The antiviral activity of the adamantane derivatives against the influenza virus A (H1N1) pdm09 model in vivo

Full Text

Проблема гриппа - по-прежнему одна из актуальнейших в области науки, что обусловлено высоким уровнем заболеваемости - на долю гриппа и гриппоподобных заболеваний приходится до 90% всех инфекций. Вирусы гриппа активно циркулируют в природе. В настоящее время известен ряд лекарственных препаратов, направленных на подавление репликации вируса гриппа. Это ингибиторы нейраминидазы - озельтамивир (тамифлю) и занамивир (реленза), а также ингибиторы функций канала М2 - ремантадин и амантадин. Для корреспонденции: Гараев Тимур Мансурович, gtim@fmradio.ru Известно, что ремантадин используют с начала 1980-х годов для лечения и профилактики гриппозной инфекции. Биологическая активность ремантадина связана с угнетением функции белка М2 в белковой оболочке вируса гриппа А, который регулирует транспорт протонов через оболочку вируса внутрь вириона [1]. Данные кристаллографических исследований показывают, что белок М2 содержит четыре одинаковые субъединицы, образующие тетрамер, который расположен в мембране вируса. Эти субъединицы частично спирализованы в левозакру 37 ченные а-спирали. Нормальное функционирование канала М2 во многом осуществляется за счет аминокислотных остатков трансмембранной области белка Val(27), Ala(30), Ser(31), Gly(34), His(37) и Trp(41). Эти аминокислотные остатки, структурно находясь внутри канала М2, обеспечивают ионный транспорт и его регуляцию. Присутствие объемного карбоцикла адамантана в белковом канале мембраны вируса приводит к нарушению транспорта протонов за счет возникновения водородной связи между аминогруппой ремантадина и оксигруппой серина в положении 31 в трансмембранном домене [2]. В результате широкого использования адамантановых препаратов в последние десятилетия они утратили свою исходную противогриппозную активность. К настоящему времени выявлено большое количество штаммов, полностью резистентных к амантадину и ремантадину [3]. Эти препараты имеют перекрестную резистентность. Количество резистентных форм гриппа увеличивается с каждым годом по причине спонтанных мутаций в геноме вируса. Это заставляет расширять исследования как по выявлению причин возникновения резистентности, так и по ее преодолению на уровне создания новых противовирусных препаратов. Результаты недавнего анализа последовательности гена М2 вирусов гриппа А показали, что Ser31Asn и Alal30Thr являются наиболее распространенными мутациями, связанными с устойчивостью к амантадину. В случае аминокислотной замены в положении 31 се-рина на аспарагин было исключено образование водородной связи между аминоадамантаном и оксигруп-пой серина, вследствие чего адамантановый остов более не задерживался в поре канала М2, что привело к восстановлению нормального транспорта протонов внутрь вириона [4]. Один из способов восстановления противовирусных свойств соединений адамантана - обеспечение их дополнительными функционально активными группами, которые в процессе взаимодействия с трансмембранным доменом были бы способны нарушать процесс транспорта протонов через мембрану вируса. Источником таких функционально активных групп могут являться аминокислотные остатки, а также ряд других физиологически активных соединений, введенных в адамантановый карбоцикл методами пептидного синтеза [5]. К аминогруппе ремантадина аминокислоты можно присоединять методом смешенных ангидридов, используя для защиты соответствующих аминогрупп трет-бутилоксикарбонильную группу (Boc), а при использовании в качестве карбоцикла адамантанкарбоновых кислот карбоксильную группу аминокислот блокируют сложноэфирной связью. Материалы и методы Синтез соединений При синтезе адамантановых производных использовали рацемический ремантадин (Zhejiang Kangyu Pharmaceutical Co, Китай), L-аминокислоты (Nova Biochem, США). Идентификацию полученных соединений осуществляли с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинах Silufol и Dc-Rieselgel 60 (Merck) в системах: втор-бутанол - 3% аммиак (100:44), метанол-хлороформ (13:60), бутанол-уксусная кислота-вода-пи-ридин (30:3:12:10), позволяющих констатировать полное отсутствие в испытуемых образцах следов ремантадина и 1,3-адамантандиуксусной кислоты, а также посредством масс-спектрометрии. Молекулярную массу устанавливали на MALDI-TOF-времяпролетном масс-спектрометре Bruker UltraFlex II с программным обеспечением для сбора и обработки масс-спектров flexControl 1.1. и flexAnalys 2.2. Удельное оптическое вращение полученных соединений определяли в стандартных условиях на автоматическом поляриметре А1-ЕПЛ (1% раствор в этиловом спирте, длина кюветы 0,5 дм). Образование пептидной связи между карбоциклом, содержащим аминогруппу, и гистидином, защищенным по аминогруппе Вос-группой, а также с остатком липоевой кислоты проводили в одну стадию в условиях реакции смешанных ангидридов в эквимолярном соотношении. Точно так же получили соединение 3. Образование пептидной связи между карбоциклом, содержащим карбоксильные группы, и эфиром серина проводили в одну стадию в условиях реакции смешанных ангидридов. Метиловый эфир серина вносили в двухмолярном избытке по отношению к 1,3-адамантандиуксусной кислоте. Структурные формулы полученных производных адамантана представлены на рисунке. Исследование противовирусной активности соединений в культуре клеток МВСК Испытания проводили в клеточной культуре MDCK с вирусом гриппа A/IIV-Moscow/01/2009(H1N1)pdm09, подобным эталонному варианту А/California/7/2009 (H1N1) swl [10], резистентным к действию ремантадина. Противовирусную активность ремантадина, озельта-мивира и нового соединения изучали на 96-луночных панелях со сформировавшимся монослоем клеток. Одновременно с инфицированием в монослой клеток вносили изучаемое соединение в концентрации 5 и 10 мкг/мл. Панели инкубировали 24 ч при 37°С, затем останавливали реакцию фиксированием клеток 80% ацетоном на фосфатном буфере. Постановку метода клеточного иммуноферментного анализа проводили по методике, описанной ранее [6]. Процент ингибирования вирусной активности соединениями определяли как отношение оптической плотности (ОП)492 опыта минус ОП492 клеточного контроля к ОП492 вирусного контроля минус ОП492 клеточного контроля, умноженное на 100%. Изучение противовирусной активности препаратов на модели гриппозной пневмонии мышей Мыши являются универсальной моделью для исследования специфической активности различных классов лекарственных препаратов и химических соединений в экспериментах. В данном случае использовали белых беспородных мышей - самок массой 14-16 г (п = 100). Лечебно-профилактическую активность соединений в опытах in vivo на модели гриппозной пневмонии мышей изучали согласно описанию [7]. Перед исследованием жи- 3 Структурные формулы синтетических производных адамантана. 1 -- H-His-Rem (гистидил-1-адамантоил-1-этиламин); 2 -- TOA-Rem (1-адамантоил-1-этиламид а-липоевой кислоты); 3 -- Ad-(CH2-Ser-OMe)2 (К,№-дикарбометоксисериновое производное 1,3-адамантандиуксусной кислоты). 38 Таблица 1 Цитотоксическое действие и противовирусная активность синтезированных соединений и коммерческих препаратов в отношении штамма вируса гриппа A(H1N1)pdm09 Таблица 2 Лечебная эффективность синтезированных и коммерческих соединений in vivo на модели гриппозной пневмонии мышей Соединение Противовирусная активность соединений в концентрации 5 мкг/мл, % МПК, мкг/мл H-His-Rem 90 ± 8 2,8 40 TOA-Rem 87 ± 3 4,2 40 Ad-(CH2-Ser-OMe)2 90 ± 7 7,1 80 Ремантадин 7 ± 4 - 40 Озельтамивир 90 ± 4 0,6 100 Примечание. МИК - минимальная ингибирующая концентрация. МПК - максимальная переносимая концентрация. вотных подвергали 3-дневному карантину. Для исследований использовали вирус гриппа A(H1N1)pdm09 [10]. Мышам перорально 1 раз в день в дозе 5 и 10 мг/кг на 1 мышь вводили производные адамантана за 24, 1 ч до и через 24, 48, 72 и 96 ч после инфицирования вирусом. Ремантадин вводили перорально в дозе 10 мг/ кг на 1 мышь за 24, 1 ч до и через 24, 48, 72, 96, 120 ч после инфицирования вирусом 1 раз в день. Тамифлю вводили мышам перорально за 24, 1 ч до и через 24, 48, 72, 96, 120 ч после инфицирования вирусом 2 раза в день. Мышам контрольной группы (п = 10) вводили в тех же условиях плацебо (0,2 мл физиологического раствора). Заражающая доза вируса 10ЛД50, смертность вирусного контроля составила 100%. Заражение мышей вирусом гриппа A(H1N1)pdm09 0,05 мл проводили интраназально под легким эфирным наркозом. За животными наблюдали в течение 15 дней после заражения, учитывая их гибель от гриппозной пневмонии в группах леченых животных и контроле. Активность препаратов ремантадина, тамифлю и синтезированных соединений оценивали, сравнивая летальность у животных, принимавших лечебные субстанции или синтетические соединения, и у мышей контрольной группы. Снижение летальности леченых животных по отношению к таковой в контроле выражали в процентах. Кроме того, учитывали различия в средней продолжительности жизни опытных и контрольных животных. Результаты статистически обрабатывали, определяя достоверность разницы средних величин продолжительности жизни животных по таблице Стъюдента [8]. Результаты и обсуждение Ранее показано [9], что при конструировании молекул во внимание было принято то, что потерю противовирусной активности адамантановых препаратов (ремантадин, амантадин) связывают с аминокислотной заменой в положении 31 трансмембранного домена белка М2 серина на аспарагин, реже на аспарагиновую кислоту. Следовательно, важно было обнаружить новые способы закрепления адамантанового остова в поре канала. В результате проведенных испытаний были подтверждены положительные результаты для ряда соединений адамантана с аминокислотными и другими остатками на модели in vitro, приведенные в табл. 1. Из данных табл. 1 видно, что синтезированные соединения показали высокий процент (около 90) ингибирования репродукции штамма вируса гриппа А, устойчивого к действию ремантадина. Минимальная ингибирующая концентрация для соединений 1, 2 и 3 составила 2,8, 4,2 и 7,1 мкг/мл соответственно. Соединение Доза препарата, мкг/кг в день 10 ЛД50* показатель защиты от смертности, % средняя продолжительность жизни, дни 5 10 8,5 ± 3,1 10 30 9,4 ± 2,0 5 30 9,7 ± 3,5 10 30 10,1 ± 1,9 5 20 9,0 ± 3,7 10 40 10,4 ± 4,6 10 0 6,8 ± 2,5 5 60 11,6 ± 3,7 10 60 12,2 ± 2,8 - 6,7 ± 2,2 H-His-Rem TOA-Rem Ad-(CH2-Ser-OMe)2 Ремантадин Тамифлю Вирусный контроль* Примечание. * - заражающая доза вируса 10ЛД50; смертность вирусного контроля составила 100%. Однако данные, полученные in vivo, более адекватно характеризуют противовирусную активность синтезированных соединений. Раскрываются особенности биологической доступности соединения и токсичности в отношении деятельности организма в целом. Результаты экспериментов по изучению эффективности синтезированных соединений на модели гриппозной пневмонии мышей показали их эффективность, а также достаточно низкую токсичность в организме лабораторных животных. Активность соединений при лечебнопрофилактической схеме введения в дозе 10 мкг/кг в день составила 30, 30 и 40% соответственно (табл. 2). Таким образом, из представленных данных (см. табл. 2) видно, что при лечении мышей исследуемыми соединениями лечебно-профилактическая схема введения препарата приводит к защите от смертности животных, при этом показатель защиты составил 30-40% при дозе препарата 10 мкг/кг в день. Несколько больший (60%) показатель защиты от смертности был при введении препарата тамифлю по такой же схеме. Ремантадин в данных условиях не оказывал защитного действия. Данные по показателям защиты от смертности коррелировали с данными по средней продолжительности жизни животных. Средняя продолжительность жизни животных в группе вирусного контроля составляла 6,7 дня. Использование соединения Ad-(CH2-Ser-OMe)2 позволило увеличить среднюю продолжительность жизни в 1,6 раза соответственно (10,4 дня). Несколько большее (1,8 раза) увеличение продолжительности жизни наблюдали в группе животных, принимавших тамифлю. Учитывая быстро растущую резистентность к препаратам ингибиторам нейраминидазы, а также их высокую стоимость [10], полагаем, что соединения Ad-(CH2-Ser-OMe)2, TOA-Rem и H-His-Rem могут быть предложены в качестве альтернативного терапевтического средства или в составе комплексной терапии для лечения гриппа. Эти соединения малотоксичны и высокоселективно подавляют репродукцию вируса гриппа А, в том числе штаммов, резистентных к действию ремантадина. Предлагаемые в данной работе производные адамантана в качестве предположительной мишени имеют достаточно консервативный белок М2, а не 39 тетрамер нейраминидазы, что может надолго отстрочить появление к ним резистентности. Схема синтеза этих производных адамантана проста и содержит синтетически и экономически доступные соединения, что делает их перспективными соединениями для создания фармацевтического препарата.

References

Supplementary files