% всех случаев ВИЧ-инфекции в мире [2]. В целях слежения за распространением вирусов во всех странах проводится молекулярно-эпидемиологический мониторинг, основанный на генотипировании вируса и предназначенный для определения циркулирующих подтипов и других генетических вариантов ВИЧ-1 [3]. Одна из задач такого мониторинга обусловлена возможными различиями в эффективности молекулярных лабораторных методов по отношению к разным подтипам ВИЧ-1. Большинство диагностических тест-систем, предназначенных для определения вирусной нагрузки, выявления РНК/ДНК ВИЧ-1 и анализа мутаций лекарственной устойчивости (ЛУ), адаптированы для вариантов подтипа В, и в разное время были выявлены случаи недостаточной эффективности таких тест-систем при их использовании для неВ-подтипов [4, 5]. Кроме того, генетические различия между подтипами определяются естественными полиморфизмами, которые у неВ- подтипов часто выявляются в тех же позициях, которые у вариантов подтипа В ассоциированы с устойчивостью к противовирусным лекарственным средствам. Это может усложнить интерпретацию результатов генотипиро- вания ВИЧ-1 и в свою очередь подбор схем терапии, а в конечном счете стать причиной ЛУ [6]. По данным литературы, при инфицировании вариантами разных подтипов ВИЧ-1 наблюдаются разная эффективность гетеросексуальной передачи и скорость прогрессирования заболевания. Так, при инфицировании вариантами вируса подтипа D СПИД в среднем развивается через 6,5 лет от момента заражения, рекомбинантными формами - через 5,6 лет, а вариантами подтипа А - через 8 лет [7]. При гетеросексуальном пути передачи эффективность заражения вариантами подтипа A выше, чем у подтипа D [8]. Наконец, большое разнообразие вариантов ВИЧ-1 является одной из основных проблем при разработке вакцины против ВИЧ. Это касается прежде всего тех стран, где наблюдается высокая гетерогенность вирусной популяции [9]. В РФ начиная с первого случая ВИЧ-инфекции, зафиксированного у российского гражданина в 1987 г., проводится постоянный мониторинг распространения вариантов ВИЧ-1 во многих регионах европейской и некоторых регионах азиатской территорий страны. С момента проникновения варианта ВИЧ-1 подтипа А1, названного впоследствии IDU-A, в 1995 г. в среду потребителей инъекционных наркотиков (ПИН) и их половых партнеров началось стремительное распространение этого варианта вируса по всей России. В начале 2000-х вариант IDU-А вышел за пределы данной группы риска и стал распространяться уже гетеросексуальным путем [10-17]. На сегодняшний день, по нашим оценкам, не менее 90% инфицированных лиц в России заражены вариантом IDU-A. Около 40%, по данным Федерального центра СПИДа, заразились в результате гетеросексуальных контактов [18]. Помимо варианта IDU-A ВИЧ-1 на территории России с низкой частотой встречаются варианты подтипа B среди ПИН, мужчин, имеющих секс с мужчинами (МСМ), и лиц, инфицированных в результате гетеросексуальных контактов, а также рекомбинантная форма CRF03_AB, возникшая в результате рекомбинации вариантов IDU-A и B, циркулирующего среди ПИН на территории стран Восточной Европы [10]. Вне всякого сомнения, в России циркулируют вирусы и других подтипов, но частота встречаемости этих штаммов незначительна, они не попадают в поле зрения исследователей и, очевидно, не играют заметной роли в эпидемическом процессе [19]. За весь период наблюдений на территории России выявлены только две вспышки ВИЧ-инфекции, где доминировали варианты неА-подтипа, а именно рекомбинантная форма CRF03_AB. Первая с числом инфицированных 489 зарегистрирована в Калининградской области в 1998 г. [10], где штамм CRF03_AB и был впервые выделен, вторая (п = 236) - в 2006 г. в Череповце Вологодской области [20]. Подобные штаммы встречались и продолжают встречаться в других регионах России, но все они обнаруживаются спорадически и эпидемиологически связаны с Калининградской областью. Регионы Восточной Сибири и Дальнего Востока были изучены в значительно меньшей степени, чем другие европейские и азиатские регионы России. Особый интерес для молекулярно-эпидемиологического слежения представляют регионы Дальнего Востока России (административные центры - Благовещенск и Хабаровск), имеющие общую границу с Китаем и расположенные близ Японии, где циркулируют варианты ВИЧ-1, отличные от типичных для России. Так, в Китае доминируют варианты подтипов B, B', C и рекомбинантные формы CRF01_AE, CRF07_BC, CRF08_BC, а в Японии - ВИЧ-1 подтипа B и рекомбинантный вариант CRF01_AE [21]. В связи с отдаленностью Благовещенска и Хабаровска от хорошо оснащенных научно-исследовательских центров и сложностью доставки биологического материала изучение вариантов ВИЧ-1, циркулирующих в регионах Дальнего Востока, проводилось лишь эпизодически. Так, в 2004-2005 гг. был проведен генетический анализ образцов из Хабаровского края. Согласно полученным результатам на тот период в регионе доминировал гомогенный вариант ВИЧ-1 IDU-A, однако были выявлены и единичные случаи инфицирования вариантами подтипов B и C [22, 23]. По данным Федерального центра СПИДа, на 22 ноября 2012 г. в Амурской области и Хабаровском крае зарегистрировано 410 и 1996 инфицированных ВИЧ соответственно[18]. Хабаровск расположен на правом берегу реки Амур вблизи границы с Китаем (около 65 км). Через речной порт города осуществляется доставка грузов и пассажиров на север, развиваются морские перевозки судами типа «река-море» с выходом в Тихий океан к берегам Японии, а также пассажирские речные перевозки по реке Амур, в том числе в города соседнего Китая. Благовещенск является единственным административным центром субъекта РФ, находящимся непосредственно на границе с КНР, напротив района Айхуэй китайского городского округа Хэйхэ. Город Благовещенск и городской округ Хэйхэ разделяет река Амур, ширина которой в этой местности около 800 м. Между Благовещенском и Хэйхэ действует безвизовый режим. Географическое положение Благовещенска и Хабаровска, создающее базу для постоянно растущих экономических и культурных связей России с Китаем и Японией, может служить основой и для возможности заражения ВИЧ в результате рискованного поведения как местных жителей, так и временно посещающих эти города людей. Это может в свою очередь привести к проникновению в указанные регионы Дальнего Востока России вариантов ВИЧ-1, которые не регистрировались ранее или выявлялись в единичных случаях. В исследованных регионах, как и по стране в целом, проводится антиретровирусная терапия ВИЧ- инфицированных пациентов, что может сопровождаться возникновением мутации ЛУ ВИЧ-1. Возникая в составе генома случайно, мутации ЛУ закрепляются и эволюционируют под действием лекарственного препарата, приводя к снижению его эффективности. Эти мутации объединяют в две группы - первичные и вторичные. Первичные мутации выявляются обычно на фоне клинической неэффективности какого-либо лекарственного препарата и являются ее причиной. Вторичные мутации, как правило, возникают на фоне уже существующих первичных мутаций ЛУ и могут повышать репликативную способность мутантных (резистентных) вирусов или влиять на чувствительность ВИЧ-1 к лекарственным средствам, дополнительно снижая ее. Резистентные штаммы могут передаваться при разных путях передачи здоровым донорам и некоторое время циркулировать в организме зараженных пациентов. Частоту заражения резистентными штаммами оценивают показателем передающейся, или первичной резистентности. Согласно европейским рекомендациям, если в популяции недавно зараженных пациентов у 10% и более выявляют мутации ЛУ, рекомендовано менять тактику генотипирования и проводить тест на выявление мутаций ЛУ до начала антиретровирусной (АРВ) терапии с целью предотвращения неэффективности лечения [24]. Таким образом, цель настоящей работы - молекулярноэпидемиологическое исследование вариантов ВИЧ-1, циркулирующих на территории Благовещенска и Хабаровска (Дальний Восток России) в настоящее время, включая и анализ мутаций ЛУ. Материалы и методы В работе исследовали 40 образцов плазмы крови от ВИЧ-инфицированных пациентов из Благовещенска и 88 образцов плазмы крови из Хабаровска. Вирусная нагрузка (вн) в образцах составила от 160 до 498 928 копий/мл. Все пациенты были зарегистрированы в региональных центрах СПИДа с диагнозом ВИЧ-инфекции в период 2002-2012 гг. и дали информированное согласие на участие в исследовании. Сбор образцов производили Регионы Подтип Итого А1 В С CRF02_AG ПИН ГС-путь другое* ПИН ГС-путь ПИН ГС-путь ПИН ГС-путь Благовещенск 14 (35,0) 22 (55,0) 1 (2,5) - 1 2,5% - - - 2 (5,0) 40(100) Хабаровск 31 (35,0) 27 (31,0) - 10 (11,5) 1 (1,1) 3 (3,3) 1 (1,1) 15 (17,0) - 88 (100) Итого ... 45 (35,1) 49 (38,2) 1 (0,8) 10 (7,8) 2 (1,6) 3 (2,4) 1 (0,8) 15 (11,7) 2 (1,6) 128 (100) Примечание. * - вертикальный путь передачи. В скобках указан процент. ГС - гетеросексуальный. по мере того, как больные приходили на систематический осмотр. Выявление факторов риска, возможных мест заражения, эпидемиологических связей с другими ВИЧ- инфицированными лицами проводили путем опроса пациентов при сборе эпидемиологического анамнеза. Кроме того, регистрировали возраст, пол пациента, дату забора клинического материала, дату и регион постановки диагноза ВИЧ-инфекция. Сведения о применении/ неприменении пациентом АРВ-препаратов получали, руководствуясь записями в амбулаторных картах. Генотипирование вариантов вируса от ВИЧ- инфицированных пациентов из Благовещенска и Хабаровска проводили путем анализа нуклеотидных последовательностей области гена pol, кодирующей протеазу и часть обратной транскриптазы (1302 п. н.) ВИЧ-1, с использованием набора ViroSeq (версия 2) (ViroSeq HIV-1 Genotyping System, Celera Diagnostics, США). Секвени- рование нуклеотидных последовательностей выполняли с использованием генетического анализатора ABI Prism 3130 (Applied Biosystems, США). Анализ мутаций ЛУ проводили с помощью ViroSeq HIV-1 Genotyping System Software v2.8. Подтипы ВИЧ-1 определяли с использованием референс-программы HIVdbProgram: Sequence Analysis, а также программ REGA HIV-1 Subtyping Tool (версия 2), представленных на сайте Стенфордского университета (http://hivdb.stanford.edu), и COMET HIV-1 (http://comet. retrovirology.lu/). Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей проводили методом ближайших соседей, используя пакет программы MEGA5.0. Результаты и обсуждение При обследовании групп установили, что возраст пациентов из Благовещенска (BLG) варьировал от 21 года до 52 лет, за исключением ребенка семи лет, возраст пациентов из Хабаровска (KHB) - от 20 до 62 лет. Соотношение мужчин и женщин в исследуемых когортах из Благовещенска и Хабаровска составило 2,3:1 и 1:2,3 соответственно. Основным путем заражения в Благовещенске стали гетеросексуальные контакты с ВИЧ-инфицированными лицами (25/40; 62,5%), при употреблении инъекционных наркотиков были инфицированы 14 пациентов (14/40; 35%). 1 ребенок заразился вертикальным путем (1/40; 2,5%). В Хабаровске основным путем передачи оказался инъекционный, среди обследованных пациентов ПИН составили большинство - 59 человек (59/88; 67,0%). Остальные 29 пациентов из анализируемой группы были инфицированы гетеросексуальным путем (29/88; 41,3%) (см. таблицу). На момент забора крови на лечении АРВ-препаратами из анализируемых групп находился 1 пациент из Благовещенска и 9 пациентов из Хабаровска. Результаты молекулярно-эпидемиологического исследования образцов из Благовещенска и Хабаровска представлены в таблице. Как следует из полученных данных, в Благовещенске доминирует вариант вируса подтипа А1 (37/40; 92,5%) с преобладанием гетеросексуального пути передачи (22/40; 55%). В этой же группе риска помимо указанных вариантов выявили вирусы подтипа B у 1 пациента (1/40; 2,5%) и CRF02_AG у 2 (2/40; 5%). Среди ПИН в этом городе обнаружены только варианты вируса подтипа А1 (14/40; 35%). В Хабаровске в целом отметили более высокую гетерогенность популяции циркулирующих вирусов, причем наибольшее разнообразие ВИЧ-1 выявили среди ПИН. В этой группе риска доминирует штамм подтипа A1 (35/88; 35%), но наряду с этими вариантами циркулируют вирусы подтипов B (10/88; 11,5%), CRF02_AG (15/40; 17%) и C (3/88; 3,3%). Среди лиц, заразившихся гетеросексуальным путем, большинство инфицированы вариантом A1 (27/88; 31%); кроме них обнаружили единичные случаи заражения вариантами подтипов B (1/88; 1,1%) и C (1/88; 1,1%). Таким образом, профиль циркулирующих генетических вариантов ВИЧ-1 в Благовещенске в основных группах риска остается таким же, как и в других, ранее исследованных областях РФ, и представлен в основном широко известным вариантом ВИЧ-1 IDU-A. В Хабаровске отметили относительно высокую гетерогенность вариантов ВИЧ-1. Необходимо указать на высокую частоту встречаемости вирусов подтипа B и CRF02_AG среди ПИН, причем последний вариант среди лиц, заразившихся половым путем, в данном исследовании не обнаружили. Весьма интересно, что 9 из 15 пациентов, инфицированных CRF02_AG, заразились за пределами Хабаровского края. При детальном расследовании не выявили эпидемиологических связей между пациентами, инфицированными вирусом данной рекомбинантной формы, при этом даты первого положительного анализа на ВИЧ варьировали от 2001 до 2011 г. Для выявления родства и возможного происхождения вариантов ВИЧ-1, циркулирующих в Благовещенске и Хабаровске, провели филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей области гена pol, кодирующей протеазу и часть обратной транскриптазы, с преимущественным выбором в качестве референс-штаммов последовательностей ВИЧ-1 из Китая и Японии. На рисунке приведено филогенетическое древо для произвольно выбранных образцов вариантов подтипа A1, CRF02_AG, B и всех штаммов подтипа C, выявленных в Благовещенске и Хабаровске. Как видно из рисунка, все последовательности вирусов подтипа А1 из анализированных регионов кластеризовались на одной ветви филогенетического древа вместе с доминирующим в России вариантом IDU-A, что указывает на принадлежность исследуемых последовательностей подтипа A1 к данному варианту. Все варианты CRF02_AG из России кластеризовались между собой и с рекомбинантными штаммами из других регионов мира. Рекомбинант CRF02_AG, выявлен- Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей гена pol, кодирующих протеазу и обратную транскриптазу, образцов из Благовещенска (BLG) и Хабаровска (KHB). VLG, KLG, SML - референс-последовательности вариантов IDU-A ВИЧ-1, циркулирующих на европейской части России. В овалах 1, 2, 3, 4 - результаты анализа. Комментарии в тексте. ный как в Благовещенске, так и в Хабаровске, с высокой частотой встречается на территории бывших союзных республик - в Киргизии, Узбекистане, Казахстане [25]. Так, штамм RU_KHB085 достоверно формировал общую ветвь с образцом из Узбекистана, что может быть свидетельством возможного проникновения образца непосредственно из этого сопредельного России государства (см. рисунок, 1). Кроме того, остальные последовательности с высокой (99%) достоверностью формируют ветвь с общим узлом, что свидетельствует об общности их происхождения (см. рисунок, 2). Все варианты подтипа C объединились на одной ветви древа, включая и референс-штаммы. Лишь один вариант RU KHB061 с высокой достоверностью формирует общую ветвь с китайским образцом HE590921 в пределах очерченной группы (см. рисунок, 3). Это может свидетельствовать о заражении россиянина китайским вариантом С. Все варианты ВИЧ-1 подтипа B формировали общую ветвь с последовательностями варианта ВИЧ-1 подтипа В, циркулирующего среди ПИН на территории стран Восточной Европы (см. рисунок, 4 - пример кластеризации с образцом HQ115066 подтипа В из Украины). Таким образом, версия о проникновении вариантов ВИЧ-1 с территорий Китая и Японии и последующей их циркуляции на Дальнем Востоке России не получила однозначного подтверждения по результатам филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей гена pol. В основном в регионе циркулирует хорошо известный генетический вариант ВИЧ-1 IDU-A, прочие варианты не обнаруживают явного сходства с китайскими и японскими вариантами подтипов С и B, которые образуют независимые ветви на филогенетическом древе. Вероятно, для уточнения происхождения этих вариантов потребуется дополнительный анализ вариантов ВИЧ-1 из Благовещенска и Хабаровска с привлечением анализа других областей генома или полноразмерных геномов. Среди 10 пациентов, получавших лечение, только у 2 выявили первичные мутации ЛУ: у KHB021 (вн 3900 копий/мл) к нуклеозидным и нуклеотидным ингибиторам обратной транскриптазы (НИОТ) и ненуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы (ННИОТ) (мутации M184V, G190C, K101E; лечение по схеме стокрин/ком- бивир); у KHB075 (вн 930 копий/мл) к ННИОТ (мутация K103N; лечение по схеме зиаген/никавир/стокрин). Среди наивных - у 3 пациентов из Благовещенска (3/39, 7,7%) и 3 из Хабаровска (3/79,3,8%) обнаружили первичные мутации ЛУ: у BLG050 (вн 194 копий/мл) к НИОТ (мутация M184V); у BLG049 (вн 3433 копий/ мл) к НИОТ и ННИОТ (мутации M184V и K103N); у BLG039 (вн 13445 копий/мл) к НИОТ (мутация M184V) и ингибиторам протеазы (мутация M46I); у KHB099, KHB109, KHB117 к ННИОТ (мутация K103N). В некоторых образцах обнаружили вторичную мутацию L10I/V, ассоциированную с чувствительностью к ингибиторам протеазы. Отметили высокую частоту встречаемости замены А62У, характерной для вариантов А1 (IDU-A), которая описана ранее как естественный полиморфизм генома ВИЧ-1 [6]. Выводы Благовещенск и Хабаровск, несмотря на географическую близость этих регионов, существенно различаются между собой по разнообразию и частоте встречаемости генетических вариантов ВИЧ. В Благовещенске, как и в целом по России, доминирует вариант вируса подтипа А1, и выявлены лишь единичные случаи инфицирования неА-подтипами. Профиль вариантов ВИЧ-1 в Хабаровске заметно отличается от такового по территории России в целом. Несмотря на преобладание типичной для России генетической формы ВИЧ-1 подтипа А1, на территории широко распространены варианты ВИЧ-1 подтипов B и C, а также рекомбинантной формы CRF02_AG. Результаты предварительного филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей по гену pol показали, что варианты ВИЧ-1 подтипа B в Хабаровске не являются результатом заноса из Китая и/или Японии, но генетически близки к восточноевропейскому варианту вируса подтипа B. Штаммы ВИЧ-1 CRF02_AG из Хабаровска и Благовещенска формируют, как показали результаты филогенетического анализа, общую группу, что свидетельствует об общности их происхождения, вероятно, из среднеазиатских стран. Только в одном случае вариант подтипа С из Хабаровска близок к штаммам из Китая, происхождение других вирусов этого подтипа на исследованной территории требует дополнительного расследования. Результаты данного исследования продемонстрировали, что распространение ВИЧ-1 далеко не всегда определяется только географическим положением регионов и экономическими связями между ними. Так, Амурская область и Хабаровский край граничат между собой и экономически связаны в рамках одного государства, однако профиль циркулирующих на территориях вариантов разительно отличается. То же можно сказать и о тесных контактах между районом Айхуэй китайского городского округа Хэйхэ и Благовещенском. Существование безвизового режима и свободной торговли не привело к распространению китайских вариантов на российской территории. Вероятно, между россиянами и китайцами отсутствуют тесные бытовые отношения, способствующие распространению инфекции. Нельзя исключить того, что среди китайских мигрантов циркулируют варианты ВИЧ-1, типичные для этой страны, но ВИЧ-инфицированные иностранцы не попадают в поле зрения российских инфекционистов, специализирующихся по ВИЧ-инфекции. По нашему мнению, распространение ВИЧ-1 в регионах Дальнего Востока России преимущественно определяется миграционными потоками населения как внутри государства, так и между сопредельными государствами, а также инфраструктурой регионов. Так, через Хабаровск, который является крупным портовым городом для судов река-море, проходят транспортные пути из Азиатско- Тихоокеанского региона, по реке Амур осуществляются пассажирские речные перевозки, в том числе в города соседнего Китая. Постоянная миграция людей в портовом городе, рискованное поведение как местных жителей, так и временно посещающих эти города людей может привести к распространению любой инфекции на территории региона. Следует напомнить о том, что вариант ВИЧ-1 подтипа А1, который впоследствии получил распространение среди ПИН на территории бывшего СССР под названием IDU-A, был занесен из Центральной Африки в крупнейший порт Украины Одессу в 1993 г. [26]. В городе-порте Владивостоке также отмечается большое разнообразие вариантов ВИЧ-1 [27]. Подтверждением распространения вариантов ВИЧ-1 с миграционными потоками может служить и выявление на территории Хабаровска штаммов CRF02_AG, которые, вероятно, были привнесены мигрантами из среднеазиатских республик бывшего СССР, где данный вариант вируса циркулирует с высокой частотой. Миграционные процессы, происходящие на территории бывшего СССР, привели к появлению этих вариантов и в других регионах России [28]. Таким образом, представляет интерес проведение молекулярно-эпидемиологических исследований ВИЧ- инфекции в приграничных и крупных портовых городах России для изучения распространения вариантов ВИЧ-1 и их роли в эпидемическом процессе в этих регионах. Полученные и анализированные нуклеотидные последовательности депонированы в Genbank №°№ KC665916- KC665944, KC509837-509885, KC156532, KC156533, KC208003-208005, KC254581-254615 (http://www.hiv. lanl.gov/components/sequence/HIV/search/search.html).

References

Supplementary files