Research of suppression of the herpes simplex virus reproduction with drug resistance using a combination 15Lys-bis-Nt with some antiherpetic drugs

Full Text

Модифицированные нуклеозиды ациклогуанозин (АЦГ, ацикловир, зовиракс) и пенцикловир (ПЦВ), а также их метаболические предшественники L-валиновый эфир АЦГ (валтрекс) и фамцикловир (фамвир) являются препаратами первого ряда для лечения инфекций, вызываемых вирусом простого герпеса (ВПГ). Однако у ВПГ к этим препаратам может формироваться лекарственная резистентность. От пациентов с нормальным иммунным статусом штаммы ВПГ, резистентные к АЦГ и/или ПЦВ, изолируются редко. Однако у пациентов со сниженным иммунным статусом развитие лекарственной резистентности может привести к тяжелым клиническим последствиям вплоть до летального исхода [1, 2]. АЦГ и ПЦВ нуждаются в активации вирусспецифиче-ской тимидинкиназой (ТК), катализирующей их превращение в монофосфат. После двух последующих этапов ферментативного фосфорилирования до ди- и трифос-фата соединения этой группы избирательно ингибируют синтез вирусной ДНК по терминационному механизму [3, 4]. Соответственно механизм формирования резистентности к ингибиторам этой группы связан с мутациями по двум генам - гену ТК и pol-гену [4]. В международной практике в случае неэффективности лекарственных препаратов первого ряда используют препараты второго ряда - фосфорномуравьиная кислота (ФМК) и цидофовир (ЦДВ), которые характеризуются Контактная информация: Андронова Валерия Львовна (Andronova Valeriya Lvovna) andronova.vl@yandex.ru 38 высокой противогерпетической активностью и не нуждаются в активации вирусной ТК. Эти препараты в большинстве случаев одинаково эффективно ингибируют репродукцию как чувствительных, так и резистентных к АЦГ и ПЦВ вариантов ВПГ [1, 5, 6]. Однако и ФМК, и ЦДВ высокотоксичны для макроорганизма. Кроме того, описаны мутанты ВПГ, перекрестно резистентные к АЦГ, ПЦВ и ФМК или ЦДВ [7-9]. Сочетанное использование лекарственных препаратов с различным механизмом действия в случае аддитивного или синергидного характера их взаимодействия обеспечивает возможность снижения концентрации комбинируемых соединений по сравнению с концентрацией соединений при их использовании по отдельности. Кроме того, создаются условия для значительного замедления формирования штаммов вирусов, резистентных к действию комбинируемых соединений. Цель настоящего исследования - поиск новых комбинаций соединений, способных эффективно ингибировать репродукцию ВПГ 1-го типа (ВПГ-1), включая штаммы, устойчивые к действию АЦГ. Материалы и методы Препараты. В работе использовали следующие препараты: 15Lys-bis-Nt, синтезированный в Институте молекулярной биологии; а-интерферон (а-ИФН, реаферон-ЕС для инъекций сухой производства ЗАО “Вектор-Медика”, лиофильный препарат а-ИФН со специфической активностью 3 млн МЕ/амп. (пос. Коль-цово Новосибирской обл.); ФМК производства "Sigma Aldrich" (США); АраА (9-р^-аденинарабинозид, ви-даробин) производства “Calbiochem” (США); ЦДВ ^)-1-(3-гидрокси-2-фосфонилметоксипропил)цитозин производства "Sigma Aldrich" (США); глицирризинат аммония однозамещенный (ГЛН, гли-цирам, Glycyram) производства “Хим-фарм ОАО” (Казахстан); рибавирин (1-Р-Э-рибофуранозил-1,2,4-триазол- 3-карбоксамид) производства "ICN Switzerland AG" (Швейцария). Вирусы. ВПГ-1 штамм L2 (ВПГ-1/ L2) получен из Государственной коллекции вирусов НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского. ВПГ-1/Ъ2/АЦГк, резистентный к ациклогуанозину (ИД50 > 100 мкг/мл), получен нами путем серийного пассирования ВПГ-1/Ц и подробно охарактеризован ранее [10]. Цитотоксичность оценивали методом окрашивания клеток трипановым голубым. За величину ЦД50 принимали концентрацию, в присутствии которой погибает 50% клеток при продолжительности инкубации 72 ч [10, 11]. Противовирусную активность соединений и их комбинаций оценивали микрометодом по их способности защищать инфицированные клетки от гибели путем предотвращения развития вирусиндуцированного цитопати-ческого эффекта (ЦПЭ) в соответствии с методом E. De Clercq и соавт. [12], как описано нами ранее [10, 11]. Моно-слойную культуру клеток Vero Е выращенную в пластиковых 96-луночных планшетах ("Linbro, Flow laboratories", UK), инфицировали с множественностью 0,1 БОЕ/клетка; продолжительность инкубации составляла 48 ч при 37°C, при этом в контроле вируса развивался 95-100% ЦПЭ, т.е. ЦПЭ охватывал весь монослой клеток. Эффективность препарата количественно выражали как ИД50 и ИД95 - концентрации соединения, ингибирующие развитие вирусиндуцированного ЦПЭ на 50% и практически полностью. При изучении комбинированного действия эффекта препаратов определяли их концентрацию, в сочетании обеспечивающие эффект, который соответствует ИД50 и ИД95. Антигерпетическое действие комбинаций препаратов оценивали путем вычисления индекса FIC (fractional inhibitory concentration по методу [13]: ИД соединения A в комбинации FIC = ИД50 соединения A ИД50 соединения B в комбинации +-• ИД50 соединения B Результаты и обсуждение Изученные нами сочетания включали соединения, обладающие противогерпетической активностью и не нуждающиеся в активации вирусной ТК. Комбинировали не только традиционные, используемые в настоящее время в клинической практике антигерпетические лекарственные средства (АраА, ФМК, ЦДВ, а-ИФН), но и производное нетропсина - 15Lys-bis-Nt, эффективно ингибирующего репродукцию как чувствительных, так и резистентных к АЦГ штаммов ВПГ-1. Как было показано нами ранее, 15Lys-bis-Nt проявляет противо-герпетическую активность не только в культуре клеток, но и в опытах на лабораторных животных как при системном, так и при местном использовании. Механизм противовирусного действия 15Lys-bis-Nt и родственных Таблица 1 Противогерпетическая активность ряда соединений, а также их комбинаций на модели ВПГ-1/L, в культуре клеток Vero E6 Соединение ЦД50, мкг/мл мкг/мл ИД95, мкг/мл FIC Эффект 15Lys-bis-Nt 176,0 3,9 15,6 - - ФМК > 62,5 31,2 62,5 - - АраА > 62,5 15,6 62,5 - - ЦДВ > 62,5 3,9 15,6 - - ГЛН > 1000 500 > 1000 - а-ИФН* > 1000 250 > 1000 - - 15Lys-bis-Nt + ФМК 100+ 160 1,56 + 5,0 3,12 + 10,0 0,63 Синергидный 15Lys-bis-Nt +АраА 100 + 50 1,12 + 3,12 2,24 + 6,25 0,48 Выраженный синергидный 15Lys-bis-Nt + ЦДВ > 15,6 + 31,25 0,97 + 1,95 1,95 + 3,9 0,75 Синергидный 15Lys-bis-Nt +Rib > 62,5 + 1000 0,97 + 62,5 7,8 + 125 0,75 " 15Lys-bis-Nt + ГЛН > 7,8 + 1000 1,95 + 250 3,9 + 500 1,0 Аддитивный 15Lys-bis-Nt + а-ИФН > 15,6 + 1000 0,97 + 62,5 1,95 + 125 0,50 Синергидный а-ИФН + ФМК > 1000 + 62,5 100 + 5,0 100 + 31,25 0,75 " а-ИФН + АраА > 1000 + 31,2 100 + 7,8 100 + 15,6 0,90 " а-ИФН + ЦДВ > 7,8 + 500 31,25 + 0,48 125 + 1,95 0,25 Выраженный синергидный ФМК + ГЛН > 62,5 + 1000 15,6 + 250 31,25 + 500 1,0 Аддитивный ФМК + ЦДВ > 62,5 + 7,8 7,8 + 0,97 31,25 + 3,9 0,50 Синергидный ЦДВ + АраА > 7,8 + 15,6 1,95 + 7,8 7,8 + 15,6 1,00 Аддитивный ЦДВ + ГЛН > 7,8 + 1000 1,95 + 250 3,9 + 500 1,0 " Примечание. Здесь и в табл. 2, 3: * - концентрация а-ИФН указана в МЕ/мл. 39 Таблица 2 Противогерпетическая активность тройных комбинаций ряда соединений на модели ВПГ-1/Lj в культуре клеток Vero E6 Соединение ЦД50, мкг/мл ИД50, мкг/мл ИД95, мкг/мл FIC Эффект 15Lys-bis-Nt+ а-ИФН + ФМК > 31,2 + 500 + 125 1,95 + 31,25 + 7,8 3,9 + 62,5 + 15,6 0,87 Синергидный 15Lys-bis-Nt + а-ИФН + АраА > 31,25 + 500 + 31,25 0,97+15,6+0,97 3,9 + 62,5 + 3,9 0,37 Выраженный синергидный 15Lys-bis-Nt + а-ИФН +ЦДВ > 3,9 + 31,2 + 3,9 0,48 + 31,2 + 0,48 1,95 + 31,2 + 1,95 0,36 '' " 15Lys-bis-Nt + ФМК +ГЛН > 7,8 + 62,5 + 500 1,95 + 7,8 + 125 7,8 + 31,2 + 500 1,0 Аддитивный 15Lys-bis-Nt + ФМК+ ЦДВ > 3,9 + 62,5 + 3,9 0,48 + 7,8 + 0,48 0,97 + 15,6 + 0,97 0,50 Синергидный 15Lys-bis-Nt +ЦДВ + АраА > 3,9 + 3,9 + 31,2 0,97 + 0,48 + 7,8 0,97 + 0,97 + 7,8 0,87 ' 15Lys-bis-Nt +ЦДВ + ГЛН 62,5 + 31,2 + 500 1,95 + 0,97 + 125 3,9 + 1,95 + 250 1,0 Аддитивный 15Lys-bis-Nt +ЦДВ + Rib >50+15,6+250 1,95+0,97+ 15,6 7,8 + 3,9 + 62,5 0,81 Синергидный 15Lys-bis-Nt + ФМК + АраА > 15,6 + 62,5 + 7,8 1,95 + 7,8 + 0,97 3,9 + 15,6 + 1,95 0,81 ' 15Lys-bis-Nt + ФМК + Rib > 50 + 31,25 + 250 1,95 + 7,8 + 15,6 3,9 + 5,6 + 31,25 0,81 Таблица 3 Противогерпетическая активность ряда соединений и их комбинаций на модели ВПГЛ/Ь^АЦГ® в культуре клеток Vero E6 Соединение ЦД50, мкг/мл ИД50, мкг/мл ИД95, мкг/мл FIC Эффект 15Lys-bis-Nt 176 3,9 15,6 - - ЦДВ > 62,5 3,9 15,6 - - АраА > 62,5 31,25 250 - - ФМК > 62,5 31,25 62,5 - а-ИФН > 1000 250 > 1000 - - 15Lys-bis-Nt + ФМК 100 + 160 1,56 + 5,0 3,12 + 10,0 0,63 Синергидный 15Lys-bis-Nt + ЦДВ > 15,6 + 31,25 0,97 + 1,95 1,95 + 3,9 0,75 ' 15Lys-bis-Nt + а-ИФН > 15,6 + 1000 0,97 + 62,5 1,95 + 125 0,50 ' 15Lys-bis-Nt + АраА 100 + 50 1,12 + 7,8 2,24 + 15,6 0,54 ' 15Lys-bis-Nt + а-ИФН + АраА > 31,25 + 500 + 31,25 0,97 + 15,6 + 1,95 3,9 + 62,5 + 7,8 0,37 Выраженный синергидный 15Lys-bis-Nt + а-ИФН + ЦДВ > 3,9 + 31,2 + 3,9 0,48 + 31,2 + 0,48 1,95 + 31,2 + 1,95 0,36 " " 15Lys-bis-Nt + ФМК+ ЦДВ > 3,9 + 62,5 + 3,9 0,48 + 7,8 + 0,48 0,97 + 15,6 + 0,97 0,50 Синергидный ему соединений состоит в следующем. В зоне инициации транскрипции/репликации вирусной ДНК локализуются АТ-кластеры, фланкированные консервативными нуклеотидными последовательностями BoxI, BoxII и BoxIII, которые являются местами связывания вирус-специфической хеликазы UL9 (Origin Binding Protein -OBP). В результате взаимодействия UL9 с BoxI, BoxII и BoxIII происходят раскрытие АТ-кластера и частичное раскручивание цепи ДНК, благодаря чему инициируется процесс транскрипции/репликации вирусной ДНК. 15Lys-bis-Nt и подобные ему соединения связываются с АТ-последовательностью, препятствуя тем самым процессу ее дестабилизации и последующего флуктуаци-онного раскрытия, т.е. нарушают процесс инициации транскрипции/репликации ДНК. Таким образом, 15Lys-bis-Nt имеет механизм действия, принципиально отличающийся от такового модифицированных нуклеозидов (АЦГ, ПЦВ и др.), нуклеотидов (цидофовир, адефовир) и пирофосфатных аналогов (ФМК, фосфорноуксусная кислота). Опираясь на огромный опыт, накопленный современной вирусологией в области комбинированной химиотерапии вирусных инфекций, можно было предположить, что комбинации 15Lys-bis-Nt с различными традиционными лекарственными препаратами могут представлять интерес для практической медицины. Как видно из данных, приведенных в табл. 1, при использовании 15Lys-bis-Nt в составе двойных комбинаций с а-ИФН, АраА, ФМК или ЦДВ обеспечивается достоверный синергидный характер взаимодействия: величина FIC, характеризующая степень взаимоусиливающего эффекта этих соединений, находилась в диапазоне от 0,48 до 0,75, что указывает на возможность использования этих соединений в комбинациях в концентрации менее У ИД50. Комбинация 15Lys-bis-Nt+EHH проявляет аддитивный характер взаимодействия, т.е. при сочетанном использовании этих соединений в концентрации, равной У ИД50, будет обеспечиваться эффект 50% ингибирования развития вирусного ЦПЭ (ИД50). При оценке эффекта тройных комбинаций 15Lys-bis-Nt+ а-ИФн+АраА и l5Lys-bis-Nt+ а-ИФн+ЦДВ наблюдали усиление выраженности взаимоусиливающего эффекта комбинации. Так, при использовании комбинации 15Lys-bis-Nt+АраА величина FIC составила 0,48 (см. табл. 1), а при введении в эту комбинацию а-ИФН она снизилась до 0,37 (табл. 2). При введении а-ИФН в комбинацию 15Lys-bis-Nt+ЦДВ величина FIC снижается с 0,75 до 0,36 (см. табл. 1, 2 соответственно). При этом становится возможным существенно снизить концентрацию комбинируемых соединений при сохранении противовирусной активности комбинации по сравнению с отдельно взятыми соединениями. Так, эффект 50% ингибирования развития вирусиндуцированного ЦПЭ (величина ИД) достигается при использовании 15Lys-bis-Nt+ а-ИфН+АраА в концентрации, равной 1/4, 1/16 и 1/16 ИД50 каждого из соединений соответственно, а при использовании комбинации 15Lys-bis-Nt+а-ИФН+ЦДВ - в концентрации, равной 1/8, 1/8 и 1/8 ИД Введение а-ИФН в комбинацию 15Lys-bis-Nt+ФМК, наоборот, приводит к потенцированию противовирусного действия и, следовательно, к увеличению величины индекса FIC с 0,66 до 0,87. Соответствующие данные приведены в табл. 1 и 2. Аналогичный результат получен при изучении сочетанного эффекта комбинаций 15Lys-bis-Nt+ФМК+ГЛН и 15Lys-bis-Nt+ЦДВ+ГЛН. Индекс FIC в обоих случаях составлял 1 (аддитивный эффект; см. табл. 2). Комбинированный эффект двойных комбинаций 15Lys-bis-Nt+ГЛН, ЦДВ+ГЛН и ФМК+ГЛН характеризуется той 40 же величиной FIC (см. табл. 1). Однако эффект комбинаций 15Lys-bis-Nt+ФМК и 15Lys-bis-Nt+ЦДв соответствует синергидному эффекту (FIC 0,63 и 0,75 соответственно; см. табл. 1). При изучении сочетанного эффекта 15Lys-bis-Nt+ФМК+ЦДВ установили синергидный эффект взаимодействия этих соединений (FIC+0,5; см. табл. 2). Синер-гидный характер взаимодействия двойных комбинаций 15Lys-bis-Nt+фМк и 15Lys-bis-Nt+ЦдВ выражен в меньшей степени (FIC 0,63 и 0,75 соответственно; см. табл. 1). Взаимоусиливающий комбинированный эффект сочетания ЦДВ+ФМК выражен в той же степени, что и эффект тройной комбинации 15Lys-bis-Nt+ФМК+ЦдВ (FIC 0,5). При комбинированном использовании 15Lys-bis-Nt+ФМК+АраА выраженность синергидного эффекта (FIC 0,81) ниже, чем при использовании двойных комбинаций 15Lys-bis-Nt+ФМК (FIC 0,63) и 15Lys-bis-Nt+АраА (FIC 0,48). При использовании комбинации 15Lys-bis-Nt + ЦДВ + АраА величина FIC (0,87) также оказалась ниже, чем для двойных комбинаций 15Lys-bis-Nt+ЦДВ (FIC 0,75) и 15Lys-bis-Nt+АраА (FIC 0,48). Следовательно, тройные комбинации 15Lys-bis-Nt+ ФМК+а-ИФН, 15Lys-bis-Nt+ФМК+ГЛН, 15Lys-bis-Nt + ФМК+ЦДВ, 15Lys-bis-Nt+ФМК+АрaА и 15Lys-bis-Nt + ЦДВ+АраА не имеют преимуществ перед соответствующими двойными комбинациями. Однако при использовании многокомпонентных сочетаний можно не только снизить концентрацию высокотоксичных соединений, но и существенно уменьшить вероятность или даже предотвратить возможность формирования штаммов вируса с лекарственной резистентностью к одному или нескольким компонентам комбинации. Противогерпетическая активность комбинации соединений, взаимоусиливающий эффект которых был наиболее выражен, изучена на модели ВПГ-1^2/АЦГ®, глубоко резистентного к АЦГ (ИД50 >100 мкг/мл) (табл. 3) , что значительно превышает величину ИД для эталонного штамма ВПГ-1/Lj (0,4 мкг/мл) (см. табл. 3). В гене ТК ВПГ-1^2/АЦГ® картированы мутации, приводящие к синтезу фермента, не способного фосфорилировать тимидин, АЦГ и родственные ему соединения. Как и следовало ожидать, все исследованные комбинации соединений одинаково эффективно ингибировали развитие вирусиндуцированного ЦПЭ в клеточных культурах, инфицированных как эталонным штаммом ВПГ-1, так и АЦГ-резистентным штаммом вируса.

References

Supplementary files